Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מאמר זה מספק מתודולוגיה מפורטת לגישות דיסוציאציה של רקמות ופירוק תאי, המאפשרות העשרה של תאי אפיתל בני קיימא מאזורים פרוקסימליים ודיסטליים של הריאה האנושית. כאן גישות אלה מיושמות לניתוח פונקציונלי של תאי אב אפיתל ריאה באמצעות שימוש במודלים של תרביות אורגנואידים תלת-ממדיות.

Abstract

מודלים אורגנואידים של אפיתל משמשים ככלים חשובים לחקר הביולוגיה הבסיסית של מערכת איברים ולמידול מחלות. כאשר הם גדלים כאורגנואידים, תאי אב אפיתליאליים יכולים לחדש את עצמם וליצור צאצאים מתמיינים המציגים תפקודים תאיים דומים לאלה של עמיתיהם in vivo . כאן אנו מתארים פרוטוקול שלב אחר שלב לבידוד אבות ספציפיים לאזור מריאה אנושית וליצירת תרביות אורגנואידיות תלת-ממדיות ככלי ניסיוני ואימות. אנו מגדירים אזורים פרוקסימליים ודיסטליים של הריאה במטרה לבודד תאי אב ספציפיים לאזור. השתמשנו בשילוב של דיסוציאציה אנזימטית ומכנית כדי לבודד את סך התאים מהריאה ומקנה הנשימה. לאחר מכן, תאי אב ספציפיים נותקו מתאי המקור הפרוקסימליים או הדיסטליים באמצעות מיון תאים פלואורסצנטיים הקשורים (FACS) בהתבסס על סמני פני שטח ספציפיים לסוג התא, כגון NGFR למיון תאי בסיס ו-HTII-280 למיון תאים מסוג II של alveolar. אבות בזלתיים או נאדיים מבודדים מסוג II שימשו ליצירת תרביות אורגנואידיות תלת-ממדיות. גם אבות דיסטליים וגם אבות פרוקסימליים יצרו אורגנואידים עם מושבה היוצרת יעילות של 9-13% באזור הדיסטלי ו-7-10% באזור פרוקסימלי כאשר הם מצופים 5000 תאים/באר ביום ה-30. אורגנואידים דיסטליים שמרו על תאים מסוג II מסוג HTII-280+ בתרבית ואילו אורגנואידים פרוקסימליים התמינו לתאים סיליים ומפרישים עד יום 30. תרביות אורגנואידים תלת-ממדיות אלה יכולות לשמש ככלי ניסיוני לחקר הביולוגיה של התא של אפיתל ריאות ואינטראקציות מזנכימליות אפיתליאליות, כמו גם לפיתוח ואימות של אסטרטגיות טיפוליות המכוונות לתפקוד לקוי של אפיתל במחלה.

Introduction

ניתן לחלק באופן נרחב את המרחבים האוויריים של מערכת הנשימה האנושית לאזורים מוליכים ונשימה המתווכים הובלת גזים והחלפתם לאחר מכן על פני מחסום האפיתל-מיקרו-וסקולרי, בהתאמה. דרכי הנשימה המוליכות כוללות קנה הנשימה, ברונכי, ברונכיולים וברונכיולות סופניות, בעוד שמרחבי אוויר נשימתיים כוללים ברונכיולים נשימתיים, צינורות נאדיים ונאדיות. בטנת האפיתל של מרחבים אוויריים אלה משתנה בהרכב לאורך הציר הפרוקסימו-דיסטלי כדי להתאים לדרישות הייחודיות של כל אזור מובחן מבחינה פונקציונלית. האפיתל המדומה של דרכי הנשימה של דרכי הנשימה של קנה הנשימה-סימפונות מורכב משלושה סוגי תאים עיקריים, בסיסיים, מפרישים וציליים, בנוסף לסוגי התאים הפחות נפוצים כולל מברשת, נוירואנדוקרינית ויונוציטים 1,2,3. דרכי הנשימה של ברונכיולאר מכילות סוגי תאי אפיתל דומים מבחינה מורפולוגית, אם כי ישנן הבחנות בשפע ובתכונות התפקודיות שלהם. לדוגמה, תאי בסיס נפוצים פחות בתוך דרכי הנשימה הסימפונות, ותאי הפרשה כוללים שיעור גדול יותר של תאי מועדון לעומת תאי סרוס וגביע השולטים בדרכי הנשימה של קנה הנשימה הסימפונות.  תאי אפיתל של אזור הנשימה כוללים סוג של תא קובידלי לא מוגדר היטב בסמפונות נשימתיים, בנוסף לתאים מסוג I (ATI) וסוג II (ATII) של צינורות נאדיים ונאדיות 1,4.

