Aislamiento y enriquecimiento de células progenitoras epiteliales pulmonares humanas para cultivo de organoides

Resumen

Este artículo proporciona una metodología detallada para los enfoques de disociación tisular y fraccionamiento celular que permiten el enriquecimiento de células epiteliales viables de las regiones proximal y distal del pulmón humano. En este caso, estos enfoques se aplican para el análisis funcional de células progenitoras epiteliales pulmonares mediante el uso de modelos de cultivo de organoides 3D.

Resumen

Los modelos organoides epiteliales sirven como herramientas valiosas para estudiar la biología básica de un sistema de órganos y para el modelado de enfermedades. Cuando se cultivan como organoides, las células progenitoras epiteliales pueden autorrenovarse y generar una progenie diferenciadora que exhibe funciones celulares similares a las de sus contrapartes in vivo . A continuación describimos un protocolo paso a paso para aislar progenitores específicos de la región del pulmón humano y generar cultivos organoides 3D como herramienta experimental y de validación. Definimos las regiones proximales y distales del pulmón con el objetivo de aislar las células progenitoras específicas de la región. Utilizamos una combinación de disociación enzimática y mecánica para aislar las células totales del pulmón y la tráquea. Las células progenitoras específicas se fraccionaron de las células de origen proximal o distal utilizando la clasificación celular asociada a la fluorescencia (FACS) basada en marcadores de superficie específicos del tipo celular, como NGFR para clasificar las células basales y HTII-280 para clasificar las células alveolares tipo II. Se utilizaron progenitores basales o alveolares aislados de tipo II para generar cultivos organoides 3D. Tanto los progenitores distales como los proximales formaron organoides con una eficiencia de formación de colonias del 9-13% en la región distal y del 7-10% en la región proximal cuando se chapan 5000 células / pozo en el día 30. Los organoides distales mantuvieron las células alveolares tipo II HTII-280⁺ en cultivo, mientras que los organoides proximales se diferenciaron en células ciliadas y secretoras para el día 30. Estos cultivos organoides 3D se pueden utilizar como una herramienta experimental para estudiar la biología celular del epitelio pulmonar y las interacciones mesenquimales epiteliales, así como para el desarrollo y validación de estrategias terapéuticas dirigidas a la disfunción epitelial en una enfermedad.

Introducción

Los espacios aéreos del sistema respiratorio humano se pueden dividir ampliamente en zonas conductoras y respiratorias que median el transporte de gases y su posterior intercambio a través de la barrera epitelial-microvascular, respectivamente. Las vías respiratorias conductoras incluyen tráquea, bronquios, bronquiolos y bronquiolos terminales, mientras que los espacios de aire respiratorio incluyen bronquiolos respiratorios, conductos alveolares y alvéolos. El revestimiento epitelial de estos espacios aéreos cambia de composición a lo largo del eje proximo-distal para adaptarse a los requisitos únicos de cada zona funcionalmente distinta. El epitelio pseudoestratificado de las vías respiratorias traqueobronquiales está compuesto por tres tipos principales de células, basales, secretoras y ciliadas, además de los tipos celulares menos abundantes, incluidos el cepillo, el neuroendocrino y el ionocito ^1,2,3. Las vías respiratorias bronquiolares albergan tipos de células epiteliales morfológicamente similares, aunque hay distinciones en su abundancia y propiedades funcionales. Por ejemplo, las células basales son menos abundantes dentro de las vías respiratorias bronquiolares, y las células secretoras incluyen una mayor proporción de células club frente a las células serosas y caliciformes que predominan en las vías respiratorias traqueobronquiales.  Las células epiteliales de la zona respiratoria incluyen un tipo de célula cuboidal mal definida en los bronquiolos respiratorios, además de las células alveolares tipo I (ATI) y tipo II (ATII) de los conductos alveolares y alvéolos ^1,4.

