Isolierung und Anreicherung menschlicher Lungenepithel-Vorläuferzellen für Organoidkulturen

Zusammenfassung

Dieser Artikel bietet eine detaillierte Methodik für Gewebedissoziation und zelluläre Fraktionierungsansätze, die die Anreicherung lebensfähiger Epithelzellen aus proximalen und distalen Regionen der menschlichen Lunge ermöglichen. Hierin werden diese Ansätze für die funktionelle Analyse von Lungenepithel-Vorläuferzellen durch den Einsatz von 3D-Organoid-Kulturmodellen angewendet.

Zusammenfassung

Epithel-Organoid-Modelle dienen als wertvolle Werkzeuge, um die grundlegende Biologie eines Organsystems zu untersuchen und Krankheiten zu modellieren. Wenn sie als Organoide gezüchtet werden, können sich epitheliale Vorläuferzellen selbst erneuern und differenzierende Nachkommen erzeugen, die zelluläre Funktionen aufweisen, die denen ihrer In-vivo-Gegenstücke ähneln. Hierin beschreiben wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, um regionsspezifische Vorläufer aus der menschlichen Lunge zu isolieren und 3D-Organoidkulturen als experimentelles und validierendes Werkzeug zu generieren. Wir definieren proximale und distale Regionen der Lunge mit dem Ziel, regionsspezifische Vorläuferzellen zu isolieren. Wir nutzten eine Kombination aus enzymatischer und mechanischer Dissoziation, um Gesamtzellen aus Höhle und Luftröhre zu isolieren. Spezifische Vorläuferzellen wurden dann aus den proximalen oder distalen Ursprungszellen mittels fluoreszenzassoziierter Zellsortierung (FACS) auf der Grundlage von zelltypspezifischen Oberflächenmarkern wie NGFR für die Sortierung von Basalzellen und HTII-280 für die Sortierung von alveolären Typ-II-Zellen fraktioniert. Isolierte basale oder alveoläre Typ-II-Vorläufer wurden verwendet, um 3D-Organoidkulturen zu erzeugen. Sowohl distale als auch proximale Vorläufer bildeten Organoide mit einer koloniebildenden Effizienz von 9-13% in der distalen Region und 7-10% in der proximalen Region, wenn sie am 30. Tag 5000 Zellen / Well plattiert wurden. Distale Organoide hielten HTII-280⁺ alveoläre Typ-II-Zellen in Kultur, während proximale Organoide bis zum 30. Tag in flimmer- und sekretorische Zellen differenzierten. Diese 3D-Organoidkulturen können als experimentelles Werkzeug zur Untersuchung der Zellbiologie von Lungenepithel- und epithelialen mesenchymalen Interaktionen sowie für die Entwicklung und Validierung therapeutischer Strategien zur Bekämpfung der epithelialen Dysfunktion bei einer Krankheit verwendet werden.

Einleitung

Lufträume des menschlichen Atmungssystems können grob in leitende und respiratorische Zonen unterteilt werden, die den Transport von Gasen und deren anschließenden Austausch über die epithelial-mikrovaskuläre Barriere vermitteln. Die leitenden Atemwege umfassen Luftröhren, Bronchien, Bronchiolen und terminale Bronchiolen, während Atemlufträume respiratorische Bronchiolen, Alveolargänge und Alveolen umfassen. Die Epithelauskleidung dieser Lufträume ändert ihre Zusammensetzung entlang der proximo-distalen Achse, um den einzigartigen Anforderungen jeder funktional unterschiedlichen Zone gerecht zu werden. Das pseudostratifizierte Epithel der tracheo-bronchialen Atemwege besteht aus drei Hauptzelltypen, basal, sekretorisch und ziliiert, zusätzlich zu den weniger häufigen Zelltypen, einschließlich Bürsten, neuroendokrinen und Ionozyten ^1,2,3. Bronchioläre Atemwege beherbergen morphologisch ähnliche Epithelzelltypen, obwohl es Unterschiede in ihrer Häufigkeit und ihren funktionellen Eigenschaften gibt. Zum Beispiel sind Basalzellen in bronchiolären Atemwegen weniger häufig, und sekretorische Zellen umfassen einen größeren Anteil an Clubzellen im Vergleich zu serösen und Kelchzellen, die in Tracheo-Bronchial-Atemwegen vorherrschen.  Epithelzellen der Atemzone umfassen einen schlecht definierten quaderförmigen Zelltyp in respiratorischen Bronchiolen, zusätzlich zu alveolären Typ-I- (ATI) und Typ-II- (ATII) -Zellen von Alveolargängen und Alveolen ^1,4.