הזהות של גזע אפיתל וסוגי תאי אב התורמים לתחזוקה ולחידוש של אפיתליה בכל אזור מתוארים באופן חלקי ומוסקים במידה רבה ממחקרים במודלים של בעלי חיים 5,6,7,8. מחקרים בעכברים הראו כי תאי בסיס של דרכי הנשימה המדומות, או תאי מועדון של דרכי הנשימה הסימפונות או תאי ATII של אפיתל הנאדי, משמשים כתאי גזע אפיתליאליים המבוססים על יכולת להתחדשות עצמית בלתי מוגבלת והתמיינות רב-פוטנטית 7,9,10,11,12 . למרות חוסר היכולת לבצע מחקרי מעקב אחר שושלת גנטית כדי להעריך את הגבעול של סוגי תאי אפיתל הריאה האנושיים, הזמינות של מודלים של תרביות מבוססות אורגנואידים להערכת הפוטנציאל התפקודי של גזע אפיתל ותאי אב מספקים כלי למחקרים השוואתיים בין עכבר לאדם 13,14,15,16,17.

אנו מתארים שיטות לבידוד סוגי תאי אפיתל מאזורים שונים של הריאה האנושית ואת התרבית שלהם באמצעות מערכת אורגנואידית תלת-ממדית כדי לשחזר את סוגי התאים האזוריים. שיטות דומות פותחו עבור ניתוח תפקודי ומידול מחלות של תאי אפיתל ממערכות איברים אחרות 18,19,20,21. שיטות אלה מספקות פלטפורמה לזיהוי תאי אב אפיתליאליים אזוריים, לביצוע מחקרים מכניסטיים החוקרים את הוויסות והמיקרו-סביבה שלהם, ולאפשר מידול מחלות וגילוי תרופות. אף על פי שמחקרים על תאי אב אפיתל ריאה המבוצעים במודלים של בעלי חיים יכולים להפיק תועלת מהניתוח, בין אם in vivo או in vitro, תובנות לגבי זהותם של תאי אב אפיתל הריאה האנושיים היו תלויות במידה רבה באקסטרפולציה של אורגניזמי מודל. ככאלה, שיטות אלה מספקות גשר לקשר בין הזהות וההתנהגות של סוגי תאי אפיתל ריאה אנושיים לבין המחקרים שלהם החוקרים ויסות של תאי גזע/אב.

Protocol

רקמת ריאה אנושית התקבלה מתורמי רקמות שנפטרו בהתאם להליכי הסכמה שפותחו על ידי המכון הבינלאומי לקידום הרפואה (IIAM) ואושרו על ידי מועצת הביקורת הפנימית של המרכז הרפואי סידרס-סיני.

1. עיבוד רקמות לבידוד תאי ריאה מאזורי קנה הנשימה-סימפונות או דרכי הנשימה/פרנכימל הקטנות (דרכי הנשימה הקטנות והנאדיות)

  1. הכן ועבד אוטומטית את כל מכשירי הנתיחה, כלי הזכוכית והפתרונות המתאימים יום אחד לפני בידוד התא.
  2. עם קבלת רקמת הריאה, לזהות ולהפריד את האזורים הפרוקסימליים והדיסטליים. קנה הנשימה והסמפונות נחשבים "פרוקסימליים". לצורך פרוטוקול זה, קנה הנשימה ו -2-3 הדורות הראשונים של הסימפונות מנותחים ומשמשים לבידוד של אפיתל דרכי הנשימה "פרוקסימלי". דרכי אוויר קטנות בקוטר של 2 מ"מ או פחות ורקמות פרנכימליות מסביב נחשבות, לצורך פרוטוקול זה, כאפיתל ריאה "דיסטלי" (איור 1A).
    הערה: כל ההליכים הכרוכים בעיבוד רקמת ריאה אנושית צריכים להתבצע בארון בטיחות ביולוגית תוך שימוש בציוד מגן אישי מתאים.

2. העשרה ותת-קבוצה של תאי אב קטנים של דרכי הנשימה והאפיתל הנאדיים מרקמת הריאה הדיסטלית