La identidad de los tipos de células madre epiteliales y progenitoras que contribuyen al mantenimiento y renovación de los epitelios en cada zona se describe de forma incompleta y se infiere en gran medida de los estudios en modelos animales 5,6,7,8. Los estudios en ratones han demostrado que las células basales de las vías respiratorias pseudoestratificadas, o las células club de las vías respiratorias bronquiolares o las células ATII del epitelio alveolar, sirven como células madre epiteliales basadas en la capacidad de autorrenovación ilimitada y diferenciación multipotente 7,9,10,11,12 . A pesar de la incapacidad de realizar estudios de rastreo de linaje genético para evaluar el tallo de los tipos de células epiteliales pulmonares humanas, la disponibilidad de modelos de cultivo basados en organoides para evaluar el potencial funcional de las células madre y progenitoras epiteliales proporciona una herramienta para estudios comparativos entre ratones y humanos 13,14,15,16,17.

Describimos métodos para el aislamiento de tipos de células epiteliales de diferentes regiones del pulmón humano y su cultivo utilizando un sistema organoide 3D para recapitular los tipos de células regionales. Se han desarrollado métodos similares para el análisis funcional y el modelado de enfermedades de células epiteliales de otros sistemas de órganos 18,19,20,21. Estos métodos proporcionan una plataforma para la identificación de células progenitoras epiteliales regionales, para realizar estudios mecanicistas que investiguen su regulación y microambiente, y para permitir el modelado de enfermedades y el descubrimiento de fármacos. Aunque los estudios de células progenitoras epiteliales pulmonares realizados en modelos animales pueden beneficiarse del análisis, ya sea in vivo o in vitro, los conocimientos sobre la identidad de las células progenitoras epiteliales pulmonares humanas han dependido en gran medida de la extrapolación de organismos modelo. Como tal, estos métodos proporcionan un puente para relacionar la identidad y el comportamiento de los tipos de células epiteliales pulmonares humanas con sus estudios que investigan la regulación de las células madre / progenitoras.

Protocolo

El tejido pulmonar humano se obtuvo de donantes de tejido fallecidos de conformidad con los procedimientos de consentimiento desarrollados por el Instituto Internacional para el Avance de la Medicina (IIAM) y aprobados por la Junta de Revisión Interna del Centro Médico Cedars-Sinai.

1. Procesamiento de tejidos para el aislamiento de células pulmonares de regiones traqueobronquiales o pequeñas de las vías respiratorias/parénquimas (vías respiratorias pequeñas y alvéolos)

1. Preparar y autoclave todos los instrumentos de disección, cristalería y las soluciones adecuadas un día antes del aislamiento celular.
2. Al recibir tejido pulmonar, identificar y separar las regiones proximal y distal. La tráquea y los bronquios se consideran "proximales". A los efectos de este protocolo, la tráquea y las primeras 2-3 generaciones de bronquios se diseccionan y se utilizan para el aislamiento del epitelio de las vías respiratorias "proximales". Las vías respiratorias pequeñas de 2 mm o menos de diámetro y el tejido parenquimatoso circundante se consideran, a los efectos de este protocolo, como epitelio pulmonar "distal" (Figura 1A).
   NOTA: Todos los procedimientos que impliquen el procesamiento de tejido pulmonar humano deben realizarse en un gabinete de bioseguridad con el uso de equipo de protección personal adecuado.

2. Enriquecimiento y subestablecimiento de pequeñas células progenitoras epiteliales de las vías respiratorias y alveolares a partir del tejido pulmonar distal

