Isolamento e arricchimento di cellule progenitrici epiteliali polmonari umane per la coltura di organoidi

Riepilogo

Questo articolo fornisce una metodologia dettagliata per la dissociazione dei tessuti e gli approcci di frazionamento cellulare che consentono l'arricchimento di cellule epiteliali vitali dalle regioni prossimali e distali del polmone umano. Qui questi approcci sono applicati per l'analisi funzionale di cellule progenitrici epiteliali polmonari attraverso l'uso di modelli di coltura di organoidi 3D.

Abstract

I modelli organoidi epiteliali servono come strumenti preziosi per studiare la biologia di base di un sistema di organi e per la modellazione delle malattie. Se coltivate come organoidi, le cellule progenitrici epiteliali possono auto-rinnovarsi e generare progenie differenziante che mostra funzioni cellulari simili a quelle delle loro controparti in vivo . Qui descriviamo un protocollo passo-passo per isolare i progenitori specifici della regione dal polmone umano e generare colture organoidi 3D come strumento sperimentale e di convalida. Definiamo le regioni prossimali e distali del polmone con l'obiettivo di isolare le cellule progenitrici specifiche della regione. Abbiamo utilizzato una combinazione di dissociazione enzimatica e meccanica per isolare le cellule totali dal polmone e dalla trachea. Specifiche cellule progenitrici sono state quindi frazionate dalle cellule di origine prossimale o distale utilizzando lo smistamento cellulare associato alla fluorescenza (FACS) basato su marcatori di superficie specifici del tipo cellulare, come NGFR per lo smistamento delle cellule basali e HTII-280 per lo smistamento delle cellule alveolari di tipo II. I progenitori basali o alveolari isolati di tipo II sono stati utilizzati per generare colture organoidi 3D. Sia i progenitori distali che quelli prossimali formavano organoidi con un'efficienza di formazione della colonia del 9-13% nella regione distale e del 7-10% nella regione prossimale quando placcati 5000 cellule / pozzetto il giorno 30. Gli organoidi distali hanno mantenuto le cellule alveolari di tipo II HTII-280⁺ in coltura, mentre gli organoidi prossimali si sono differenziati in cellule ciliate e secretorie entro il giorno 30. Queste colture organoidiche 3D possono essere utilizzate come strumento sperimentale per lo studio della biologia cellulare dell'epitelio polmonare e delle interazioni mesenchimali epiteliali, nonché per lo sviluppo e la convalida di strategie terapeutiche mirate alla disfunzione epiteliale in una malattia.

Introduzione

Gli spazi aerei del sistema respiratorio umano possono essere ampiamente suddivisi in zone conduttrici e respiratorie che mediano rispettivamente il trasporto di gas e il loro successivo scambio attraverso la barriera epiteliale-microvascolare. Le vie aeree conduttrici comprendono trachea, bronchi, bronchioli e bronchioli terminali, mentre gli spazi dell'aria respiratoria comprendono bronchioli respiratori, dotti alveolari e alveoli. Il rivestimento epiteliale di questi spazi aerei cambia nella composizione lungo l'asse prossima-distale per soddisfare i requisiti unici di ogni zona funzionalmente distinta. L'epitelio pseudostratificato delle vie aeree tracheo-bronchiali è composto da tre tipi di cellule principali, basale, secretoria e ciliata, oltre ai tipi cellulari meno abbondanti tra cui pennello, neuroendocrino e ionocita ^1,2,3. Le vie aeree bronchiolari ospitano tipi di cellule epiteliali morfologicamente simili, sebbene vi siano distinzioni nella loro abbondanza e proprietà funzionali. Ad esempio, le cellule basali sono meno abbondanti all'interno delle vie aeree bronchiolari e le cellule secretorie includono una percentuale maggiore di cellule club rispetto alle cellule sierose e calici che predominano nelle vie aeree tracheo-bronchiali.  Le cellule epiteliali della zona respiratoria includono un tipo di cellule cuboidali scarsamente definito nei bronchioli respiratori, oltre alle cellule alveolari di tipo I (ATI) e di tipo II (ATII) dei dotti alveolari e degli alveoli ^1,4.