Die Identität von Epithelstamm- und Vorläuferzelltypen, die zur Erhaltung und Erneuerung von Epitheln in jeder Zone beitragen, wird unvollständig beschrieben und weitgehend aus Studien in Tiermodellen^abgeleitet 5,6,7,8. Studien an Mäusen haben gezeigt, dass entweder Basalzellen pseudostratifizierter Atemwege oder Keulenzellen bronchiolärer Atemwege oder ATII-Zellen des Alveolarepithels als epitheliale Stammzellen dienen, basierend auf der Fähigkeit zur unbegrenzten Selbsterneuerung und multipotenten Differenzierung 7,9,10,11,12 . Trotz der Unfähigkeit, genetische Linienverfolgungsstudien durchzuführen, um die Stammheit menschlicher Lungenepithelzelltypen zu beurteilen, bietet die Verfügbarkeit von Organoid-basierten Kulturmodellen zur Beurteilung des funktionellen Potenzials von Epithelstamm- und Vorläuferzellen ein Werkzeug für vergleichende Studien zwischen Maus und Mensch 13,14,15,16,17.

Wir beschreiben Methoden zur Isolierung von Epithelzelltypen aus verschiedenen Regionen der menschlichen Lunge und deren Kultur unter Verwendung eines 3D-Organoidsystems, um die regionalen Zelltypen zu rekapitulieren. Ähnliche Methoden wurden für die Funktionsanalyse und Krankheitsmodellierung von Epithelzellen aus anderen Organsystemen^{entwickelt 18,19,20,21}. Diese Methoden bieten eine Plattform für die Identifizierung regionaler epithelialer Vorläuferzellen, für die Durchführung mechanistischer Studien, die ihre Regulation und Mikroumgebung untersuchen, sowie für die Krankheitsmodellierung und Wirkstoffforschung. Obwohl Studien an Lungenepithel-Vorläuferzellen, die in Tiermodellen durchgeführt wurden, von der Analyse profitieren können, entweder in vivo oder in vitro, waren die Erkenntnisse über die Identität menschlicher Lungenepithel-Vorläuferzellen weitgehend von der Extrapolation von Modellorganismen abhängig. Als solche bieten diese Methoden eine Brücke, um die Identität und das Verhalten menschlicher Lungenepithelzelltypen mit ihren Studien zur Regulation von Stamm- / Vorläuferzellen in Beziehung zu setzen.

Protokoll

Menschliches Lungengewebe wurde von verstorbenen Gewebespendern in Übereinstimmung mit den vom International Institute for the Advancement of Medicine (IIAM) entwickelten und vom Cedars-Sinai Medical Center Internal Review Board genehmigten Einwilligungsverfahren gewonnen.

1. Gewebeverarbeitung zur Isolierung von Lungenzellen aus tracheo-bronchialen oder kleinen Atemwegs-/Parenchymregionen (kleine Atemwege und Alveolen)

1. Bereiten Sie alle Dissektionsinstrumente, Glaswaren und die entsprechenden Lösungen einen Tag vor der Zellisolierung vor und autoklavieren Sie sie.
2. Identifizieren und trennen Sie nach Erhalt von Lungengewebe die proximalen und distalen Regionen. Die Luftröhre und die Bronchien gelten als "proximal". Für die Zwecke dieses Protokolls werden Luftröhre und die ersten 2-3 Generationen von Bronchien spezifiziert und zur Isolierung des "proximalen" Atemwegsepithels verwendet. Kleine Atemwege mit einem Durchmesser von 2 mm oder weniger und das umgebende Parenchymgewebe werden für die Zwecke dieses Protokolls als "distales" Lungenepithel betrachtet (Abbildung 1A).
   HINWEIS: Alle Verfahren, die die Verarbeitung von menschlichem Lungengewebe beinhalten, sollten in einer Biosicherheitskabine unter Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt werden.