1. Preparación del tejido distal
   1. Coloque el tejido pulmonar distal en una placa de Petri estéril (150 x 15 mm). Cortar el tejido en dados en aproximadamente 1 cm³ piezas y colocar en un tubo limpio de 50 ml.
   2. Lave el tejido 3 veces con HBSS refrigerado, desechando el lavado de HBSS cada vez para eliminar la sangre y el líquido del revestimiento epitelial.
   3. Coloque el tejido en una nueva placa de Petri y seque con toallitas anti pelusa estériles. Usando fórceps y tijeras, retire la mayor cantidad de pleura visceral (una delicada membrana transparente que cubre la superficie del pulmón) como sea posible.
   4. Use tijeras para picar el tejido en trozos de aproximadamente 2 mm de diámetro. Transfiera el tejido picado a una placa de Petri limpia y pice aún más cortándolo a un tamaño aproximado de 1 mm con una cuchilla de afeitar estéril de un solo lado.
2. Digestión enzimática
   NOTA: La solución madre de Liberase es de 5 mg/ml (100x) y la cepa de DNasa es de 2,5 mg/ml (100x) (Tabla de materiales).
   1. Añadir 50 μg/mL liberasa y 25 μg/ml de DNasa en HBSS estéril en un tubo cónico de 50 ml.
   2. Transfiera aproximadamente 2-3 g de tejido picado a un nuevo tubo cónico de 50 ml con 25 ml de HBSS, que contenga Liberase y DNasa. Incubar durante 40-60 min a 37 °C con agitación continua utilizando un mezclador a 900 rpm. Después de 30 min de incubación, triturar el tejido digerido usando una jeringa de 30 mL sin aguja para evitar la formación de grumos y continuar con la incubación.
      NOTA: El tiempo de incubación con las enzimas puede variar dependiendo del tipo o condición del tejido. Por ejemplo, la digestión enzimática del tejido normal tarda aproximadamente 45 minutos. Sin embargo, el tejido fibrótico de muestras de fibrosis pulmonar idiopática puede requerir un tiempo de incubación más largo de hasta 60 min. Por lo tanto, controle el tejido cuidadosamente durante este paso para evitar daños en los marcadores de superficie, lo cual es crucial para FACS.
3. Aislamiento de una sola célula
   1. Triture el tejido mediante la extracción 5x a través de una aguja de 16 G colocada en una jeringa de 30 ml. Extraiga la suspensión de tejido en una pipeta de diámetro ancho y pase a través de una serie de coladores celulares (500 μm, 300 μm, 100 μm, 70 μm, 40 μm) bajo presión de vacío. Lave el colador con 20 ml de tampón HBSS+ para recoger las células restantes. La receta para el búfer HBSS+ se puede encontrar en la Tabla de materiales.
   2. Agregue un volumen igual de tampón HBSS +, después de 45 minutos al filtrado para inhibir la actividad de Liberase y evitar la sobredigestión.
   3. Filtra la centrífuga a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Retire y deseche cuidadosamente el sobrenadante. Agregue 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC) al pellet, balancee suavemente el tubo para desalojar el gránulo e incube en hielo durante 1 min.
      NOTA: La cantidad y el tiempo en la solución de lisis de glóbulos rojos depende del tamaño del pellet. Es importante mantener las células en hielo y controlar cuidadosamente el tiempo en la solución de lisis de glóbulos rojos para prevenir la lisis de las células diana. Si la lisis de los glóbulos rojos es insuficiente, repita el paso.
   4. Agregue 10-20 ml de tampón HBSS+ para neutralizar el tampón de lisis de RBC. Filtra la centrífuga a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
   5. Si los glóbulos rojos lisados (células fantasma) forman una capa turbia sobre el gránulo celular, resuspenda el gránulo en 10 ml de tampón HBSS + y cuele la suspensión a través del colador de células de 70 μm para eliminar las células fantasma. Centrifugar el filtrado a 500 x g durante 5 min a 4 °C y continuar con los pasos posteriores.