L'identità dei tipi di cellule staminali epiteliali e progenitrici che contribuiscono al mantenimento e al rinnovamento degli epiteli in ciascuna zona è descritta in modo incompleto e ampiamente dedotta da studi su modelli animali 5,6,7,8. Studi sui topi hanno dimostrato che le cellule basali delle vie aeree pseudostratificate, o le cellule club delle vie aeree bronchiolari o le cellule ATII dell'epitelio alveolare, fungono da cellule staminali epiteliali basate sulla capacità di auto-rinnovamento illimitato e differenziazione multipotente 7,9,10,11,12 . Nonostante l'incapacità di eseguire studi di tracciamento del lignaggio genetico per valutare la staminalità dei tipi di cellule epiteliali polmonari umane, la disponibilità di modelli di coltura basati su organoidi per valutare il potenziale funzionale delle cellule staminali epiteliali e progenitrici fornisce uno strumento per studi comparativi tra topo e uomo ^{13,14,15,16,17}.

Descriviamo metodi per l'isolamento di tipi di cellule epiteliali da diverse regioni del polmone umano e la loro coltura utilizzando un sistema organoide 3D per ricapitolare i tipi di cellule regionali. Metodi simili sono stati sviluppati per l'analisi funzionale e la modellazione della malattia di cellule epiteliali da altri sistemi di organi 18,19,20,21. Questi metodi forniscono una piattaforma per l'identificazione di cellule progenitrici epiteliali regionali, per eseguire studi meccanicistici che indagano la loro regolazione e microambiente e per consentire la modellazione della malattia e la scoperta di farmaci. Anche se gli studi sulle cellule progenitrici epiteliali polmonari eseguiti in modelli animali possono trarre beneficio dall'analisi, sia in vivo che in vitro, le intuizioni sull'identità delle cellule progenitrici epiteliali polmonari umane sono state in gran parte dipendenti dall'estrapolazione da organismi modello. Come tali, questi metodi forniscono un ponte per mettere in relazione l'identità e il comportamento dei tipi di cellule epiteliali polmonari umane con i loro studi che studiano la regolazione delle cellule staminali / progenitrici.

Protocollo

Il tessuto polmonare umano è stato ottenuto da donatori di tessuto deceduti in conformità con le procedure di consenso sviluppate dall'International Institute for the Advancement of Medicine (IIAM) e approvate dal Cedars-Sinai Medical Center Internal Review Board.

1. Trattamento tissutale per l'isolamento di cellule polmonari da regioni tracheo-bronchiali o piccole vie aeree / parenchimali (piccole vie aeree e alveoli)

1. Preparare e autoclave tutti gli strumenti di dissezione, vetreria e le soluzioni appropriate un giorno prima dell'isolamento cellulare.
2. Dopo aver ricevuto il tessuto polmonare, identificare e separare le regioni prossimale e distale. La trachea e i bronchi sono considerati "prossimali". Ai fini di questo protocollo, la trachea e le prime 2-3 generazioni di bronchi vengono sezionate e utilizzate per l'isolamento dell'epitelio delle vie aeree "prossimale". Le piccole vie aeree di 2 mm o meno di diametro e il tessuto parenchimale circostante sono, ai fini di questo protocollo, considerati epitelio polmonare "distale" (Figura 1A).
   NOTA: Tutte le procedure che comportano il trattamento del tessuto polmonare umano devono essere eseguite in un armadietto di biosicurezza con l'uso di adeguati dispositivi di protezione individuale.

2. Arricchimento e subimpostazione di piccole cellule progenitrici epiteliali delle vie aeree e alveolari dal tessuto polmonare distale