2. Anreicherung und Untersetzung von kleinen Atemwegs- und alveolären Epithel-Vorläuferzellen aus distalem Lungengewebe

1. Vorbereitung von distalem Gewebe
   1. Geben Sie das distale Lungengewebe in eine sterile Petrischale (150 x 15 mm). Würfelgewebe in ca. 1 cm³ Stücke geben und in ein sauberes 50 ml Röhrchen geben.
   2. Waschen Sie das Gewebe 3x mit gekühltem HBSS und entsorgen Sie HBSS-Waschen jedes Mal, um Blut und Epithelauskleidungsflüssigkeit zu entfernen.
   3. Legen Sie das Gewebe in eine neue Petrischale und tupfen Sie es mit sterilen Fusselschutztüchern trocken. Entfernen Sie mit Pinzette und Schere so viel viszerale Pleura (eine empfindliche transparente Membran, die die Oberfläche der Lunge bedeckt) wie möglich.
   4. Verwenden Sie eine Schere, um Gewebe in Stücke von ca. 2 mm Durchmesser zu zerkleinern. Hackfleisch in eine saubere Petrischale geben und weiter zerkleinern, indem man es mit einer sterilen einseitigen Rasierklinge auf eine ungefähre Größe von 1 mm hackt.
2. Enzymverdauung
   HINWEIS: Die Liberase-Stammlösung beträgt 5 mg / ml (100x) und der DNase-Stamm beträgt 2,5 mg / ml (100x) (Materialtabelle).
   1. 50 μg/ml Liberase und 25 μg/mL DNase in steriles HBSS in einem 50 mL konischen Röhrchen geben.
   2. Übertragen Sie ca. 2-3 g gehacktes Gewebe in eine neue 50 ml konische Röhre mit 25 ml HBSS, die Liberase und DNase enthält. Inkubieren Sie für 40-60 min bei 37 °C mit kontinuierlichem Schütteln mit einem auf 900 U / min eingestellten Mischer. Nach 30 Minuten Inkubation verdauen Sie das verdaute Gewebe mit einer 30-ml-Spritze ohne Nadel, um die Bildung von Klumpen zu vermeiden und mit der Inkubation fortzufahren.
      HINWEIS: Die Inkubationszeit mit den Enzymen kann je nach Art oder Zustand des Gewebes variieren. Zum Beispiel dauert die enzymatische Verdauung von normalem Gewebe ungefähr 45 Minuten. Fibrotisches Gewebe aus idiopathischen Lungenfibroseproben kann jedoch eine längere Inkubationszeit von bis zu 60 min erfordern. Überwachen Sie daher das Gewebe während dieses Schritts sorgfältig, um Schäden an den Oberflächenmarkern zu vermeiden, was für FACS von entscheidender Bedeutung ist.
3. Einzelzellen-Isolierung
   1. Trituieren Sie das Gewebe, indem Sie 5x durch eine 16-G-Nadel ziehen, die an einer 30-ml-Spritze angebracht ist. Ziehen Sie die Gewebesuspension in eine Breitrohrpipette und durchlaufen Sie eine Reihe von Zellsieben (500 μm, 300 μm, 100 μm, 70 μm, 40 μm) unter Vakuumdruck. Waschen Sie das Sieb mit 20 ml HBSS + -Puffer, um die verbleibenden Zellen zu sammeln. Das Rezept für HBSS+ Puffer finden Sie in der Tabelle der Materialien.
   2. Fügen Sie dem Filtrat nach 45 Minuten ein gleiches Volumen HBSS + -Puffer hinzu, um die Liberase-Aktivität zu hemmen und eine Überverdauung zu verhindern.
   3. Zentrifugenfiltrat bei 500 x g für 5 min bei 4 °C. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und entsorgen Sie ihn. Fügen Sie 1 ml Lysepuffer der roten Blutkörperchen (RBC) zum Pellet hinzu, schaukeln Sie das Rohr vorsichtig, um das Pellet zu entfernen, und inkubieren Sie es 1 min lang auf Eis.
      HINWEIS: Die Menge und Zeit in der RBC-Lyselösung hängt von der Größe des Pellets ab. Es ist wichtig, die Zellen auf Eis zu halten und die Zeit in RBC-Lyselösung sorgfältig zu überwachen, um die Lyse der Zielzellen zu verhindern. Wenn die RBC-Lyse nicht ausreicht, wiederholen Sie den Schritt.
   4. Fügen Sie 10-20 ml HBSS + -Puffer hinzu, um den RBC-Lysepuffer zu neutralisieren. Zentrifugenfiltrat bei 500 x g für 5 min bei 4 °C.
   5. Wenn lysierte rote Blutkörperchen (Geisterzellen) eine trüben Schicht über dem Zellpellet bilden, resuspendieren Sie das Pellet in 10 ml HBSS + -Puffer und belasten Sie die Suspension durch 70 μm-Zellsieb, um die Geisterzellen zu eliminieren. Das Filtrat bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und mit weiteren Schritten fortfahren.