  1. הכנת רקמות דיסטליות
    1. מניחים את רקמת הריאה הדיסטלית בצלחת פטרי סטרילית (150 x 15 מ"מ). מכניסים את רקמות הקוביות לכ-1 ס"מ3 חתיכות ומניחים בצינור נקי של 50 מ"ל.
    2. לשטוף את הרקמה 3x עם HBSS צונן, להשליך HBSS לשטוף בכל פעם כדי להסיר דם ונוזל רירית אפיתל.
    3. מניחים את הרקמה בצלחת פטרי חדשה ומייבשים כתמים עם מגבונים סטריליים נגד מוך. באמצעות מלקחיים ומספריים, להסיר כמה שיותר צדר הקרביים (קרום שקוף עדין המכסה את פני השטח של הריאה).
    4. השתמש במספריים כדי לטחון רקמות לחתיכות בקוטר של כ -2 מ"מ. מעבירים רקמה טחונה לתוך צלחת פטרי נקייה וטחונים עוד יותר על ידי קיצוץ שלה לגודל משוער של 1 מ"מ עם סכין גילוח חד צדדית סטרילית.
  2. עיכול אנזימים
    הערה: תמיסת מלאי ליבראז היא 5 מ"ג/מ"ל (100x) ומלאי DNase הוא 2.5 מ"ג/מ"ל (100x) (טבלת חומרים).
    1. הוסיפו 50 מיקרוגרם/מ"ל ליבראז ו-25 מיקרוגרם/מ"ל DNase לתוך HBSS סטרילי בצינור חרוטי של 50 מ"ל.
    2. העבר כ-2-3 גרם של רקמה טחונה לצינור חרוטי חדש של 50 מ"ל עם 25 מ"ל של HBSS, המכיל ליבראז ו-DNase. דגירה למשך 40-60 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם טלטול רציף באמצעות מיקסר שנקבע ב-900 סל"ד. לאחר 30 דקות של דגירה, טריטוראט מעכל רקמה באמצעות מזרק 30 מ"ל ללא מחט כדי למנוע היווצרות של גושים ולהמשיך עם הדגירה.
      הערה: זמן הדגירה עם האנזימים יכול להשתנות בהתאם לסוג או למצב של הרקמה. לדוגמה, עיכול אנזימטי של רקמה נורמלית לוקח בערך 45 דקות. עם זאת, רקמה פיברוטית מדגימות פיברוזיס ריאתיות אידיופטיות יכולה לדרוש זמן דגירה ארוך יותר של עד 60 דקות. לכן, עקוב אחר רקמות בזהירות במהלך שלב זה כדי למנוע נזק לסמני פני השטח, וזה חיוני עבור FACS.
  3. בידוד תא יחיד
    1. טריטורציה של הרקמה על ידי ציור פי 5 דרך מחט 16 גרם המותאמת למזרק של 30 מ"ל. משכו את תרחיף הרקמה לתוך פיפטה רחבת-נשאו ועברו דרך סדרה של מסנני תאים (500 מיקרומטר, 300 מיקרומטר, 100 מיקרומטר, 70 מיקרומטר, 40 מיקרומטר) בלחץ ואקום. שטפו את המסננת עם 20 מ"ל של מאגר HBSS+ כדי לאסוף את התאים הנותרים. את המתכון למאגר HBSS+ ניתן למצוא בטבלת החומרים.
    2. הוסיפו נפח שווה של חיץ HBSS+, לאחר 45 דקות לתפיח כדי לעכב את פעילות הליברז ולמנוע עיכול יתר.
    3. צנטריפוגה נפיצה ב 500 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C. בזהירות להסיר ולהשליך את supernatant. מוסיפים 1 מ"ל של חיץ ליזה של תאי דם אדומים (RBC) לכדור, מנדנדים בעדינות את הצינור כדי לעקור את הכדור ודוגרים על קרח במשך דקה אחת.
      הערה: הכמות והזמן בתמיסת ה-RBC lysis תלויים בגודל הכדור. חשוב לשמור על התאים על הקרח ולנטר היטב את הזמן בתמיסת RBC lysis כדי למנוע תזה של תאי מטרה. אם תזת RBC אינה מספיקה, חזור על השלב.
    4. הוסף 10-20 מ"ל של מאגר HBSS+ כדי לנטרל את מאגר lysis RBC. צנטריפוגה נפיצה ב 500 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    5. אם תאי דם אדומים משופעים (תאי רפאים) יוצרים שכבה עכורה מעל גלולת התא, מוציאים כדורית ב-10 מ"ל של מאגר HBSS+ ומכבידים על ההשעיה דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר כדי לחסל את תאי הרפאים. צנטריפוגה את התסיס ב 500 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהמשיך עם צעדים נוספים.