1. Preparazione del tessuto distale
   1. Posizionare il tessuto polmonare distale in una capsula di Petri sterile (150 x 15 mm). Tagliare il tessuto in circa 1 cm^{e 3} pezzi e metterlo in un tubo pulito da 50 ml.
   2. Lavare il tessuto 3 volte con HBSS refrigerato, scartando ogni volta il lavaggio HBSS per rimuovere il sangue e il liquido di rivestimento epiteliale.
   3. Mettere il tessuto in una nuova capsula di Petri e asciugare con salviette sterili anti-lanugine. Usando pinze e forbici, rimuovere quanta più pleura viscerale (una delicata membrana trasparente che copre la superficie del polmone) possibile.
   4. Utilizzare le forbici per tritare il tessuto in pezzi di circa 2 mm di diametro. Trasferire il tessuto tritato in una capsula di Petri pulita e tritarlo ulteriormente tagliandolo a una dimensione approssimativa di 1 mm con una lama di rasoio sterile su un solo lato.
2. Digestione enzimatica
   NOTA: la soluzione madre di Liberase è di 5 mg/mL (100x) e la DNasi è di 2,5 mg/mL (100x) (Tabella dei materiali).
   1. Aggiungere 50 μg/mL Liberase e 25 μg/mL DNasi in HBSS sterile in un tubo conico da 50 mL.
   2. Trasferire circa 2-3 g di tessuto tritato in un nuovo tubo conico da 50 mL con 25 mL di HBSS, contenente Liberase e DNasi. Incubare per 40-60 min a 37 °C con agitazione continua utilizzando un miscelatore impostato a 900 giri/min. Dopo 30 minuti di incubazione, triturare il tessuto digerito utilizzando una siringa da 30 ml senza ago per evitare la formazione di grumi e continuare con l'incubazione.
      NOTA: Il tempo di incubazione con gli enzimi può variare a seconda del tipo o delle condizioni del tessuto. Ad esempio, la digestione enzimatica del tessuto normale richiede circa 45 minuti. Tuttavia, il tessuto fibrotico da campioni di fibrosi polmonare idiopatica può richiedere un tempo di incubazione più lungo fino a 60 minuti. Pertanto, monitorare attentamente il tessuto durante questa fase per prevenire danni ai marcatori di superficie, che è fondamentale per FACS.
3. Isolamento a cella singola
   1. Triturare il tessuto disegnando 5 volte attraverso un ago da 16 G montato su una siringa da 30 ml. Aspirare la sospensione tissutale in una pipetta a foro largo e passare attraverso una serie di filtri cellulari (500 μm, 300 μm, 100 μm, 70 μm, 40 μm) sotto pressione di vuoto. Lavare il filtro con 20 ml di tampone HBSS+ per raccogliere le cellule rimanenti. La ricetta per il buffer HBSS+ può essere trovata in Tabella dei materiali.
   2. Aggiungere un volume uguale di tampone HBSS+, dopo 45 minuti al filtrato per inibire l'attività liberasa e prevenire la digestione eccessiva.
   3. Centrifugare filtrati a 500 x g per 5 min a 4 °C. Rimuovere con cura e scartare il surnatante. Aggiungere 1 mL di tampone di lisi dei globuli rossi (RBC) al pellet, scuotere delicatamente il tubo per rimuovere il pellet e incubare sul ghiaccio per 1 minuto.
      NOTA: la quantità e il tempo nella soluzione di lisi RBC dipendono dalle dimensioni del pellet. È importante mantenere le cellule sul ghiaccio e monitorare attentamente il tempo nella soluzione di lisi RBC per prevenire la lisi delle cellule bersaglio. Se la lisi dei globuli rossi è insufficiente, ripetere il passaggio.
   4. Aggiungere 10-20 ml di buffer HBSS+ per neutralizzare il buffer di lisi RBC. Centrifugare filtrati a 500 x g per 5 min a 4 °C.
   5. Se i globuli rossi lisati (cellule fantasma) formano uno strato torbido sopra il pellet cellulare, risospesare il pellet in 10 ml di tampone HBSS + e filtrare la sospensione attraverso un filtro cellulare da 70 μm per eliminare le cellule fantasma. Centrifugare il filtrato a 500 x g per 5 min a 4 °C e procedere con ulteriori passaggi.
4. Esaurimento delle cellule immunitarie e delle cellule endoteliali (fase opzionale)
   1. Esaurire le cellule endoteliali CD31⁺ e le cellule immunitarie CD45⁺ dal pool di cellule totali utilizzando le microsfere CD31 e CD45 coniugate agli anticorpi monoclonali anti-umani CD31 e CD45 (isotipo topo IgG1) e alle colonne LS in conformità con il protocollo del produttore (Tabella dei materiali).
   2. Raccogliere il flusso attraverso, costituito principalmente da cellule epiteliali e stromali, in un tubo sterile fresco e centrifugarlo a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Eseguire un conteggio delle celle per accertare il numero totale di celle nel flusso attraversato.
5. Colorazione della superficie cellulare per lo smistamento cellulare associato alla fluorescenza (FACS)
   1. Risospendare 1 x 10⁷ celle per 1 mL di buffer HBSS+. Aggiungere gli anticorpi primari alla concentrazione richiesta e incubare le cellule per 30 minuti a 4 °C al buio. In questo studio, sono stati utilizzati anticorpi primari coniugati con fluoroforo, salvo diversa indicazione. I dettagli delle fonti di anticorpi e dei titoli sono descritti nella Tabella dei materiali.
      NOTA: HTII-280 è attualmente il miglior anticorpo reattivo di superficie che consente la sottoimpostazione delle cellule polmonari distali in frazioni cellulari prevalentemente aeree (HTII-280^-) e alveolari di tipo 2 (HTII-280⁺). Un avvertimento a questa strategia è che le cellule AT1 non sono macchiate usando questo metodo e sono scarsamente rappresentate a causa della loro fragilità. Tuttavia, le cellule AT1 sono scarsamente rappresentate nelle preparazioni polmonari distali, presumibilmente a causa della loro fragilità e perdita durante la selezione delle cellule vitali da parte di FACS e quindi rappresentano solo un raro contaminante della frazione cellulare delle vie aeree.
   2. Lavare le celle aggiungendo 3 mL di tampone HBSS+ e centrifugare a 500 x g per 5 min a 4 °C.
   3. Se si utilizzano anticorpi primari non coniugati, aggiungere la concentrazione richiesta di un anticorpo secondario coniugato fluoroforo appropriato e incubare per 30 minuti sul ghiaccio. Lavare via l'eccesso di anticorpi secondari aggiungendo 3 mL di tampone HBSS+ e centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C.
   4. Scartare le cellule surnanti e risospese nel tampone HBSS+ per 1 x 10⁷ cellule/ml. Filtrare le celle in tubi di polistirene da 5 ml attraverso un tappo filtrante per garantire la formazione di una sospensione a cella singola. Aggiungere DAPI (1 μg/mL) per macchiare le cellule permeabili (morte).
      NOTA: È essenziale utilizzare controlli monocolore e fluorescenza meno uno (FMO) appropriati (ad esempio, cocktail di colorazione anticorpale meno un anticorpo ciascuno), per ridurre al minimo i falsi positivi durante la FACS. In questo studio, sono state utilizzate perle di selezione positive e negative per la compensazione empirica della sovrapposizione di spettri di emissione tra fluorofori (Table of Materials). FACS arricchisce i tipi di cellule di interesse. Le cellule epiteliali vitali sono arricchite in base al fenotipo della superficie cellulare CD45-negativo, CD31-negativo, CD236-positivo e alla colorazione negativa per DAPI. Questa frazione cellulare epiteliale può essere ulteriormente sottoinsiemizzata in base alla colorazione per marcatori di superficie specifici del tipo cellulare, come la colorazione specifica per le cellule HTII-280-positive che sono arricchite per le cellule AT2. Al contrario, la selezione negativa per HTII-280 consente l'arricchimento di piccole cellule epiteliali delle vie aeree come le cellule club e ciliate (Figura 2).

3. Arricchimento e subimpostazione di cellule progenitrici epiteliali da vie aeree tracheo-bronchiali

1. Preparazione dei tessuti
   1. Sezionare le vie aeree prossimali (trachea/bronchi) dai polmoni. Aprire le vie aeree lungo la loro lunghezza usando le forbici per esporre il lume e aggiungere 50 μg / mL Liberase per coprire completamente il tessuto.
   2. Incubare per 20 minuti a 37 °C con agitazione continua utilizzando un termoconscelatore impostato a 900 giri/min.
   3. Rimuovere le vie aeree prossimali dal tubo della centrifuga e metterlo in una capsula di Petri sterile (150 x 15 mm). Raschiare delicatamente la superficie delle vie aeree usando un bisturi per rimuovere completamente le cellule epiteliali luminali dal tessuto.
   4. Lavare la capsula di Petri con 5 mL di tampone HBSS+ sterile per raccogliere tutte le cellule epiteliali luminali spostate e trasferire le cellule spostate in un tubo conico centrifugo da 50 mL. Triturare la sospensione prelevando da 5 aghi da 16 G a 16 G e da 18 G montati su una siringa da 10 mL per ottenere una sospensione monocellulare.
   5. Centrifugare la sospensione a 500 x g per 5 min a 4 °C. Risospesciare il pellet nel tampone HBSS+ fresco e conservare queste cellule luminali delle vie aeree sul ghiaccio, pronte per essere combinate con la sospensione monocellulare generata dalle vie aeree prossimali tritate nelle prossime fasi.
   6. Usando le forbici, tagliare il tessuto tracheo-bronchiale rimanente lungo i suoi anelli per generare piccole strisce di tessuto e trasferire le strisce in una fresca capsula di Petri. Tritare le strisce di tessuto usando una lama di rasoio a lato singolo per creare pezzi più piccoli.
      NOTA: Poiché le vie aeree prossimali sono cartilaginee, non possono essere tritate finemente come il tessuto polmonare distale.
   7. Trasferire il tessuto tritato nei tubi C, aggiungere 2 mL di Liberase al tubo assicurandosi che il tessuto sia sommerso. Caricare il tubo C sul dissociatore automatico ed eseguire human lung Protocol-2 per dissociare meccanicamente il tessuto.
      NOTA: Il dissociatore utilizzato in questo protocollo offre un programma ottimizzato chiamato human lung protocol-2 per questa specifica applicazione (vedi Tabella dei materiali).
2. Digestione enzimatica e isolamento monocellulare
   1. Trasferire circa 2 g di tessuto prossimale tritato dal tubo C in ogni tubo centrifugo conico da 50 mL e aggiungere 50 μg/mL liberasi e 25 μg/mL di DNasi a ciascun tubo.
      NOTA: per garantire una dissociazione efficiente, i tubi non devono essere riempiti oltre i 30 ml.
   2. Incubare il tessuto tritato per 45 minuti a 37 °C con agitazione continua utilizzando un miscelatore impostato a 900 giri/min.
   3. Passare la sospensione tissutale dissociata attraverso una serie di filtri cellulari (500 μm, 300 μm, 100 μm, 70 μm, 40 μm) sotto pressione di vuoto come menzionato sopra e raccogliere il flusso attraverso. Lavare il filtro con 20 ml di tampone HBSS+ per raccogliere le cellule rimanenti.
      NOTA: Poiché il tessuto prossimale è cartilagineo e voluminoso rispetto al tessuto distale, vi è una maggiore possibilità di intasamento dei filtri. L'uso di un imbuto può aiutare a prevenire il trabocco del liquido durante il passaggio attraverso i filtri.
   4. Aggiungere un volume uguale di tampone HBSS+ al filtrato per inibire l'attività liberasi e prevenire la digestione eccessiva. Aggiungere le cellule luminali delle vie aeree prossimali isolate da 3.1.5 alla sospensione cellulare in questa fase.
   5. Centrifugare la sospensione cellulare combinata a 500 x g per 10 min. Rimuovere il surnatante e ripetere il lavaggio cellulare nel tampone HBSS+. Eseguire l'esaurimento delle cellule immunitarie CD45⁺ e delle cellule endoteliali CD31⁺ come menzionato sopra in 2.4 (passaggio opzionale).
   6. I metodi per la colorazione sono simili al tessuto polmonare distale, seguire i passaggi in 2.5. Arricchire le cellule epiteliali vitali in base al fenotipo della superficie cellulare CD45-negativo, CD31-negativo, CD236-positivo e alla colorazione negativa per DAPI.
   7. Ulteriore sottoinsieme della frazione cellulare epiteliale basata sulla colorazione per marcatori di superficie specifici del tipo cellulare, come NGFR, consentendo l'arricchimento di tipi di cellule basali (NGFR positive) e non basali (NGFR negative; secretorie, ciliate, neuroendocrine) (Figura 3).

4. Coltura organoide

1. Aggiungere 5.000 (questo numero può essere regolato per ottenere la densità desiderata di organoidi epiteliali) cellule epiteliali prossimali o distali selezionate in tubo sterile da 1,5 ml insieme a 7,5 x 10⁴ cellule MRC-5 (linea cellulare di fibroblasti polmonari umani). Le interazioni epiteliali-mesenchimali sono fondamentali per l'espansione delle cellule progenitrici.
2. Centrifugare a 500 x g per 5 min a 4 °C.
   NOTA: è importante confermare manualmente il conteggio delle cellule ottenuto dalla selezionatrice al fine di garantire l'accuratezza dell'efficienza di formare colonie organoidiche.
3. Rimuovere con cura ed eliminare il surnatante e risospese il pellet cellulare in 50 μL di mezzi ghiacciati integrati con antibiotici. Mantenere la sospensione cellulare sul ghiaccio.
4. Aggiungere 50 μL di ghiaccio freddo 1x fattore di crescita impoverito della membrana basale media al flaconcino e pipettare delicatamente la sospensione su ghiaccio per mescolare.
   NOTA: È importante utilizzare mezzi ghiacciati e mantenere le cellule sul ghiaccio per evitare la polimerizzazione prematura del mezzo della matrice della membrana basale.
5. Trasferire la sospensione cellulare su un inserto di coltura cellulare di dimensioni dei pori da 0,4 μm in una piastra a 24 pozzetti (1,4 x 10⁴ celle/cm²), avendo cura di evitare l'introduzione di bolle d'aria.
6. Incubare a 37 °C per 30-45 min per permettere alla matrice di solidificarsi.
7. Aggiungere 600 μL di terreno di coltura preriscaldato al pozzo.
   NOTA: Media è stato integrato con agenti antimicotici (0,4%) e pen streptococco (1%) per le prime 24 ore dopo la semina e 10 μM di inibitore della Rho chinasi per le prime 72 ore.
8. Coltura a 37 °C in un incubatore a CO_{2 al} 5% per 30 giorni, durante i quali il supporto deve essere cambiato ogni 48 ore.
   NOTA: la durata della coltura può essere modificata in base allo scopo dell'esperimento. Gli endpoint più lunghi vengono utilizzati per studiare la differenziazione, mentre gli endpoint più brevi di 7 giorni, 14 giorni, ecc., Possono essere utilizzati se lo scopo dell'esperimento non è quello di ottenere una differenziazione completa.
9. Aggiungere 10 μM di inibitore del TGFβ al terreno di coltura per 15 giorni per mantenere le cellule nella fase proliferativa e sopprimere la crescita eccessiva dei fibroblasti.
   NOTA: i risultati variano a seconda del terreno di coltura utilizzato per il test. Ad esempio, i risultati mostrati qui sono stati generati utilizzando Pneumacult-ALI Medium, che si traduce nella generazione di grandi organoidi dal polmone distale, organoidi ben differenziati e più grandi dal polmone prossimale.

5. Colorazione organoide

1. Fissaggio e incorporamento di organoidi
   1. Aspirare i fluidi dalle camere di inserimento transmembrana superiore e inferiore e risciacquare una volta con PBS caldo.
   2. Fissare le colture posizionando 300 μL di PFA (2% p/v) nell'inserto e 500 μL nel pozzetto per 1 ora a 37°C. Rimuovere il fissativo e risciacquare con PBS caldo facendo attenzione a non rimuovere il tappo della matrice di membrana basememt.
      NOTA: gli organoidi fissi possono essere conservati immersi in PBS a 4 °C per una o due settimane prima di iniziare ulteriori passaggi.
   3. Aspirare PBS, invertire l'inserto e tagliare con cura la membrana dell'inserto attorno alla sua periferia. Usando la pinza, rimuovere la membrana transwell, facendo attenzione a non disturbare il tappo della matrice.
   4. In una capsula di Petri, toccare l'inserto per recuperare la spina della matrice.
   5. Aggiungere una goccia di gel per la lavorazione del campione come Histogel (mantenuto a 37 °C) al tappo della matrice e mantenere a 4 °C fino a quando il gel non si solidifica.
   6. Trasferire la spina in una cassetta di incorporamento, disidratare attraverso concentrazioni crescenti di etanolo (70, 90 e 100%), trasparente in xilene e incorporare nella cera di paraffina.
   7. Tagliare sezioni da 7 μm su un microtomo e raccogliere su vetrini caricati positivamente.
2. Colorazione immunofluorescenza degli organoidi
   1. Posizionare i vetrini a 65 °C per 30 minuti a deceratura.
   2. Deparaffinizzare le sezioni per immersione in xilene e reidratare diminuendo le concentrazioni di etanolo.
   3. Eseguire il recupero dell'antigene ad alta temperatura in soluzione di smascheramento dell'antigene, acido citrico base utilizzando un retriever disponibile in commercio immergendo i vetrini nella soluzione per 15 minuti (Tabella dei materiali).
   4. Circondare il tessuto con una barriera idrofoba usando una pap pen.
   5. Bloccare la colorazione non specifica tra gli anticorpi primari e il tessuto, incubando in tampone bloccante.
   6. Incubare sezioni nella concentrazione appropriata di anticorpi primari diluiti in soluzione di incubazione durante la notte a 4 °C in una camera umidificata.
   7. Risciacquare le sezioni 3 volte a temperatura ambiente con un tampone di lavaggio.
   8. Incubare nella concentrazione appropriata di anticorpo secondario coniugato al fluorocromo per 1 ora a temperatura ambiente.
   9. Risciacquare le sezioni 3 volte a temperatura ambiente con 0,1% tween 20-TBS. Incubare le sezioni per 5 minuti in DAPI (1 μg/mL). Risciacquare le sezioni una volta in TBS (soluzione salina tamponata con Tris) con 0,1% tween 20, asciugare e montare in una soluzione di montaggio (Figura 4 e Figura 5).
      NOTA: La fonte e la diluizione ottimale di lavoro degli anticorpi primari e secondari utilizzati per la colorazione dell'immunofluorescenza sono incluse nella Tabella dei materiali.

Risultati

Tessuto polmonare sorgente
La trachea e il bronco extrapolmonare (Figura 1A) sono stati utilizzati come tessuto di origine per l'isolamento delle cellule epiteliali delle vie aeree prossimali e la successiva generazione di organoidi prossimali. Il tessuto polmonare distale che comprende sia il parenchima che le piccole vie aeree di diametro inferiore a 2 mm (Figura 1A) è stato utilizzato per l'isolamento di piccole cellule epiteliali delle v...