4. Erschöpfung von Immunzellen und Endothelzellen (optionaler Schritt)
   1. Erschöpfen Sie CD31⁺ Endothelzellen und CD45⁺ Immunzellen aus dem Pool der Gesamtzellen unter Verwendung der CD31 & CD45 Mikrokügelchen, die an monoklonale antihumane CD31- und CD45-Antikörper (Isotyp-Maus IgG1) und LS-Säulen gemäß dem Protokoll des Herstellers (Table of Materials) konjugiert sind.
   2. Sammeln Sie den Durchfluss, der hauptsächlich aus Epithel- und Stromazellen besteht, in einem frischen sterilen Röhrchen und zentrifugieren Sie ihn bei 500 x g für 5 min bei 4 °C. Führen Sie eine Zellzählung durch, um die Gesamtzahl der Zellen im Durchfluss zu ermitteln.
5. Zelloberflächenfärbung für fluoreszenzassoziierte Zellsortierung (FACS)
   1. Resuspendieren Sie 1 x 10⁷ Zellen pro 1 ml HBSS + -Puffer. Fügen Sie primäre Antikörper in der erforderlichen Konzentration hinzu und inkubieren Sie die Zellen für 30 min bei 4 °C im Dunkeln. In dieser Studie wurden fluorophorkonjugierte primäre Antikörper verwendet, sofern nicht anders angegeben. Details zu Antikörperquellen und Titern sind in der Materialtabelle beschrieben.
      HINWEIS: HTII-280 ist derzeit der beste oberflächenreaktive Antikörper, der es ermöglicht, distale Lungenzellen in überwiegend Atemwegs- (HTII-280-) und alveoläre Typ-2- (^HTII-280+) Zellfraktionen zu unterteilen. Ein Vorbehalt zu dieser Strategie ist, dass AT1-Zellen mit dieser Methode nicht gefärbt werden und aufgrund ihrer Zerbrechlichkeit schlecht vertreten sind. AT1-Zellen sind jedoch in distalen Lungenpräparaten schlecht vertreten, vermutlich aufgrund ihrer Zerbrechlichkeit und ihres Verlustes bei der Selektion lebensfähiger Zellen durch FACS und stellen somit nur eine seltene Verunreinigung der Atemwegszellfraktion dar.
   2. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 3 ml HBSS+-Puffer und zentrifugieren Sie bei 500 x g für 5 min bei 4 °C.
   3. Wenn Sie nicht konjugierte primäre Antikörper verwenden, fügen Sie die erforderliche Konzentration eines geeigneten fluorophorkonjugierten sekundären Antikörpers hinzu und inkubieren Sie für 30 Minuten auf Eis. Waschen Sie überschüssigen sekundären Antikörper ab, indem Sie 3 ml HBSS+-Puffer und Zentrifuge bei 500 x g für 5 min bei 4 °C hinzufügen.
   4. Verwerfen Sie die überstehenden und resuspendierten Zellen im HBSS+-Puffer pro 1 x 10⁷ Zellen/ml. Filtern Sie Zellen durch eine Siebkappe in 5-ml-Polystyrolröhrchen, um die Bildung einer Einzelzellsuspension sicherzustellen. DAPI (1 μg/ml) hinzufügen, um durchlässige (tote) Zellen zu färben.
      HINWEIS: Es ist wichtig, geeignete einfarbige und Fluoreszenz-abzüglich eins (FMO) -Kontrollen (dh Antikörper-Färbe-Cocktail minus jeweils einen Antikörper) zu verwenden, um Fehlalarme während des FACS zu minimieren. In dieser Studie wurden positive und negative Selektionsperlen zur empirischen Kompensation der Überlappung von Emissionsspektren zwischen Fluorophoren verwendet (Table of Materials). FACS reichern Zelltypen von Interesse an. Lebensfähige Epithelzellen werden basierend auf ihrem CD45-negativen, CD31-negativen, CD236-positiven Zelloberflächenphänotyp und ihrer negativen Färbung für DAPI angereichert. Diese Epithelzellfraktion kann basierend auf der Färbung für zelltypspezifische Oberflächenmarker, wie z.B. spezifische Färbung für HTII-280-positive Zellen, die für AT2-Zellen angereichert sind, weiter unterteilt werden. Im Gegensatz dazu ermöglicht die negative Selektion für HTII-280 die Anreicherung kleiner Epithelzellen der Atemwege wie Keulen- und Flimmerzellen (Abbildung 2).