  4. דלדול תאי מערכת החיסון ותאי האנדותל (שלב אופציונלי)
    1. דלדל את תאי האנדותל CD31+ ותאי מערכת החיסון CD45+ ממאגר התאים הכולל באמצעות המיקרובים CD31 ו-CD45 המצומדים לנוגדן CD31 ו-CD45 חד-שבטי אנטי-אנושי (איזוטיפ עכבר IgG1) ועמודות LS בהתאם לפרוטוקול היצרן (טבלת החומרים).
    2. לאסוף את הזרימה דרך, המורכבת בעיקר של תאים אפיתליאליים וסטרומליים, בצינור סטרילי טרי וצנטריפוגה אותו ב 500 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (64 °F). בצע ספירת תאים כדי לוודא את המספר הכולל של התאים בזרימה.
  5. צביעת פני השטח של התא לצורך מיון תאים הקשורים לפלואורסצנציה (FACS)
    1. Resuspend 1 x 107 תאים לכל 1 מ"ל של מאגר HBSS+ . הוסיפו נוגדנים ראשוניים בריכוז הנדרש ודגרו את התאים במשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך. במחקר זה נעשה שימוש בנוגדנים ראשוניים מצומדים של פלואורופור, אלא אם כן צוין אחרת. פרטים על מקורות נוגדנים וטיטרים מתוארים בטבלת החומרים.
      הערה: HTII-280 הוא כיום הנוגדן הריאקטיבי הטוב ביותר על פני השטח המאפשר תת-קבוצה של תאי ריאה דיסטליים לשברי תאים בעיקר בדרכי הנשימה (HTII-280-) ובסוג 2 (HTII-280+). אזהרה לאסטרטגיה זו היא שתאי AT1 אינם מוכתמים בשיטה זו והם מיוצגים בצורה גרועה בשל שבריריותם. עם זאת, תאי AT1 מיוצגים בצורה גרועה בפגמי ריאות דיסטליים, ככל הנראה בשל שבריריותם ואובדןם במהלך בחירת תאים בני קיימא על ידי FACS ולכן מייצגים רק מזהם נדיר של שבר תאי דרכי הנשימה.
    2. שטפו תאים על ידי הוספת 3 מ"ל של חיץ HBSS+ וצנטריפוגה ב-500 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    3. אם משתמשים בנוגדנים ראשוניים לא מחוברים, יש להוסיף את הריכוז הנדרש של נוגדן משני מצומד פלואורופור מתאים ולדגום במשך 30 דקות על קרח. שטפו את עודפי הנוגדנים המשניים על ידי הוספת 3 מ"ל של חיץ וצנטריפוגה HBSS+ ב-500 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    4. יש להשליך את תאי העל-טבעי וההחייאה במאגר HBSS+ לכל 1 x 107 תאים/מ"ל. סנן תאים לתוך צינורות פוליסטירן 5 מ"ל דרך מכסה מסננת כדי להבטיח היווצרות של תרחיף של תא בודד. הוסף DAPI (1 מיקרוגרם/מ"ל) כדי להכתים תאים חדירים (מתים).
      הערה: חיוני להשתמש בבקרות מתאימות בצבע יחיד ופלואורסצנציה מינוס אחת (FMO) (כלומר, קוקטייל צביעת נוגדנים מינוס נוגדן אחד כל אחת), כדי למזער תוצאות חיוביות כוזבות במהלך FACS. במחקר זה, חרוזי בחירה חיוביים ושליליים שימשו לפיצוי אמפירי לחפיפה של ספקטרום פליטה בין פלואורופורים (טבלת חומרים). FACS מעשירים סוגי תאים בעלי עניין. תאי אפיתל בני קיימא מועשרים על סמך הפנוטיפ של פני השטח של תאי CD45-negative, CD31-negative, CD236-חיובי, וכתמים שליליים עבור DAPI. ניתן לתת-חלק זה של תאי אפיתל על סמך צביעה עבור סמני פני שטח ספציפיים לסוג התא, כגון צביעה ספציפית עבור תאים חיוביים HTII-280 המועשרים עבור תאי AT2. לעומת זאת, בחירה שלילית של HTII-280 מאפשרת העשרה של תאי אפיתל קטנים של דרכי הנשימה, כגון תאי מועדון ותאים מצויים (איור 2).