4. Agotamiento de las células inmunes y las células endoteliales (paso opcional)
   1. Agotar las células endoteliales CD31⁺ y las células inmunes CD45⁺ del grupo de células totales utilizando las microperlas CD31 y CD45 conjugadas con anticuerpos monoclonales antihumanos CD31 y CD45 (isotipo de ratón IgG1) y columnas LS de acuerdo con el protocolo del fabricante (Tabla de Materiales).
   2. Recoger el flujo a través, que consiste principalmente en células epiteliales y estromales, en un tubo estéril fresco y centrifugarlo a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Realice un recuento de celdas para determinar el número total de células en el flujo a través.
5. Tinción de la superficie celular para la clasificación celular asociada a la fluorescencia (FACS)
   1. Resuspend 1 x 10⁷ celdas por 1 ml de tampón HBSS+. Añadir anticuerpos primarios a la concentración requerida e incubar las células durante 30 min a 4 °C en la oscuridad. En este estudio, se utilizaron anticuerpos primarios conjugados con fluoróforos a menos que se indique lo contrario. Los detalles de las fuentes de anticuerpos y los títulos se describen en la Tabla de materiales.
      NOTA: HTII-280 es actualmente el mejor anticuerpo reactivo de superficie que permite la subconfiguración de células pulmonares distales en fracciones celulares predominantemente de vías respiratorias (HTII-280^-) y alveolares tipo 2 (HTII-280⁺). Una advertencia a esta estrategia es que las células AT1 no se tiñen utilizando este método y están mal representadas debido a su fragilidad. Sin embargo, las células AT1 están mal representadas en las preparaciones pulmonares distales, presumiblemente debido a su fragilidad y pérdida durante la selección de células viables por FACS y, por lo tanto, solo representan un contaminante raro de la fracción celular de las vías respiratorias.
   2. Lave las células añadiendo 3 ml de tampón HBSS+ y centrífuga a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
   3. Si usa anticuerpos primarios no conjugados, agregue la concentración requerida de un anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo apropiado e incube durante 30 minutos en hielo. Lave el exceso de anticuerpos secundarios agregando 3 ml de tampón HBSS+ y centrífuga a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
   4. Deseche las células sobrenadantes y resuspend en tampón HBSS+ por 1 x 10⁷ células/ml. Filtre las células en tubos de poliestireno de 5 ml a través de una tapa de filtro para garantizar la formación de una suspensión de una sola célula. Añadir DAPI (1 μg/ml) para teñir las células permeables (muertas).
      NOTA: Es esencial usar controles apropiados de un solo color y fluorescencia menos uno (FMO) (es decir, cóctel de tinción de anticuerpos menos un anticuerpo cada uno), para minimizar los falsos positivos durante FACS. En este estudio, se utilizaron perlas de selección positivas y negativas para la compensación empírica de la superposición de espectros de emisión entre fluoróforos (Tabla de Materiales). FACS enriquece los tipos de células de interés. Las células epiteliales viables se enriquecen en función de su fenotipo de superficie celular CD45 negativo, CD31 negativo, CD236 positivo y tinción negativa para DAPI. Esta fracción de células epiteliales se puede subconfigurar aún más en función de la tinción para marcadores de superficie específicos del tipo de célula, como la tinción específica para células HTII-280 positivas que están enriquecidas para células AT2. Por el contrario, la selección negativa para HTII-280 permite el enriquecimiento de pequeñas células epiteliales de las vías respiratorias como las células club y ciliadas (Figura 2).