3. Anreicherung und Subsetting von epithelialen Vorläuferzellen aus tracheo-bronchialen Atemwegen

1. Gewebepräparation
   1. Sezieren Sie proximale Atemwege (Luftröhre/Bronchien) aus der Lunge heraus. Öffnen Sie die Atemwege entlang ihrer Länge mit einer Schere, um das Lumen freizulegen, und fügen Sie 50 μg / ml Liberase hinzu, um das Gewebe vollständig abzudecken.
   2. Inkubieren Sie für 20 min bei 37 °C mit kontinuierlichem Schütteln mit einem Thermomischer, der auf 900 U / min eingestellt ist.
   3. Entfernen Sie die proximalen Atemwege aus dem Zentrifugenröhrchen und legen Sie es in eine sterile Petrischale (150 x 15 mm). Schaben Sie vorsichtig die Oberfläche der Atemwege mit einem Skalpell, um luminale Epithelzellen vollständig aus dem Gewebe zu entfernen.
   4. Waschen Sie die Petrischale mit 5 ml sterilem HBSS+-Puffer, um alle gelösten luminalen Epithelzellen zu sammeln und die gelösten Zellen in ein konisches 50-ml-Zentrifugenröhrchen zu überführen. Trituieren Sie die Suspension, indem Sie 5x bis 16 G Nadel und 18 G Nadel auf eine 10 ml Spritze setzen, um Einzelzellsuspension zu erhalten.
   5. Zentrifen Sie die Suspension bei 500 x g für 5 min bei 4 °C. Resuspendiert das Pellet in frischem HBSS+-Puffer und lagert diese leuchtenden Atemwegszellen auf Eis, bereit, in den kommenden Schritten mit der Einzelzellsuspension kombiniert zu werden, die aus den gehackten proximalen Atemwegen erzeugt wird.
   6. Schneiden Sie mit einer Schere das restliche Luftröhren-Bronchialgewebe entlang seiner Ringe ab, um kleine Gewebestreifen zu erzeugen, und übertragen Sie die Streifen in eine frische Petrischale. Zerkleinern Sie die Gewebestreifen mit einer einseitigen Rasierklinge, um kleinere Stücke herzustellen.
      HINWEIS: Da die proximalen Atemwege knorpelig sind, können sie nicht so fein zerkleinert werden wie das distale Lungengewebe.
   7. Übertragen Sie das gehackte Gewebe in die C-Röhren, fügen Sie 2 ml Liberase in die Röhre hinzu, um sicherzustellen, dass das Gewebe untergetaucht wird. Laden Sie den C-Schlauch auf den automatisierten Dissoziator und führen Sie das Human Lung Protocol-2 aus, um das Gewebe mechanisch weiter zu dissoziieren.
      HINWEIS: Der in diesem Protokoll verwendete Dissoziator bietet ein optimiertes Programm namens Human Lung Protocol-2 für diese spezielle Anwendung (siehe Materialverzeichnis).
2. Enzymverdauung und Einzelzellisolierung
   1. Übertragen Sie etwa 2 g gehacktes proximales Gewebe aus dem C-Rohr in jedes konische 50-ml-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie 50 μg/ml Liberase und 25 μg/ml DNase-Lösung zu jeder Tube hinzu.
      HINWEIS: Um eine effiziente Dissoziation zu gewährleisten, sollten Röhrchen nicht über die 30-ml-Marke hinaus gefüllt werden.
   2. Inkubieren Sie das gehackte Gewebe für 45 min bei 37 °C mit kontinuierlichem Schütteln mit einem Mischer, der auf 900 U / min eingestellt ist.
   3. Führen Sie die dissoziierte Gewebesuspension durch eine Reihe von Zellsieben (500 μm, 300 μm, 100 μm, 70 μm, 40 μm) unter Vakuumdruck, wie oben erwähnt, und sammeln Sie den Durchfluss. Waschen Sie das Sieb mit 20 ml HBSS + -Puffer, um die verbleibenden Zellen zu sammeln.
      HINWEIS: Da proximales Gewebe im Vergleich zum distalen Gewebe knorpelig und sperrig ist, besteht eine höhere Wahrscheinlichkeit, dass die Filter verstopfen. Die Verwendung eines Trichters kann dazu beitragen, das Überlaufen der Flüssigkeit beim Passieren der Siebe zu verhindern.
   4. Fügen Sie dem Filtrat ein gleiches Volumen an HBSS + -Puffer hinzu, um die Liberase-Aktivität zu hemmen und eine Überverdauung zu verhindern. In diesem Schritt werden die isolierten luminalen proximalen Atemwegszellen aus 3.1.5 zur Zellsuspension hinzugefügt.
   5. Zentrifen Sie die kombinierte Zellsuspension bei 500 x g für 10 min. Entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie die Zellwäsche im HBSS+-Puffer. Führen Sie eine Erschöpfung von CD45+ Immunzellen und CD31⁺ Endothelzellen durch, wie oben in 2.4 erwähnt (optionaler Schritt).
   6. Methoden zur Färbung ähneln distalem Lungengewebe, folgen Sie den Schritten in 2.5. Anreicherung lebensfähiger Epithelzellen basierend auf ihrem CD45-negativen, CD31-negativen, CD236-positiven Zelloberflächenphänotyp und negativer Färbung für DAPI.
   7. Weiter unterteilt die Epithelzellfraktion basierend auf der Färbung für zelltypspezifische Oberflächenmarker wie NGFR, was die Anreicherung von basalen (NGFR-positiven) und nicht-basalen (NGFR-negativ; sekretorischen, bewimperten, neuroendokrinen) Zelltypen ermöglicht (Abbildung 3).