3. העשרה ותת-קבוצה של תאי אב אפיתליאליים מדרכי הנשימה של קנה הנשימה-סימפונות

  1. הכנת רקמות
    1. נתחו את דרכי הנשימה הפרוקסימליות (קנה הנשימה/ברונכי) מהריאות. פתח את דרכי הנשימה לאורכן באמצעות מספריים כדי לחשוף את הלומן ולהוסיף 50 מיקרוגרם /מ"ל ליבראז כדי לכסות באופן מלא את הרקמה.
    2. דגירה למשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם טלטול רציף באמצעות מיקסר תרמו שנקבע ב-900 סל"ד.
    3. הסר את נתיב האוויר הפרוקסימלי מצינור הצנטריפוגה והנח אותו בצלחת פטרי סטרילית (150 x 15 מ"מ). יש לגרד בעדינות את פני השטח של דרכי הנשימה באמצעות אזמל כדי להסיר לחלוטין את תאי האפיתל הלומינליים מהרקמה.
    4. שטפו את צלחת פטרי עם 5 מ"ל של חיץ HBSS+ סטרילי כדי לאסוף את כל תאי האפיתל הלומינליים המנותקים ולהעביר את התאים המנותקים לצינור צנטריפוגה חרוטית של 50 מ"ל. טריטור את המתלים על ידי משיכת מחט 5x עד 16 G ומחט 18 G המותאמת למזרק 10 מ"ל כדי לקבל מתלים של תא יחיד.
    5. צנטריפוגה את המתלים ב 500 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C. בצעו החייאה של הכדור בחיץ HBSS+ טרי ואחסנו את תאי דרכי הנשימה הלומינליים האלה על קרח, מוכנים לשילוב עם תרחיף התא הבודד שנוצר מדרכי הנשימה הפרוקסימליות הטחונות בשלבים הקרובים.
    6. באמצעות מספריים, חותכים את רקמת קנה הנשימה-סימפונות שנותרה לאורך הטבעות שלה כדי ליצור רצועות קטנות של רקמה, ומעבירים את הרצועות לצלחת פטרי טרייה. טחנו את פסי הרקמה באמצעות סכין גילוח חד צדדית כדי ליצור חתיכות קטנות יותר.
      הערה: מכיוון שדרכי הנשימה הפרוקסימליות הן סחוס, לא ניתן לטחון אותן באותה מידה כמו רקמת הריאה הדיסטלית.
    7. מעבירים את הרקמה הטחונה לצינורות C, מוסיפים 2 מ"ל של ליבראז לצינור ומבטיחים שהרקמה שקועה. טען את צינור C על הדיסוציאטור האוטומטי והפעל את פרוטוקול הריאות האנושיות-2 כדי לנתק עוד יותר את הרקמה באופן מכני.
      הערה: הדיסוציאטור המשמש בפרוטוקול זה מציע תוכנית מותאמת הנקראת פרוטוקול ריאה אנושית-2 עבור יישום ספציפי זה (ראה טבלת חומרים).
  2. עיכול אנזימים ובידוד של תאים בודדים
    1. העבר כ-2 גרם של רקמה פרוקסימלית טחונה מצינור C לכל צינור צנטריפוגה חרוטית של 50 מ"ל והוסף 50 מיקרוגרם/מ"ל ליבראז ו-25 מיקרוגרם/מ"ל תמיסת DNase לכל צינור.
      הערה: כדי להבטיח דיסוציאציה יעילה, אין למלא צינורות מעבר ל-30 מ"ל.
    2. דגירה של הרקמה הטחונה למשך 45 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם רעידות מתמשכות באמצעות מיקסר שנקבע ב-900 סל"ד.
    3. מעבירים את תרחיף הרקמה המנותקת דרך סדרה של מסנני תאים (500 מיקרומטר, 300 מיקרומטר, 100 מיקרומטר, 70 מיקרומטר, 40 מיקרומטר) בלחץ ואקום כאמור לעיל ואוספים את הזרימה. שטפו את המסננת עם 20 מ"ל של מאגר HBSS+ כדי לאסוף את התאים הנותרים.
      הערה: מכיוון שרקמה פרוקסימלית היא סחוסית ומגושמת בהשוואה לרקמה הדיסטלית, קיימת אפשרות גבוהה יותר לסתימת המסננים. שימוש במשפך יכול לסייע במניעת הצפה של הנוזל תוך כדי מעבר דרך המסננים.
    4. הוסיפו נפח שווה של חיץ HBSS+ לתסיס כדי לעכב את פעילות ליבראז ולמנוע עיכול יתר. הוסיפו את תאי דרכי הנשימה הפרוקסימליים הלומינליים המבודדים מ-3.1.5 לתרחיף התא בשלב זה.
    5. צנטריפוגה מתלה התא המשולב ב 500 x g במשך 10 דקות. הסר את חומר העל וחזור על שטיפת התאים ב- HBSS+ buffer. בצע דלדול של תאי מערכת החיסון CD45+ ותאי אנדותל CD31+ כפי שצוין לעיל ב-2.4 (שלב אופציונלי).
    6. שיטות לצביעה דומות לרקמת ריאה דיסטלית, בצע את השלבים ב 2.5. העשר תאי אפיתל בני קיימא בהתבסס על הפנוטיפ של פני השטח של תאי CD45 שליליים, נגטיבים ל-CD31, חיוביים ל-CD236, וכתמים שליליים עבור DAPI.
    7. תת-קבוצה נוספת של שבר תא האפיתל מבוססת על צביעה עבור סמני פני שטח ספציפיים לסוג התא, כגון NGFR, המאפשרת העשרה של סוגי תאים בסיסיים (חיוביים ל-NGFR) ולא-בסיסיים (NGFR שליליים; הפרשה, ציליציה, נוירואנדוקרינית) (איור 3).