3. Enriquecimiento y subestablecimiento de células progenitoras epiteliales de las vías respiratorias traqueobronquiales

1. Preparación de tejidos
   1. Diseccionar las vías respiratorias proximales (tráquea/bronquios) de los pulmones. Abra las vías respiratorias a lo largo de su longitud usando tijeras para exponer la luz y agregue 50 μg / ml de Liberase para cubrir completamente el tejido.
   2. Incubar durante 20 min a 37 °C con agitación continua utilizando un termomejorador a 900 rpm.
   3. Retire la vía aérea proximal del tubo de la centrífuga y colóquela en una placa de Petri estéril (150 x 15 mm). Raspe suavemente la superficie de las vías respiratorias con un bisturí para eliminar completamente las células epiteliales luminales del tejido.
   4. Lave la placa de Petri con 5 ml de tampón HBSS+ estéril para recoger todas las células epiteliales luminales desprendidas y transferir las células desalojadas a un tubo de centrífuga cónica de 50 ml. Triture la suspensión extrayendo una aguja de 5x a 16 G y una aguja de 18 G instalada en una jeringa de 10 ml para obtener una suspensión de una sola célula.
   5. Centrifugar la suspensión a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Vuelva a suspender el pellet en un tampón HBSS + fresco y almacene estas células luminales de las vías respiratorias en hielo, listas para combinarse con la suspensión de una sola célula generada a partir de las vías respiratorias proximales picadas en los próximos pasos.
   6. Usando tijeras, corte el tejido traqueobronquial restante a lo largo de sus anillos para generar pequeñas tiras de tejido y transfiera las tiras a una placa de Petri fresca. Picar las tiras de tejido con una hoja de afeitar de un solo lado para hacer piezas más pequeñas.
      NOTA: Dado que las vías respiratorias proximales son cartilaginosas, no se pueden picar tan finamente como el tejido pulmonar distal.
   7. Transfiera el tejido picado a los tubos C, agregue 2 ml de Liberase al tubo asegurándose de que el tejido esté sumergido. Cargue el tubo C en el disociador automatizado y ejecute el Protocolo pulmonar humano-2 para disociar mecánicamente el tejido aún más.
      NOTA: El disociador utilizado en este protocolo ofrece un programa optimizado llamado protocolo pulmonar humano-2 para esta aplicación específica (ver Tabla de Materiales).
2. Digestión enzimática y aislamiento unicelular
   1. Transfiera aproximadamente 2 g de tejido proximal picado del tubo C a cada tubo centrífugo cónico de 50 ml y agregue 50 μg/ml de Liberase y 25 μg/ml de solución de DNasa a cada tubo.
      NOTA: Para garantizar una disociación eficiente, los tubos no deben llenarse más allá de la marca de 30 ml.
   2. Incubar el tejido picado durante 45 min a 37 °C con agitación continua utilizando un mezclador a 900 rpm.
   3. Pase la suspensión de tejido disociado a través de una serie de coladores celulares (500 μm, 300 μm, 100 μm, 70 μm, 40 μm) bajo presión de vacío como se mencionó anteriormente y recoja el flujo a través. Lave el colador con 20 ml de tampón HBSS+ para recoger las células restantes.
      NOTA: Dado que el tejido proximal es cartilaginoso y voluminoso en comparación con el tejido distal, existe una mayor posibilidad de obstrucción de los filtros. El uso de un embudo puede ayudar a prevenir el desbordamiento del líquido al pasar a través de los coladores.
   4. Agregue un volumen igual de tampón HBSS+ al filtrado para inhibir la actividad de Liberase y evitar la sobredigestión. Agregue las células aisladas de las vías respiratorias proximales luminales de 3.1.5 a la suspensión celular en este paso.
   5. Centrifugar la suspensión de celda combinada a 500 x g durante 10 min. Retire el sobrenadante y repita el lavado celular en el tampón HBSS+. Realizar el agotamiento de las células inmunes CD45⁺ y las células endoteliales CD31⁺ como se mencionó anteriormente en 2.4 (paso opcional).
   6. Los métodos para la tinción son similares al tejido pulmonar distal, siga los pasos en 2.5. Enriquezca las células epiteliales viables en función de su fenotipo de superficie celular CD45 negativo, CD31 negativo, CD236 positivo y tinción negativa para DAPI.
   7. Subconjunto adicional de la fracción de células epiteliales basada en la tinción para marcadores de superficie específicos del tipo celular, como NGFR, lo que permite el enriquecimiento de tipos de células basales (NGFR positivas) y no basales (NGFR negativas; secretoras, ciliadas, neuroendocrinas) (Figura 3).