Discussione

Descriviamo un metodo affidabile per l'isolamento di sottopopolazioni definite di cellule polmonari dal tessuto polmonare umano per l'analisi molecolare o funzionale e la modellazione della malattia. Gli elementi critici dei metodi includono la capacità di ottenere la dissociazione dei tessuti con la conservazione degli epitopi superficiali, che consentono l'arricchimento mediato da anticorpi di cellule appena isolate, e l'ottimizzazione dei metodi di coltura per la generazione efficiente di organoidi epiteliali specifi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Isolation
10 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip	Fisher scientific	BD 309646
30 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip	VWR	BD302832
Biohazard bags	VWR	89495-440
Biohazard bags	VWR	89495-440
connecting ring	Pluriselect	41-50000-03
Deoxyribonuclease (lot#SLBF7798V)	sigma Aldrich	DN25-1G
Disposable Petri dishes	Corning/Falcon	25373-187
Funnel	Pluriselect	42-50000
HBSS	Corning	21-023
Liberase TM Research Grade	sigma Aldrich	5401127001
needle 16G	VWR	305198
needle 18G	VWR	305199
PluriStrainer 100 µm (Cell Strainer)	Pluriselect	43-50100-51
PluriStrainer 300 µm (Cell Strainer)	Pluriselect	43-50300-03
PluriStrainer 40 µm (Cell Strainer)	Pluriselect	43-50040-51
PluriStrainer 500 µm (Cell Strainer)	Pluriselect	43-50500-03
PluriStrainer 70 µm (Cell Strainer)	Pluriselect	43-50070-51
Razor blades	VWR	55411-050
Red Blood Cell lysis buffer	eBioscience	00-4333-57
Equipment’s
GentleMACS C Tubes	MACS Miltenyi Biotec	130-096-334
GentleMACS Octo Dissociator	MACS Miltenyi Biotec	130-095-937
Leica ASP 300s Tissue processor
LS Columns	MACS Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MultiStand**	Miltenyi Biotech	130-042-303
Thermomixer	Eppendorf	05-412-503
Thermomixer	Eppendorf	05-412-503
HBSS+ Buffer
Amphotericin B	Thermo fisher scientific	15290018	2ml
EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free	Thermo fisher scientific	AM9260G	500µl
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio-Products	100-106	10ml
HBSS Hank's Balanced Salt Solution 1X 500 ml	VWR	45000-456	500ml bottle
HEPES (1 M)	Thermo fisher scientific	15630080	5ml
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture	Thermo fisher scientific	15640055	5ml
List of antibodies for FACS
Alexa Fluor 647 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody	BioLegend	369820	1:50
BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Negative control particles set	Fisher Scientific	BDB552843
CD31 MicroBead Kit, human	Miltenyi Biotec	130-091-935	20µl/ 107 total cells
CD45 MicroBeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-801	20µl/ 107 total cells
DAPI	Sigma Aldrich	D9542-10MG	1:10000
FITC anti-human CD235a	BioLegend	349104	1:100
FITC anti-human CD31	BioLegend	303104	1:100
FITC anti-human CD45	BioLegend	304054	1:100
FITC anti-mouse IgM Antibody	BioLegend	406506	1:500
Mouse IgM anti human HT2-280	Terrace Biotech	TB-27AHT2-280	1:300
PE anti-human CD271(NGFR)	BioLegend	345106	1:50
Composition of Organoid Culture mediums
MRC-5	ATCC	CCL-171
PneumaCult -ALI Medium	Stemcell Technologies	5001
Small Airway Epithelial Cell Growth Medium	PromoCell	C-21170
ThinCert Tissue Culture Inserts, Sterile	Greiner Bio-One	662641
Y-27632 (ROCK inhibitor) 100mM stock (1000x)	Stemcell Technologies	72302
Mouse Basal medium:
Amphotericin B	Thermo fisher scientific	15290018	50 µl
DMEM/F-12, HEPES	ThermoFisher scientific	11330032	50 ml
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio-Products	100-106	5 ml
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100X)	ThermoFisher scientific	41400045	500 µl
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture	Thermo fisher scientific	15640055	500 µl
SB431542 TGF-β pathway inhibitor (stock 100 mM)	Stem cell	72234	5 µl
List of antibodies for Immunohistochemistry
Antigen unmasking solution, citric acid based	Vector	H-3300	937 µl in 100ml water
Histogel	Thermo Scientific	HG-4000-012
Primary Antibodies
Anti HT2-280	Terracebiotech	TB-27AHT2-280	1:500
FOXJ1 Monoclonal Antibody (2A5)	Thermo Fisher Scientific	14-9965-82	1:300
Human Uteroglobin/SCGB1A1 Antibody	R and D systems	MAB4218	1:300
Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified [Poly9059]	Biolegend	905901	1:500
MUC5AC Monoclonal Antibody (45M1)	Thermo Fisher Scientific	MA5-12178	1:300
PDPN / Podoplanin Antibody (clone 8.1.1)	LifeSpan Biosciences	LS-C143022-100	1:300
Purified Mouse Anti-E-Cadherin	BD biosciences	610182	1:1000
Sox-2 Antibody	Santa Cruz biotechnologies	sc-365964	1:300
Secondary Antibodies
Donkey anti-rabbit lgG, 488	Thermo Fisher Scientific	A-21206	1:500
FITC anti-mouse IgM Antibody	BioLegend	406506	1:500
Goat anti-Hamster IgG (H+L), Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	A-21113	1:500
Goat anti-Mouse IgG1 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21121	1:500
Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21131	1:500
Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-21134	1:500
Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-21144	1:500
Buffers
Immunohistochemistry Blocking Solution			3% BSA, o.4% Triton-x100 in TBS (Tris based saline)
Immunohistochemistry Incubation Solution			3% BSA, ).1% Triton-X100 in TBS
Immunohistochemistry Washing Solution			TBS with 0.1% Tween 20