4. תרבית אורגנואידית

  1. הוסף 5,000 (ניתן להתאים מספר זה כדי להניב את הצפיפות הרצויה של אורגנואידים אפיתליאליים) תאי אפיתל פרוקסימליים או דיסטליים ממוינים לצינור סטרילי של 1.5 מ"ל יחד עם 7.5 x 104 תאי MRC-5 (קו תאים פיברובלסטים של ריאה אנושית). אינטראקציות אפיתל-מזנכימליות הן קריטיות להתרחבות של תאי אב.
  2. צנטריפוגה ב 500 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    הערה: חשוב לאשר באופן ידני את ספירת התאים המתקבלת מהממיינה על מנת להבטיח דיוק של יעילות יצירת מושבה אורגנואידית.
  3. מסירים ומשליכים בזהירות את הסופרנאטנט ומחזירים את גלולת התא ב-50 μL של מדיה קרה כקרח בתוספת אנטיביוטיקה. השאירו את מתלי התא על הקרח.
  4. הוסיפו 50 μL של מקדם גדילה קר כקרח פי 1 מדולדל מדיום מטריצת ממברנת המרתף לבקבוקון וטפטפו בעדינות את התרחיף על הקרח כדי לערבב.
    הערה: חשוב להשתמש במדיה קרה כקרח ולשמור על תאים על קרח כדי למנוע פילמור מוקדם של מדיום מטריצת קרום המרתף.
  5. מעבירים את תרחיף התא לתרבית תאים בגודל 0.4 מיקרומטר בגודל נקבובית בצלחת של 24 בארות (1.4 x 104 תאים/סמ"ר2), תוך הקפדה על הימנעות מהכנסת בועות אוויר.
  6. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30-45 דקות כדי לאפשר למטריצה להתמצק.
  7. הוסף 600 μL של מדיום צמיחה מחומם מראש לבאר.
    הערה: המדיה נוספה לחומרים אנטי-מיקוטיים (0.4%) וסטרפ עט (1%) במשך 24 השעות הראשונות לאחר הזריעה ומעכב 10 μM Rho kinase במשך 72 השעות הראשונות.
  8. תרבית ב 37 °C (84 °F) בחממה 5% CO2 במשך 30 יום, שבמהלכם יש לשנות את המדיה כל 48 שעות.
    הערה: ניתן לשנות את משך התרבית בהתבסס על מטרת הניסוי. נקודות קצה ארוכות יותר משמשות לחקר הבחנה ואילו ניתן להשתמש בנקודות קצה קצרות יותר של 7 ימים, 14 ימים וכו ', אם מטרת הניסוי אינה להשיג התמיינות מלאה.
  9. הוסיפו מעכב TGFβ של 10 μM למדיית התרבית למשך 15 יום כדי לשמור על התאים בשלב ההתפשטות ולדכא צמיחת יתר של פיברובלסטים.
    הערה: התוצאות שונות בהתאם למדיום התרבות המשמש לבדיקה. לדוגמה, התוצאות המוצגות כאן נוצרו באמצעות Pneumacult-ALI Medium, מה שמביא ליצירת אורגנואידים גדולים מריאה דיסטלית, אורגנואידים מובחנים היטב וגדולים יותר מריאה פרוקסימלית.

5. צביעה אורגנואידית

  1. תיקון והטבעה של אורגנואידים
    1. שאפו לתקשורת מתאי הכניסה הטרנס-ממברנה העליונים והתחתונים ושטפו פעם אחת עם PBS חם.
    2. תקן את התרביות על ידי הצבת 300 μL של PFA (2% w/v) בנספח ו-500 μL בבאר למשך שעה אחת ב-37°C. יש להסיר את הקיבוע ולשטוף עם PBS חם תוך הקפדה שלא לנתק את תקע מטריצת הממברנה של basememt.
      הערה: ניתן לאחסן אורגנואידים קבועים שקועים ב- PBS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע עד שבועיים לפני תחילת צעדים נוספים.
    3. לשאוף PBS, להפוך את ההוספה ולחתוך בזהירות את קרום ההחדרה סביב הפריפריה שלה. באמצעות מלקחיים, להסיר קרום transwell, תוך הקפדה לא להפריע לתקע המטריצה.
    4. בצלחת פטרי, הקש על התוספת כדי לשחזר את תקע המטריצה.
    5. הוסיפו טיפה של ג'ל לעיבוד דגימות כגון היסטוגל (מתוחזק ב-37 מעלות צלזיוס) לתקע המטריצה ושמרו על 4 מעלות צלזיוס עד שהג'ל יתמצק.
    6. מעבירים את התקע לקלטת הטמעה, מייבשים את התייבשות באמצעות ריכוזים הולכים וגדלים של אתנול (70, 90 ו-100%), שקופים בקסילן ומטביעים בשעווה פרפין.
    7. חתכו מקטעים של 7 מיקרומטר על מיקרוטום ואספו על שקופיות טעונות חיובית.
  2. צביעה אימונופלואורסצנטית של אורגנואידים
    1. הניחו שקופיות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עד ל-dewax.
    2. Deparaffinize את החלקים על ידי טבילה בקסילן rehydrate באמצעות ירידה בריכוזים של אתנול.
    3. בצע שליפת אנטיגן בטמפרטורה גבוהה בתמיסת חשיפת אנטיגן, בסיס חומצת לימון באמצעות רטריבר זמין מסחרית על ידי טבילת שקופיות בתמיסה במשך 15 דקות (טבלת חומרים).
    4. הקיפו את הרקמה במחסום הידרופובי באמצעות עט פאפ.
    5. לחסום צביעה לא ספציפית בין הנוגדנים הראשוניים לרקמה, על ידי דגירה במאגר חסימה.
    6. חתכי דגירה בריכוז המתאים של נוגדנים ראשוניים מדוללים בתמיסת הדגירה בן לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בתא לח.
    7. יש לשטוף את המקטעים פי 3 בטמפרטורת החדר באמצעות מאגר כביסה.
    8. דגירה בריכוז המתאים של נוגדן משני מצומד פלואורוכרום למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
    9. שטיפת מקטעים 3x בטמפרטורת החדר עם 0.1% Tween 20-TBS. מקטעי דגירה למשך 5 דקות ב- DAPI (1 מיקרוגרם / מ"ל). יש לשטוף מקטעים פעם אחת ב-TBS (מי מלח עם חציצה משולשת) עם 0.1% Tween 20, יבשים ומורכבים בתמיסת הרכבה (איור 4 ואיור 5).
      הערה: מקור ודילול עבודה אופטימלי של נוגדנים ראשוניים ומשניים המשמשים לצביעת אימונופלואורסצנציה כלולים בטבלת החומרים.