4. Cultivo de organoides

1. Agregue 5,000 (este número se puede ajustar para producir la densidad deseada de organoides epiteliales) células epiximales o distales clasificadas a un tubo estéril de 1.5 ml junto con 7.5 x 10⁴ células MRC-5 (línea celular de fibroblastos pulmonares humanos). Las interacciones epitelial-mesenquimal son críticas para la expansión de las células progenitoras.
2. Centrifugadora a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
   NOTA: Es importante confirmar manualmente el recuento de células obtenidas del clasificador para garantizar la precisión de la eficiencia de formación de colonias organoides.
3. Retire y deseche cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda el gránulo celular en 50 μL de medios helados suplementados con antibióticos. Mantenga la suspensión celular sobre hielo.
4. Agregue 50 μL de medio de matriz de membrana basal agotado con factor de crecimiento helado 1x al vial y pipetee suavemente la suspensión sobre hielo para mezclar.
   NOTA: Es importante utilizar medios helados y mantener las células en hielo para evitar la polimerización prematura del medio de la matriz de membrana basal.
5. Transfiera la suspensión celular a un inserto de cultivo celular de tamaño de poro de 0,4 μm en una placa de 24 pocillos (1,4 x 10⁴ células/cm²), teniendo cuidado de evitar la introducción de burbujas de aire.
6. Incubar a 37 °C durante 30-45 min para permitir que la matriz se solidifique.
7. Agregue 600 μL de medio de crecimiento precalentado al pozo.
   NOTA: Media se suplementó con agentes antimicóticos (0,4%) y estreptococo de pluma (1%) durante las primeras 24 h después de la siembra y 10 μM de inhibidor de la Rho quinasa durante las primeras 72 h.
8. Cultivo a 37 °C en una incubadora de CO_{2 al} 5% durante 30 días, tiempo durante el cual se deben cambiar los medios cada 48 h.
   NOTA: La duración del cultivo se puede modificar en función del propósito del experimento. Los puntos finales más largos se utilizan para estudiar la diferenciación, mientras que los puntos finales más cortos de 7 días, 14 días, etc., se pueden usar si el propósito del experimento no es lograr una diferenciación completa.
9. Añadir un inhibidor de TGFβ de 10 μM al medio de cultivo durante 15 días para mantener las células en la fase proliferativa y suprimir el crecimiento excesivo de fibroblastos.
   NOTA: Los resultados difieren según el medio de cultivo utilizado para el ensayo. Por ejemplo, los resultados mostrados en este documento se generaron utilizando Pneumacult-ALI Medium, lo que resulta en la generación de organoides grandes a partir del pulmón distal, organoides bien diferenciados y más grandes del pulmón proximal.

5. Tinción organoidea

1. Fijación e incrustación de organoides
   1. Aspire los medios de las cámaras de inserción transmembrana superior e inferior y enjuague una vez con PBS caliente.
   2. Fije los cultivos colocando 300 μL de PFA (2% p/v) en el inserto y 500 μL en el pozo durante 1 hora a 37 °C. Retire el fijador y enjuague con PBS caliente teniendo cuidado de no desalojar el tapón de la matriz de membrana basememt.
      NOTA: Los organoides fijos se pueden almacenar sumergidos en PBS a 4 °C durante una o dos semanas antes de iniciar nuevos pasos.
   3. Aspire PBS, invierta el inserto y corte cuidadosamente la membrana del inserto alrededor de su periferia. Usando fórceps, retire la membrana transwell, teniendo cuidado de no molestar el tapón de la matriz.
   4. En una placa de Petri, toque el inserto para recuperar el tapón de matriz.
   5. Agregue una gota de gel de procesamiento de muestras como Histogel (mantenido a 37 ° C) al tapón de la matriz y manténgalo a 4 ° C hasta que el gel se solidifique.
   6. Transfiera el tapón a un cassette de incrustación, deshidrate a través del aumento de las concentraciones de etanol (70, 90 y 100%), claro en xileno e incruste en cera de parafina.
   7. Cortar secciones de 7 μm en un microtomo y recoger en portaobjetos cargados positivamente.
2. Tinción por inmunofluorescencia de organoides
   1. Coloque los toboganes a 65 °C durante 30 minutos hasta el desparafinado.
   2. Desparafinar las secciones por inmersión en xileno y rehidratar a través de concentraciones decrecientes de etanol.
   3. Realice la recuperación de antígenos a alta temperatura en una solución de desenmascaramiento de antígenos, base de ácido cítrico utilizando un recuperador disponible comercialmente sumergiendo portaobjetos en la solución durante 15 min (Tabla de materiales).
   4. Rodear el tejido con una barrera hidrofóbica usando una pluma de Papanicolaou.
   5. Bloquear la tinción inespecífica entre los anticuerpos primarios y el tejido, incubando en el tampón de bloqueo.
   6. Incubar secciones en la concentración adecuada de anticuerpos primarios diluidos en solución de incubación durante la noche a 4 °C en una cámara humidificada.
   7. Enjuague las secciones 3x a temperatura ambiente con un tampón de lavado.
   8. Incubar en la concentración adecuada de anticuerpo secundario conjugado fluorocromo durante 1 h a temperatura ambiente.
   9. Enjuague las secciones 3x a temperatura ambiente con Tween 20-TBS al 0,1%. Incube las secciones durante 5 min en DAPI (1 μg/mL). Enjuague las secciones una vez en TBS (solución salina tamponada Tris) con Tween 20 al 0,1%, seque y monte en una solución de montaje (Figura 4 y Figura 5).
      NOTA: La fuente y la dilución óptima de trabajo de los anticuerpos primarios y secundarios utilizados para la tinción por inmunofluorescencia se incluyen en la Tabla de Materiales.

Resultados

Fuente de tejido pulmonar
La tráquea y el bronquio extrapulmonar (Figura 1A) se utilizaron como tejido fuente para el aislamiento de las células epiteliales de las vías respiratorias proximales y la posterior generación de organoides proximales. Se utilizó tejido pulmonar distal que incluye tanto parénquima como vías respiratorias pequeñas de menos de 2 mm de diámetro (Figura 1A) para el aislamiento de células epiteliales alveolares...

Discusión

Describimos un método confiable para el aislamiento de subpoblaciones definidas de células pulmonares del tejido pulmonar humano para análisis molecular o funcional y modelado de enfermedades. Los elementos críticos de los métodos incluyen la capacidad de lograr la disociación tisular con la preservación de epítopos superficiales, que permiten el enriquecimiento mediado por anticuerpos de células recién aisladas, y la optimización de los métodos de cultivo para la generación eficiente de organoides epitelial...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Isolation
10 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip	Fisher scientific	BD 309646
30 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip	VWR	BD302832
Biohazard bags	VWR	89495-440
Biohazard bags	VWR	89495-440
connecting ring	Pluriselect	41-50000-03
Deoxyribonuclease (lot#SLBF7798V)	sigma Aldrich	DN25-1G
Disposable Petri dishes	Corning/Falcon	25373-187
Funnel	Pluriselect	42-50000
HBSS	Corning	21-023
Liberase TM Research Grade	sigma Aldrich	5401127001
needle 16G	VWR	305198
needle 18G	VWR	305199
PluriStrainer 100 µm (Cell Strainer)	Pluriselect	43-50100-51
PluriStrainer 300 µm (Cell Strainer)	Pluriselect	43-50300-03
PluriStrainer 40 µm (Cell Strainer)	Pluriselect	43-50040-51
PluriStrainer 500 µm (Cell Strainer)	Pluriselect	43-50500-03
PluriStrainer 70 µm (Cell Strainer)	Pluriselect	43-50070-51
Razor blades	VWR	55411-050
Red Blood Cell lysis buffer	eBioscience	00-4333-57
Equipment’s
GentleMACS C Tubes	MACS Miltenyi Biotec	130-096-334
GentleMACS Octo Dissociator	MACS Miltenyi Biotec	130-095-937
Leica ASP 300s Tissue processor
LS Columns	MACS Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MultiStand**	Miltenyi Biotech	130-042-303
Thermomixer	Eppendorf	05-412-503
Thermomixer	Eppendorf	05-412-503
HBSS+ Buffer
Amphotericin B	Thermo fisher scientific	15290018	2ml
EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free	Thermo fisher scientific	AM9260G	500µl
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio-Products	100-106	10ml
HBSS Hank's Balanced Salt Solution 1X 500 ml	VWR	45000-456	500ml bottle
HEPES (1 M)	Thermo fisher scientific	15630080	5ml
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture	Thermo fisher scientific	15640055	5ml
List of antibodies for FACS
Alexa Fluor 647 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody	BioLegend	369820	1:50
BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Negative control particles set	Fisher Scientific	BDB552843
CD31 MicroBead Kit, human	Miltenyi Biotec	130-091-935	20µl/ 107 total cells
CD45 MicroBeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-801	20µl/ 107 total cells
DAPI	Sigma Aldrich	D9542-10MG	1:10000
FITC anti-human CD235a	BioLegend	349104	1:100
FITC anti-human CD31	BioLegend	303104	1:100
FITC anti-human CD45	BioLegend	304054	1:100
FITC anti-mouse IgM Antibody	BioLegend	406506	1:500
Mouse IgM anti human HT2-280	Terrace Biotech	TB-27AHT2-280	1:300
PE anti-human CD271(NGFR)	BioLegend	345106	1:50
Composition of Organoid Culture mediums
MRC-5	ATCC	CCL-171
PneumaCult -ALI Medium	Stemcell Technologies	5001
Small Airway Epithelial Cell Growth Medium	PromoCell	C-21170
ThinCert Tissue Culture Inserts, Sterile	Greiner Bio-One	662641
Y-27632 (ROCK inhibitor) 100mM stock (1000x)	Stemcell Technologies	72302
Mouse Basal medium:
Amphotericin B	Thermo fisher scientific	15290018	50 µl
DMEM/F-12, HEPES	ThermoFisher scientific	11330032	50 ml
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio-Products	100-106	5 ml
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100X)	ThermoFisher scientific	41400045	500 µl
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture	Thermo fisher scientific	15640055	500 µl
SB431542 TGF-β pathway inhibitor (stock 100 mM)	Stem cell	72234	5 µl
List of antibodies for Immunohistochemistry
Antigen unmasking solution, citric acid based	Vector	H-3300	937 µl in 100ml water
Histogel	Thermo Scientific	HG-4000-012
Primary Antibodies
Anti HT2-280	Terracebiotech	TB-27AHT2-280	1:500
FOXJ1 Monoclonal Antibody (2A5)	Thermo Fisher Scientific	14-9965-82	1:300
Human Uteroglobin/SCGB1A1 Antibody	R and D systems	MAB4218	1:300
Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified [Poly9059]	Biolegend	905901	1:500
MUC5AC Monoclonal Antibody (45M1)	Thermo Fisher Scientific	MA5-12178	1:300
PDPN / Podoplanin Antibody (clone 8.1.1)	LifeSpan Biosciences	LS-C143022-100	1:300
Purified Mouse Anti-E-Cadherin	BD biosciences	610182	1:1000
Sox-2 Antibody	Santa Cruz biotechnologies	sc-365964	1:300
Secondary Antibodies
Donkey anti-rabbit lgG, 488	Thermo Fisher Scientific	A-21206	1:500
FITC anti-mouse IgM Antibody	BioLegend	406506	1:500
Goat anti-Hamster IgG (H+L), Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	A-21113	1:500
Goat anti-Mouse IgG1 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21121	1:500
Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21131	1:500
Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-21134	1:500
Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-21144	1:500
Buffers
Immunohistochemistry Blocking Solution			3% BSA, o.4% Triton-x100 in TBS (Tris based saline)
Immunohistochemistry Incubation Solution			3% BSA, ).1% Triton-X100 in TBS
Immunohistochemistry Washing Solution			TBS with 0.1% Tween 20