4. Organoide Kultur

1. Fügen Sie 5.000 (diese Zahl kann angepasst werden, um die gewünschte Dichte von Epithelorganoiden zu erhalten) sortierte proximale oder distale Epithelzellen zu sterilen 1,5 ml Röhrchen zusammen mit 7,5 x 10⁴ MRC-5-Zellen (menschliche Lungenfibroblastenzelllinie) hinzu. Epithel-mesenchymale Interaktionen sind entscheidend für die Expansion von Vorläuferzellen.
2. Zentrifuge bei 500 x g für 5 min bei 4 °C.
   HINWEIS: Es ist wichtig, die vom Sortierer erhaltene Zellzahl manuell zu bestätigen, um die Genauigkeit der Organoidkoloniebildung zu gewährleisten.
3. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und suspendieren Sie das Zellpellet in 50 μL eiskaltem Medium, ergänzt mit Antibiotika. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis.
4. Geben Sie 50 μL eiskaltes 1x Wachstumsfaktor-abgereichertes Basalmembranmatrixmedium in die Durchstechflasche und pipettieren Sie die Suspension vorsichtig auf Eis, um sie zu mischen.
   HINWEIS: Es ist wichtig, eiskalte Medien zu verwenden und Zellen auf Eis zu halten, um eine vorzeitige Polymerisation des Basalmembranmatrixmediums zu vermeiden.
5. Übertragen Sie die Zellsuspension auf einen porengroßen Zellkultureinsatz von 0,4 μm in einer 24-Well-Platte (1,4 x 10⁴ Zellen/cm²) und achten Sie darauf, die Einführung von Luftblasen zu vermeiden.
6. 30-45 min bei 37 °C inkubieren, damit sich die Matrix verfestigen kann.
7. 600 μL vorerwärmtes Wachstumsmedium in die Vertiefung geben.
   HINWEIS: Media wurde in den ersten 24 h nach der Aussaat mit Antimykotika (0,4%) und Pen-Streptokokken (1%) und den ersten 72 h mit 10 μM Rho-Kinase-Inhibitor ergänzt.
8. Kultur bei 37 °C in einem 5% CO₂ Inkubator für 30 Tage, während dieser Zeit sollten die Medien alle 48 h gewechselt werden.
   HINWEIS: Die Kulturdauer kann je nach Zweck des Experiments geändert werden. Längere Endpunkte werden verwendet, um die Differenzierung zu untersuchen, während kürzere Endpunkte von 7 Tagen, 14 Tagen usw. verwendet werden können, wenn der Zweck des Experiments nicht darin besteht, eine vollständige Differenzierung zu erreichen.
9. 10 μM TGFβ-Inhibitor für 15 Tage in die Kulturmedien geben, um die Zellen in der proliferativen Phase zu erhalten und das Überwachsen von Fibroblasten zu unterdrücken.
   HINWEIS: Die Ergebnisse unterscheiden sich je nach Kulturmedium, das für den Assay verwendet wird. Zum Beispiel wurden die hierin gezeigten Ergebnisse mit Pneumacult-ALI-Medium erzeugt, was zur Erzeugung großer Organoide aus distaler Lunge, gut differenzierten und größeren Organoiden aus der proximalen Lunge führt.

5. Organoide Färbung

1. Fixierung und Einbettung von Organoiden
   1. Aspirieren Sie Medien sowohl aus der oberen als auch aus der unteren Transmembraneinlagekammer und spülen Sie sie einmal mit warmem PBS ab.
   2. Fixieren Sie die Kulturen, indem Sie 300 μL PFA (2% w/v) in den Einsatz und 500 μL in den Brunnen für 1 Stunde bei 37 °C geben. Entfernen Sie das Fixiermittel und spülen Sie es mit warmem PBS ab, wobei Sie darauf achten, den Basememt-Membranmatrixstopfen nicht zu entfernen.
      HINWEIS: Feste Organoide können ein bis zwei Wochen unter Wasser in PBS bei 4 °C gelagert werden, bevor weitere Schritte eingeleitet werden.
   3. Aspirieren Sie PBS, drehen Sie den Einsatz um und schneiden Sie die Wendeschneidplattenmembran vorsichtig um ihre Peripherie herum. Entfernen Sie mit einer Pinzette die Transwell-Membran und achten Sie darauf, den Matrixstopfen nicht zu stören.
   4. Tippen Sie in einer Petrischale auf den Einsatz, um den Matrixstopfen wiederherzustellen.
   5. Fügen Sie einen Tropfen Probenverarbeitungsgel wie Histogel (bei 37 ° C) zum Matrixstopfen hinzu und halten Sie ihn bei 4 ° C, bis das Gel erstarrt.
   6. Den Stecker auf eine Einbettungskassette geben, durch zunehmende Konzentrationen von Ethanol (70, 90 und 100%), klar in Xylol dehydrieren und in Paraffinwachs einbetten.
   7. Schneiden Sie 7 μm-Schnitte auf einem Mikrotom und sammeln Sie auf positiv geladenen Objektträgern.
2. Immunfluoreszenzfärbung von Organoiden
   1. Platzieren Sie die Dias bei 65 °C für 30 Minuten zum Entwachsen.
   2. Deparaffinisieren Sie die Abschnitte durch Eintauchen in Xylol und rehydrieren Sie durch abnehmende Konzentrationen von Ethanol.
   3. Führen Sie Hochtemperatur-Antigenabruf in Antigen-Demaskierungslösung, Zitronensäure-Base mit einem handelsüblichen Retriever durch, indem Sie Objektträger für 15 Minuten in die Lösung tauchen (Materialtabelle).
   4. Umgeben Sie das Gewebe mit einer hydrophoben Barriere mit einem Pap-Stift.
   5. Blockieren Sie die unspezifische Färbung zwischen den primären Antikörpern und dem Gewebe, indem Sie im Blocking-Puffer inkubieren.
   6. Inkubieren Sie Abschnitte in geeigneter Konzentration von primären Antikörpern, die in Inkubationslösung verdünnt wurden, über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer.
   7. Abschnitte 3x bei Raumtemperatur mit einem Waschpuffer abspülen.
   8. Inkubieren Sie in der entsprechenden Konzentration an fluorochromkonjugierten Sekundärantikörpern für 1 h bei Raumtemperatur.
   9. Abschnitte 3x bei Raumtemperatur mit 0,1% Tween 20-TBS abspülen. Inkubieren Sie Abschnitte für 5 min in DAPI (1 μg/ml). Abschnitte einmal in TBS (Tris-buffered saline) mit 0,1% Tween 20 spülen, trocknen und in einer Montagelösung montieren (Abbildung 4 und Abbildung 5).
      HINWEIS: Quelle und optimale Arbeitsverdünnung von primären und sekundären Antikörpern, die für die Immunfluoreszenzfärbung verwendet werden, sind in der Materialtabelle enthalten.

Ergebnisse

Quelle Lungengewebe
Die Luftröhre und der extrapulmonale Bronchus (Abbildung 1A) wurden als Quellgewebe für die Isolierung proximaler Atemwegsepithelzellen und die anschließende Erzeugung proximaler Organoide verwendet. Distales Lungengewebe, das sowohl Parenchym als auch kleine Atemwege mit einem Durchmesser von weniger als 2 mm umfasst (Abbildung 1A), wurde zur Isolierung kleiner Atemwegs- und Alveolarepithelzellen (distales Lungenepithe...

Diskussion

Wir beschreiben eine zuverlässige Methode zur Isolierung definierter Subpopulationen von Lungenzellen aus menschlichem Lungengewebe für die molekulare oder funktionelle Analyse und Krankheitsmodellierung. Kritische Elemente der Methoden sind die Fähigkeit, eine Gewebedissoziation unter Konservierung von Oberflächenepitopen zu erreichen, die eine Antikörper-vermittelte Anreicherung frisch isolierter Zellen ermöglichen, und die Optimierung von Kulturmethoden für die effiziente Erzeugung von regionsspezifischen Epith...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Isolation
10 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip	Fisher scientific	BD 309646
30 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip	VWR	BD302832
Biohazard bags	VWR	89495-440
Biohazard bags	VWR	89495-440
connecting ring	Pluriselect	41-50000-03
Deoxyribonuclease (lot#SLBF7798V)	sigma Aldrich	DN25-1G
Disposable Petri dishes	Corning/Falcon	25373-187
Funnel	Pluriselect	42-50000
HBSS	Corning	21-023
Liberase TM Research Grade	sigma Aldrich	5401127001
needle 16G	VWR	305198
needle 18G	VWR	305199
PluriStrainer 100 µm (Cell Strainer)	Pluriselect	43-50100-51
PluriStrainer 300 µm (Cell Strainer)	Pluriselect	43-50300-03
PluriStrainer 40 µm (Cell Strainer)	Pluriselect	43-50040-51
PluriStrainer 500 µm (Cell Strainer)	Pluriselect	43-50500-03
PluriStrainer 70 µm (Cell Strainer)	Pluriselect	43-50070-51
Razor blades	VWR	55411-050
Red Blood Cell lysis buffer	eBioscience	00-4333-57
Equipment’s
GentleMACS C Tubes	MACS Miltenyi Biotec	130-096-334
GentleMACS Octo Dissociator	MACS Miltenyi Biotec	130-095-937
Leica ASP 300s Tissue processor
LS Columns	MACS Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MultiStand**	Miltenyi Biotech	130-042-303
Thermomixer	Eppendorf	05-412-503
Thermomixer	Eppendorf	05-412-503
HBSS+ Buffer
Amphotericin B	Thermo fisher scientific	15290018	2ml
EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free	Thermo fisher scientific	AM9260G	500µl
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio-Products	100-106	10ml
HBSS Hank's Balanced Salt Solution 1X 500 ml	VWR	45000-456	500ml bottle
HEPES (1 M)	Thermo fisher scientific	15630080	5ml
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture	Thermo fisher scientific	15640055	5ml
List of antibodies for FACS
Alexa Fluor 647 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody	BioLegend	369820	1:50
BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Negative control particles set	Fisher Scientific	BDB552843
CD31 MicroBead Kit, human	Miltenyi Biotec	130-091-935	20µl/ 107 total cells
CD45 MicroBeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-801	20µl/ 107 total cells
DAPI	Sigma Aldrich	D9542-10MG	1:10000
FITC anti-human CD235a	BioLegend	349104	1:100
FITC anti-human CD31	BioLegend	303104	1:100
FITC anti-human CD45	BioLegend	304054	1:100
FITC anti-mouse IgM Antibody	BioLegend	406506	1:500
Mouse IgM anti human HT2-280	Terrace Biotech	TB-27AHT2-280	1:300
PE anti-human CD271(NGFR)	BioLegend	345106	1:50
Composition of Organoid Culture mediums
MRC-5	ATCC	CCL-171
PneumaCult -ALI Medium	Stemcell Technologies	5001
Small Airway Epithelial Cell Growth Medium	PromoCell	C-21170
ThinCert Tissue Culture Inserts, Sterile	Greiner Bio-One	662641
Y-27632 (ROCK inhibitor) 100mM stock (1000x)	Stemcell Technologies	72302
Mouse Basal medium:
Amphotericin B	Thermo fisher scientific	15290018	50 µl
DMEM/F-12, HEPES	ThermoFisher scientific	11330032	50 ml
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio-Products	100-106	5 ml
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100X)	ThermoFisher scientific	41400045	500 µl
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture	Thermo fisher scientific	15640055	500 µl
SB431542 TGF-β pathway inhibitor (stock 100 mM)	Stem cell	72234	5 µl
List of antibodies for Immunohistochemistry
Antigen unmasking solution, citric acid based	Vector	H-3300	937 µl in 100ml water
Histogel	Thermo Scientific	HG-4000-012
Primary Antibodies
Anti HT2-280	Terracebiotech	TB-27AHT2-280	1:500
FOXJ1 Monoclonal Antibody (2A5)	Thermo Fisher Scientific	14-9965-82	1:300
Human Uteroglobin/SCGB1A1 Antibody	R and D systems	MAB4218	1:300
Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified [Poly9059]	Biolegend	905901	1:500
MUC5AC Monoclonal Antibody (45M1)	Thermo Fisher Scientific	MA5-12178	1:300
PDPN / Podoplanin Antibody (clone 8.1.1)	LifeSpan Biosciences	LS-C143022-100	1:300
Purified Mouse Anti-E-Cadherin	BD biosciences	610182	1:1000
Sox-2 Antibody	Santa Cruz biotechnologies	sc-365964	1:300
Secondary Antibodies
Donkey anti-rabbit lgG, 488	Thermo Fisher Scientific	A-21206	1:500
FITC anti-mouse IgM Antibody	BioLegend	406506	1:500
Goat anti-Hamster IgG (H+L), Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	A-21113	1:500
Goat anti-Mouse IgG1 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21121	1:500
Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21131	1:500
Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-21134	1:500
Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-21144	1:500
Buffers
Immunohistochemistry Blocking Solution			3% BSA, o.4% Triton-x100 in TBS (Tris based saline)
Immunohistochemistry Incubation Solution			3% BSA, ).1% Triton-X100 in TBS
Immunohistochemistry Washing Solution			TBS with 0.1% Tween 20