תוצאות

מקור רקמת הריאה
קנה הנשימה והסמפונות החוץ-פולמונריים (איור 1A) שימשו כרקמה המקור לבידוד תאי אפיתל פרוקסימליים של דרכי הנשימה ולדור הבא של אורגנואידים פרוקסימליים. רקמת ריאה דיסטלית הכוללת גם פרנכימה וגם דרכי אוויר קטנות בקוטר של פחות מ-2 מ"מ (איור 1A

Discussion

אנו מתארים שיטה אמינה לבידוד של תת-אוכלוסיות מוגדרות של תאי ריאה מרקמת ריאה אנושית לצורך ניתוח מולקולרי או תפקודי ומידול מחלות. אלמנטים קריטיים של שיטות כוללים את היכולת להשיג דיסוציאציה של רקמות עם שימור של אפיטופים על פני השטח, המאפשרים העשרה בתיווך נוגדנים של תאים מבודדים טריים, ואופט?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

אנו מעריכים את התמיכה של Mizuno Takako עבור צביעת IFC ו- H ו- E, ונסה גרסיה עבור חיתוך רקמות ואניקה S Chandrasekaran על עזרה בהכנת כתב יד. עבודה זו נתמכת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (5RO1HL135163-04, PO1HL108793-08) וקונסורציום Celgene IDEAL.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Isolation
10 mL Sterile syringes, Luer-Lok TipFisher scientificBD 309646
30 mL Sterile syringes, Luer-Lok TipVWRBD302832
Biohazard bagsVWR89495-440
Biohazard bagsVWR89495-440
connecting ringPluriselect41-50000-03
Deoxyribonuclease (lot#SLBF7798V)sigma AldrichDN25-1G
Disposable Petri dishesCorning/Falcon25373-187
FunnelPluriselect42-50000
HBSSCorning21-023
Liberase TM Research Gradesigma Aldrich5401127001
needle 16GVWR305198
needle 18GVWR305199
PluriStrainer 100 µm (Cell Strainer)Pluriselect43-50100-51
PluriStrainer 300 µm (Cell Strainer)Pluriselect43-50300-03
PluriStrainer 40 µm (Cell Strainer)Pluriselect43-50040-51
PluriStrainer 500 µm (Cell Strainer)Pluriselect43-50500-03
PluriStrainer 70 µm (Cell Strainer)Pluriselect43-50070-51
Razor bladesVWR55411-050
Red Blood Cell lysis buffereBioscience00-4333-57
Equipment’s
GentleMACS C TubesMACS Miltenyi Biotec130-096-334
GentleMACS Octo DissociatorMACS Miltenyi Biotec130-095-937
Leica ASP 300s Tissue processor
LS ColumnsMACS Miltenyi Biotec130-042-401
MACS MultiStand**Miltenyi Biotech130-042-303
ThermomixerEppendorf05-412-503
ThermomixerEppendorf05-412-503
HBSS+ Buffer
Amphotericin BThermo fisher scientific152900182ml
EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-freeThermo fisher scientificAM9260G500µl
Fetal Bovine SerumGemini Bio-Products100-10610ml
HBSS Hank's Balanced Salt Solution 1X 500 mlVWR45000-456500ml bottle
HEPES (1 M)Thermo fisher scientific156300805ml
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic MixtureThermo fisher scientific156400555ml
List of antibodies for FACS
Alexa Fluor 647 anti-human CD326 (EpCAM) AntibodyBioLegend3698201:50
BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Negative control particles setFisher ScientificBDB552843
CD31 MicroBead Kit, humanMiltenyi Biotec130-091-93520µl/ 107 total cells
CD45 MicroBeads, humanMiltenyi Biotec130-045-80120µl/ 107 total cells
DAPISigma AldrichD9542-10MG1:10000
FITC anti-human CD235aBioLegend3491041:100
FITC anti-human CD31BioLegend3031041:100
FITC anti-human CD45BioLegend3040541:100
FITC anti-mouse IgM AntibodyBioLegend4065061:500
Mouse IgM anti human HT2-280Terrace BiotechTB-27AHT2-2801:300
PE anti-human CD271(NGFR)BioLegend3451061:50
Composition of Organoid Culture mediums
MRC-5ATCCCCL-171
PneumaCult -ALI MediumStemcell Technologies5001
Small Airway Epithelial Cell Growth MediumPromoCellC-21170
ThinCert Tissue Culture Inserts, SterileGreiner Bio-One662641
Y-27632 (ROCK inhibitor) 100mM stock (1000x)Stemcell Technologies72302
Mouse Basal medium:
Amphotericin BThermo fisher scientific1529001850 µl
DMEM/F-12, HEPESThermoFisher scientific1133003250 ml
Fetal Bovine SerumGemini Bio-Products100-1065 ml
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100X)ThermoFisher scientific41400045500 µl
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic MixtureThermo fisher scientific15640055500 µl
SB431542 TGF-β pathway inhibitor (stock 100 mM)Stem cell722345 µl
List of antibodies for Immunohistochemistry
Antigen unmasking solution, citric acid basedVectorH-3300937 µl in 100ml water
HistogelThermo ScientificHG-4000-012
Primary Antibodies
Anti HT2-280TerracebiotechTB-27AHT2-2801:500
FOXJ1 Monoclonal Antibody (2A5)Thermo Fisher Scientific14-9965-821:300
Human Uteroglobin/SCGB1A1 AntibodyR and D systemsMAB42181:300
Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified [Poly9059]Biolegend9059011:500
MUC5AC Monoclonal Antibody (45M1)Thermo Fisher ScientificMA5-121781:300
PDPN / Podoplanin Antibody (clone 8.1.1)LifeSpan BiosciencesLS-C143022-1001:300
Purified Mouse Anti-E-CadherinBD biosciences6101821:1000
Sox-2 AntibodySanta Cruz biotechnologiessc-3659641:300
Secondary Antibodies
Donkey anti-rabbit lgG, 488Thermo Fisher ScientificA-212061:500
FITC anti-mouse IgM AntibodyBioLegend4065061:500
Goat anti-Hamster IgG (H+L), Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-211131:500
Goat anti-Mouse IgG1 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-211211:500
Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-211311:500
Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA-211341:500
Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA-211441:500
Buffers
Immunohistochemistry Blocking Solution3% BSA, o.4% Triton-x100 in TBS (Tris based saline)
Immunohistochemistry Incubation Solution3% BSA, ).1% Triton-X100 in TBS
Immunohistochemistry Washing SolutionTBS with 0.1% Tween 20

References

  1. Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
  2. Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
  3. Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
  4. Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
  5. Barkauskas, C. E., et al. Lung organoids: current uses and future promise. Development. 144 (6), 986-997 (2017).
  6. Leeman, K. T., Fillmore, C. M., Kim, C. F. Lung Stem and Progenitor Cells in Tissue Homeostasis and Disease. Stem Cells in Development and Disease. 107, 207-233 (2014).
  7. Rawlins, E. L., et al. The Role of Scgb1a1(+) Clara Cells in the Long-Term Maintenance and Repair of Lung Airway but Not Alveolar, Epithelium. Cell Stem Cell. 4 (6), 525-534 (2009).
  8. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
  9. Chang, W. I., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. Plos Genetics. 4 (4), 1000050 (2008).
  10. McQualter, J. L., Bertoncello, I. Concise Review: Deconstructing the Lung to Reveal Its Regenerative Potential. Stem Cells. 30 (5), 811-816 (2012).
  11. Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a Biomarker Specific to the Apical Plasma Membrane of Human Lung Alveolar Type II Cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (10), 891-901 (2010).
  12. Rock, J. R., et al. Notch-Dependent Differentiation of Adult Airway Basal Stem Cells. Cell Stem Cell. 8 (6), 639-648 (2011).
  13. Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell and Tissue Research. 352 (1), 123-131 (2013).
  14. Hynds, R. E., Giangreco, A. Concise Review: The Relevance of Human Stem Cell-Derived Organoid Models for Epithelial Translational Medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
  15. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), (2014).
  16. Weber, C. Organoids test drug response. Nature Cell Biology. 20 (6), 634 (2018).
  17. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
  18. Nikolic, M. Z., Rawlins, E. L. Lung Organoids and Their Use To Study Cell-Cell Interaction. Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).
  19. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  20. Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nature Methods. 2 (5), 333-336 (2005).
  21. Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-961 (2014).
  22. Teisanu, R. M., et al. Functional analysis of two distinct bronchiolar progenitors during lung injury and repair. American Journal of Respiratory and Cellular Molecular Biology. 44 (6), 794-803 (2011).
  23. Chen, H., et al. Airway epithelial progenitors are region specific and show differential responses to bleomycin-induced lung injury. Stem Cells. 30 (9), 1948-1960 (2012).
  24. Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
  25. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  26. Jain, A., et al. Primary Human Lung Alveolus-on-a-chip Model of Intravascular Thrombosis for Assessment of Therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
  27. Mulay, A., et al. SARS-CoV-2 infection of primary human lung epithelium for COVID-19 modeling and drug discovery. bioRxiv. , (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

161IIFACS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved