Organoid Kültür için İnsan Akciğer Epitel Progenitör Hücrelerinin İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi

Özet

Bu makalede, insan akciğerinin proksimal ve distal bölgelerinden canlı epitel hücrelerinin zenginleştirilmesine izin veren doku dissosiyasyonu ve hücresel fraksiyonasyon yaklaşımları için ayrıntılı bir metodoloji sunulmaktadır. Bu yaklaşımlar, akciğer epitel progenitör hücrelerinin fonksiyonel analizi için 3D organoid kültür modelleri kullanılarak uygulanmaktadır.

Özet

Epitelyal organoid modelleri, bir organ sisteminin temel biyolojisini incelemek ve hastalık modellemesi için değerli araçlar olarak hizmet eder. Organoidler olarak yetiştirildiğinde, epitelyal progenitör hücreler kendi kendini yenileyebilir ve in vivo meslektaşlarınınkine benzer hücresel fonksiyonlar sergileyen farklılaştırıcı döller üretebilir. Burada, bölgeye özgü progenitörleri insan akciğerinden izole etmek ve deneysel ve doğrulama aracı olarak 3D organoid kültürler üretmek için adım adım bir protokol açıklanmaktadır. Akciğerin proksimal ve distal bölgelerini, bölgeye özgü progenitör hücreleri izole etmek amacıyla tanımlıyoruz. Toplam hücreleri akciğer ve trakeadan izole etmek için enzimatik ve mekanik ayrışmanın bir kombinasyonunu kullandık. Spesifik progenitör hücreler daha sonra, bazal hücreleri sıralamak için NGFR ve alveolar tip II hücreleri sıralamak için HTII-280 gibi hücre tipine özgü yüzey belirteçlerine dayanan floresan ilişkili hücre sıralama (FACS) kullanılarak proksimal veya distal orijinli hücrelerden fraksiyone edildi. 3D organoid kültürleri oluşturmak için izole bazal veya alveoler tip II progenitörler kullanıldı. Hem distal hem de proksimal progenitörler, 30. günde 5000 hücre/kuyu kaplandıklarında distal bölgede %9-13, proksimal bölgede %7-10 kolon oluşturan etkinliğe sahip organoidler oluşturdular. Distal organoidler kültürde HTII-280⁺ alveoler tip II hücrelerini korurken, proksimal organoidler 30. günde siliyer ve sekretuar hücrelere farklılaştı. Bu 3D organoid kültürler, akciğer epiteli ve epitel mezenkimal etkileşimlerinin hücre biyolojisini incelemek ve ayrıca bir hastalıkta epitel disfonksiyonunu hedefleyen terapötik stratejilerin geliştirilmesi ve doğrulanması için deneysel bir araç olarak kullanılabilir.

Giriş

İnsan solunum sisteminin hava sahaları, sırasıyla gazların taşınmasına ve daha sonra epitel-mikrovasküler bariyer boyunca değişimine aracılık eden iletken ve solunum bölgelerine ayrılabilir. İletken hava yolları trakea, bronşlar, bronşiyoller ve terminal bronşiyolleri içerirken, solunum hava boşlukları solunum bronşiyolleri, alveoler kanallar ve alveolleri içerir. Bu hava sahalarının epitel astarı, fonksiyonel olarak farklı her bölgenin benzersiz gereksinimlerini karşılamak için proksimo-distal eksen boyunca kompozisyonda değişir. Trakeo-bronşiyal hava yollarının psödostratifiye epiteli, fırça, nöroendokrin ve iyonosit ^1,2,3 dahil olmak üzere daha az miktarda hücre tipine ek olarak^, bazal, salgı ve siliyer olmak üzere üç ana hücre tipinden oluşur. Bronşiyoler hava yolları, morfolojik olarak benzer epitel hücre tiplerini barındırır, ancak bolluklarında ve fonksiyonel özelliklerinde farklılıklar vardır. Örneğin, bazal hücreler bronşiyoler hava yollarında daha az bulunur ve salgı hücreleri, trakeo-bronşiyal hava yollarında baskın olan seröz ve kadeh hücrelerine karşı kulüp hücrelerinin daha büyük bir bölümünü içerir.  Solunum bölgesinin epitel hücreleri, alveoler kanalların ve alveollerin alveoler tip I (ATI) ve tip II (ATII) hücrelerine ek olarak, solunum bronşiyollerinde kötü tanımlanmış bir küboidal hücre tipini içerir ^1,4.

Her bölgede epitelin korunmasına ve yenilenmesine katkıda bulunan epitel kök ve progenitör hücre tiplerinin kimliği eksik tanımlanmıştır ve büyük ölçüde hayvan modellerinde yapılan çalışmalardan çıkarılmıştır 5,6,7,8. Farelerde yapılan çalışmalar, psödotabakatize hava yollarının bazal hücrelerinin veya bronşiyoler hava yollarının kulüp hücrelerinin veya alveoler epitelin ATII hücrelerinin, sınırsız kendini yenileme ve multipotent farklılaşma kapasitesine dayanan epitel kök hücreleri olarak işlev gördüğünü göstermiştir 7,9,10,11,12 . İnsan akciğer epitel hücre tiplerinin köklülüğünü değerlendirmek için genetik soy izleme çalışmalarının yapılamamasına rağmen, epitel kök ve progenitör hücrelerin fonksiyonel potansiyelini değerlendirmek için organoid bazlı kültür modellerinin mevcudiyeti, fare ve insan arasındaki karşılaştırmalı çalışmalar için bir araç sağlamaktadır^{13,14,15,16,17}.

Epitel hücre tiplerinin insan akciğerinin farklı bölgelerinden ve kültürlerinden izole edilmesi için bölgesel hücre tiplerini özetlemek için 3D organoid sistem kullanarak yöntemleri açıklıyoruz. Diğer organ sistemlerinden epitel hücrelerinin fonksiyonel analizi ve hastalık modellemesi için de benzer yöntemler geliştirilmiştir 18,19,20,21. Bu yöntemler, bölgesel epitel progenitör hücrelerinin tanımlanması, regülasyonlarını ve mikroçevrelerini araştıran mekanik çalışmalar yapmak, hastalık modellemesi ve ilaç keşfini sağlamak için bir platform sağlar. Hayvan modellerinde yapılan akciğer epitel progenitör hücreleri üzerine yapılan çalışmalar, in vivo veya in vitro analizden yararlanabilse de, insan akciğer epitelyal progenitör hücrelerinin kimliğine ilişkin bilgiler büyük ölçüde model organizmalardan ekstrapolasyona bağlı olmuştur. Bu nedenle, bu yöntemler, insan akciğer epitel hücre tiplerinin kimliğini ve davranışını, kök / progenitör hücrelerin düzenlenmesini araştıran çalışmaları ile ilişkilendirmek için bir köprü sağlar.

Protokol

İnsan akciğer dokusu, ölen doku bağışçılarından, Uluslararası Tıbbın İlerlemesi Enstitüsü (IIAM) tarafından geliştirilen ve Cedars-Sinai Tıp Merkezi İç İnceleme Kurulu tarafından onaylanan rıza prosedürlerine uygun olarak elde edilmiştir.

1. Akciğer hücrelerinin trakeo-bronşiyal veya küçük hava yolu/parankimal (küçük hava yolları ve alveoller) bölgelerinden izolasyonu için doku işleme

1. Tüm diseksiyon aletlerini, cam eşyaları ve uygun çözeltileri hücre izolasyonundan bir gün önce hazırlayın ve otoklav yapın.
2. Akciğer dokusunu aldıktan sonra, proksimal ve distal bölgeleri tanımlayın ve ayırın. Trakea ve bronşlar "proksimal" olarak kabul edilir. Bu protokolün amaçları doğrultusunda, trakea ve ilk 2-3 nesil bronş ekilir ve "proksimal" hava yolu epitelinin izolasyonu için kullanılır. Çapı 2 mm veya daha küçük olan küçük hava yolları ve çevresindeki parankimal doku, bu protokolün amacı doğrultusunda, "distal" akciğer epiteli olarak kabul edilir (Şekil 1A).
   NOT: İnsan akciğer dokusunun işlenmesini içeren tüm prosedürler, uygun kişisel koruyucu ekipman kullanılarak bir biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır.

2. Distal akciğer dokusundan küçük hava yolu ve alveoler epitelyal progenitör hücrelerin zenginleştirilmesi ve alt ayarlanması

1. Distal doku hazırlığı
   1. Distal akciğer dokusunu steril bir Petri kabına (150 x 15 mm) yerleştirin. Zar dokusunu yaklaşık 1^cm3 parçaya bölün ve temiz bir 50 mL tüpe yerleştirin.
   2. Dokuyu soğutulmuş HBSS ile 3 kat yıkayın, kan ve epitel astar sıvısını çıkarmak için her seferinde HBSS yıkamasını atın.
   3. Mendili yeni bir Petri kabına yerleştirin ve steril tüy önleyici mendillerle kurulayın. Forseps ve makas kullanarak, mümkün olduğunca fazla viseral plevrayı (akciğerin yüzeyini kaplayan hassas şeffaf bir zar) çıkarın.
   4. Dokuyu yaklaşık 2 mm çapında parçalara ayırmak için makas kullanın. Kıyılmış dokuyu temiz bir Petri kabına aktarın ve steril tek taraflı tıraş bıçağı ile yaklaşık 1 mm boyuta doğrayarak daha da doğrayın.
2. Enzim sindirimi
   NOT: Liberaz stok çözeltisi 5 mg/mL (100x) ve DNaz stoğu 2,5 mg/mL'dir (100x) (Malzeme Tablosu).
   1. 50 mL konik bir tüp içinde steril HBSS'ye 50 μg / mL Liberaz ve 25 μg / mL DNaz ekleyin.
   2. Yaklaşık 2-3 g kıyılmış dokuyu, Liberaz ve DNaz içeren 25 mL HBSS içeren yeni bir 50 mL konik tüpe aktarın. 900 rpm'de ayarlanmış bir mikser kullanarak sürekli çalkalama ile 37 ° C'de 40-60 dakika boyunca inkübe edin. 30 dakikalık inkübasyondan sonra, küme oluşumunu önlemek ve inkübasyona devam etmek için iğnesiz 30 mL'lik bir şırınga kullanarak sindirilmiş dokuyu tritüre edin.
      NOT: Enzimlerle kuluçka süresi, dokunun tipine veya durumuna bağlı olarak değişebilir. Örneğin, normal dokunun enzimatik sindirimi yaklaşık 45 dakika sürer. Bununla birlikte, idiyopatik pulmoner fibroz örneklerinden elde edilen fibrotik doku, 60 dakikaya kadar daha uzun bir kuluçka süresi gerektirebilir. Bu nedenle, FACS için çok önemli olan yüzey belirteçlerinin zarar görmesini önlemek için bu adımda dokuyu dikkatlice izleyin.
3. Tek hücreli izolasyon
   1. 30 mL'lik bir şırıngaya takılı 16 G'lik bir iğneden 5 kat çekerek dokuyu tritürleştirin. Doku süspansiyonunu geniş delikli bir pipete çekin ve vakum basıncı altında bir dizi hücre süzgecinden (500 μm, 300 μm, 100 μm, 70 μm, 40 μm) geçirin. Kalan hücreleri toplamak için süzgeci 20 mL HBSS+ tamponu ile yıkayın. HBSS+ tamponunun tarifi Malzeme Tablosu'nda bulunabilir.
   2. Liberaz aktivitesini inhibe etmek ve aşırı sindirimi önlemek için filtrata 45 dakika sonra eşit miktarda HBSS+ tamponu ekleyin.
   3. Santrifüj, 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de filtratlanır. Süper natantı dikkatlice çıkarın ve atın. Pelet'e 1 mL Kırmızı Kan Hücresi (RBC) lizis tamponu ekleyin, peleti yerinden çıkarmak için tüpü hafifçe sallayın ve 1 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
      NOT: RBC lizis çözeltisindeki miktar ve süre, peletin boyutuna bağlıdır. Hedef hücrelerin lizisini önlemek için hücreleri buz üzerinde tutmak ve RBC lizis çözeltisindeki zamanı dikkatlice izlemek önemlidir. RBC lizisi yetersizse, adımı tekrarlayın.
   4. RBC lizis arabelleğini nötralize etmek için 10-20 mL HBSS+ arabelleği ekleyin. Santrifüj, 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de filtratlanır.
   5. Lize kırmızı kan hücreleri (hayalet hücreler) hücre peletinin üzerinde bulutlu bir tabaka oluşturursa, peleti 10 mL HBSS+ tamponunda yeniden askıya alın ve hayalet hücreleri ortadan kaldırmak için süspansiyonu 70 μm hücre süzgecinden süzün. Filtratın 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın ve sonraki adımlarla devam edin.
4. İmmün hücrelerin ve endotel hücrelerinin tükenmesi (isteğe bağlı adım)
   1. CD31 + endotel hücrelerini ve CD45 ⁺ bağışıklık hücrelerini, üreticinin protokolüne uygun olarak monoklonal anti-insan CD31 ve CD45 antikoruna (izotip fare IgG1) ve LS sütunlarına konjuge edilmiş CD31 ve CD45 mikroboncuklarını kullanarak toplam hücre havuzundan tüketin (Malzeme Tablosu).
   2. Öncelikle epitel ve stromal hücrelerden oluşan akışı taze steril bir tüpte toplayın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın. Akıştaki toplam hücre sayısını belirlemek için bir hücre sayımı gerçekleştirin.
5. Floresanla ilişkili hücre ayıklama (FACS) için hücre yüzeyi boyama
   1. 1 mL HBSS+ arabelleği başına 1 x 10⁷ hücreyi yeniden askıya alın. Gerekli konsantrasyonda birincil antikorlar ekleyin ve hücreleri karanlıkta 4 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Bu çalışmada, aksi belirtilmedikçe florofor konjuge primer antikorlar kullanılmıştır. Antikor kaynaklarının ve titrelerin detayları Malzeme Tablosunda açıklanmıştır.
      NOT: HTII-280 şu anda distal akciğer hücrelerinin ağırlıklı olarak hava yolu (HTII-280-) ve alveoler tip 2 (^HTII-280+) hücre fraksiyonlarına alt ayarlanmasına izin veren en iyi yüzey reaktif antikorudur. Bu stratejiye bir uyarı, AT1 hücrelerinin bu yöntem kullanılarak lekelenmemesi ve kırılganlıkları nedeniyle zayıf bir şekilde temsil edilmesidir. Bununla birlikte, AT1 hücreleri, muhtemelen FACS tarafından canlı hücrelerin seçimi sırasında kırılganlıkları ve kayıpları nedeniyle distal akciğer preplerinde zayıf bir şekilde temsil edilir ve bu nedenle sadece hava yolu hücre fraksiyonunun nadir bir kirleticisini temsil eder.
   2. 3 mL HBSS+ tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın.
   3. Konjuge edilmemiş primer antikorlar kullanılıyorsa, uygun bir florofor konjuge sekonjuge sekonder antikorun gerekli konsantrasyonunu ekleyin ve buz üzerinde 30 dakika boyunca inkübe edin. 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de 3 mL HBSS+ tampon ve santrifüj ekleyerek fazla sekonder antikoru yıkayın.
   4. Üst natantı atın ve HBSS+ arabelleğindeki hücreleri 1 x 10 7 hücre/^mL başına yeniden askıya alın. Tek hücreli bir süspansiyonun oluşumunu sağlamak için hücreleri bir süzgeç kapağından 5 mL polistiren tüplere filtreleyin. Geçirgen (ölü) hücreleri boyamak için DAPI (1 μg/mL) ekleyin.
      NOT: FACS sırasında yanlış pozitifleri en aza indirmek için uygun tek renkli ve floresan eksi bir (FMO) kontrollerinin (yani, antikor boyama kokteyli eksi her biri bir antikor) kullanılması esastır. Bu çalışmada, floroforlar arasındaki emisyon spektrumlarının örtüşmesi için ampirik kompanzasyon için pozitif ve negatif seleksiyon boncukları kullanılmıştır (Malzeme Tablosu). FACS, ilgilenilen hücre tiplerini zenginleştirir. Canlı epitel hücreleri, CD45-negatif, CD31-negatif, CD236-pozitif hücre yüzey fenotipi ve DAPI için negatif boyama ile zenginleştirilir. Bu epitel hücre fraksiyonu, AT2 hücreleri için zenginleştirilmiş HTII-280-pozitif hücreler için spesifik boyama gibi, hücre tipine özgü yüzey belirteçleri için boyamaya dayanarak daha da alt kümelenebilir. Buna karşılık, HTII-280 için negatif seleksiyon, kulüp ve siliyer hücreler gibi küçük hava yolu epitel hücrelerinin zenginleşmesine izin verir (Şekil 2).

3. Trakeo-bronşiyal hava yollarından epitelyal progenitör hücrelerin zenginleştirilmesi ve alt ayarlanması

1. Doku hazırlama
   1. Proksimal hava yollarını (trakea / bronşlar) akciğerlerden diseke edin. Lümeni açığa çıkarmak için makas kullanarak uzunlukları boyunca hava yollarını açın ve dokuyu tamamen örtmek için 50 μg / mL Liberaz ekleyin.
   2. 900 rpm'de ayarlanmış bir termomikser kullanarak sürekli çalkalama ile 37 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe edin.
   3. Proksimal hava yolunu santrifüj tüpünden çıkarın ve steril bir Petri kabına (150 x 15 mm) yerleştirin. Luminal epitel hücrelerini dokudan tamamen çıkarmak için bir neşter kullanarak hava yolunun yüzeyini yavaşça kazıyın.
   4. Petri kabını, yerinden çıkmış tüm luminal epitel hücrelerini toplamak ve yerinden çıkmış hücreleri 50 mL konik santrifüj tüpüne aktarmak için 5 mL steril HBSS+ tamponu ile yıkayın. Tek hücreli süspansiyon elde etmek için 10 mL'lik bir şırıngaya takılı 5x ila 16 G iğne ve 18 G iğne çizerek süspansiyonu tritürleştirin.
   5. Süspansiyonu 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın. Peleti taze HBSS+ tamponunda yeniden askıya alın ve bu luminal hava yolu hücrelerini buz üzerinde saklayın, önümüzdeki adımlarda kıyılmış proksimal hava yollarından üretilen tek hücreli süspansiyonla birleştirilmeye hazır.
   6. Makas kullanarak, küçük doku şeritleri oluşturmak için halkaları boyunca kalan trakeo-bronşiyal dokuyu kesin ve şeritleri taze bir Petri kabına aktarın. Daha küçük parçalar yapmak için doku şeritlerini tek taraflı bir tıraş bıçağı kullanarak kıyın.
      NOT: Proksimal hava yolları kıkırdaklı olduğundan, distal akciğer dokusu kadar ince kıyılamazlar.
   7. Kıyılmış dokuyu C tüplerine aktarın, dokunun suya batırılmasını sağlamak için tüpe 2 mL Liberaz ekleyin. C tüpünü otomatik ayrıştırıcıya yükleyin ve dokuyu mekanik olarak daha da ayrıştırmak için İnsan Akciğer Protokolü-2'yi çalıştırın.
      NOT: Bu protokolde kullanılan ayrıştırıcı, bu özel uygulama için insan akciğer protokolü-2 adı verilen optimize edilmiş bir program sunar (bkz.
2. Enzim sindirimi ve tek hücre izolasyonu
   1. C tüpünden yaklaşık 2 g kıyılmış proksimal dokuyu her 50 mL konik santrifüj tüpüne aktarın ve her tüpe 50 μg / mL Liberaz ve 25 μg / mL DNaz çözeltisi ekleyin.
      NOT: Verimli ayrışmayı sağlamak için, tüpler 30 mL işaretinin ötesinde doldurulmamalıdır.
   2. Kıyılmış dokuyu 37 ° C'de 45 dakika boyunca inkübe edin ve 900 rpm'de ayarlanmış bir mikser kullanarak sürekli çalkalayın.
   3. Ayrışmış doku süspansiyonunu, yukarıda belirtildiği gibi vakum basıncı altında bir dizi hücre süzgecinden (500 μm, 300 μm, 100 μm, 70 μm, 40 μm) geçirin ve akışı toplayın. Kalan hücreleri toplamak için süzgeci 20 mL HBSS+ tamponu ile yıkayın.
      NOT: Proksimal doku, distal dokuya kıyasla kıkırdaklı ve hacimli olduğundan, filtrelerin tıkanma olasılığı daha yüksektir. Bir huni kullanmak, süzgeçlerden geçerken sıvının taşmasını önlemeye yardımcı olabilir.
   4. Liberaz aktivitesini inhibe etmek ve aşırı sindirimi önlemek için filtrata eşit miktarda HBSS+ tamponu ekleyin. İzole edilmiş luminal proksimal hava yolu hücrelerini 3.1.5'ten hücre süspansiyonuna bu adımda ekleyin.
   5. Kombine hücre süspansiyonunu 10 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj edin. Süpernatantı çıkarın ve HBSS+ arabelleğinde hücre yıkamayı tekrarlayın. CD45 ⁺ bağışıklık hücrelerinin ve CD31 ⁺ endotel hücrelerinin yukarıda 2.4'te belirtildiği gibi tükenmesini sağlayın (isteğe bağlı adım).
   6. Boyama yöntemleri distal akciğer dokusuna benzer, 2.5'teki adımları izleyin. Canlı epitel hücrelerini CD45-negatif, CD31-negatif, CD236-pozitif hücre yüzey fenotipine ve DAPI için negatif boyamaya dayanarak zenginleştirin.
   7. Ayrıca, bazal (NGFR pozitif) ve bazal olmayan (NGFR negatif; sekretuar, siliyer, nöroendokrin) hücre tiplerinin zenginleşmesine izin veren NGFR gibi hücre tipine özgü yüzey belirteçleri için boyamaya dayanan epitel hücre fraksiyonunu alt kümeleyin (Şekil 3).

4. Organoid kültür

1. 5.000 ekleyin (bu sayı istenen epitel organoid yoğunluğunu vermek için ayarlanabilir), 7.5 x 10⁴ MRC-5 hücreleri (insan akciğer fibroblast hücre hattı) ile birlikte steril 1.5 mL tüpe sıralanmış proksimal veya distal epitel hücreleri. Epitel-mezenkimal etkileşimler progenitör hücrelerin genişlemesi için kritik öneme sahiptir.
2. 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj.
   NOT: Organoid koloni oluşturma verimliliğinin doğruluğunu sağlamak için sıralayıcıdan elde edilen hücre sayısını manuel olarak onaylamak önemlidir.
3. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın ve hücre peletini antibiyotiklerle desteklenmiş 50 μL buz gibi soğuk ortamda yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu buz üzerinde tutun.
4. Flakona 50 μL buz gibi soğuk 1x büyüme faktörü tükenmiş bazal membran matris ortamı ekleyin ve karıştırmak için süspansiyonu buz üzerinde hafifçe pipetleyin.
   NOT: Bodrum membran matris ortamının erken polimerizasyonunu önlemek için buz gibi soğuk ortam kullanmak ve buz üzerindeki hücreleri korumak önemlidir.
5. Hücre süspansiyonunu, hava kabarcıklarının girmesini önlemeye özen göstererek, 24 kuyucuklu bir plakada (1,4 x 10 4 hücre/^cm2)^0,4 μm gözenek boyutunda hücre kültürü ekine aktarın.
6. Matrisin katılaşmasını sağlamak için 30-45 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
7. Kuyuya 600 μL önceden ısıtılmış büyüme ortamı ekleyin.
   NOT: Media, tohumlamadan sonraki ilk 24 saat boyunca antimikotik ajanlar (%0.4) ve Pen strep (%1) ve ilk 72 saat için 10 μM Rho kinaz inhibitörü ile desteklendi.
8. 30 gün boyunca% 5'lik bir CO₂ inkübatöründe 37 ° C'de kültür, bu süre zarfında ortam her 48 saatte bir değiştirilmelidir.
   NOT: Kültür süresi, deneyin amacına göre değiştirilebilir. Farklılaşmayı incelemek için daha uzun uç noktalar kullanılırken, deneyin amacı tam farklılaşmayı başarmak değilse, 7 gün, 14 gün vb. daha kısa uç noktalar kullanılabilir.
9. Hücreleri proliferatif fazda tutmak ve fibroblastların aşırı büyümesini baskılamak için 15 gün boyunca kültür ortamına 10 μM TGFβ inhibitörü ekleyin.
   NOT: Sonuçlar, tahlil için kullanılan kültür ortamına göre farklılık gösterir. Örneğin, burada gösterilen sonuçlar Pneumacult-ALI Medium kullanılarak üretilmiştir, bu da distal akciğerden büyük organoidlerin, proksimal akciğerden iyi diferansiye ve daha büyük organoidlerin üretilmesiyle sonuçlanır.

5. Organoid boyama

1. Organoidlerin sabitlenmesi ve gömülmesi
   1. Hem üst hem de alt transmembran kesici uç odalarından gelen ortamları aspire edin ve ılık PBS ile bir kez durulayın.
   2. 37°C'de 1 saat boyunca kesici uca 300 μL PFA (%2 w/v) ve kuyuya 500 μL yerleştirerek kültürleri sabitleyin. Fiksatifi çıkarın ve basememt membran matris tapasını yerinden çıkarmamaya dikkat ederek ılık PBS ile durulayın.
      NOT: Sabit organoidler, sonraki adımlara başlamadan önce PBS'de 4 °C'de bir ila iki hafta boyunca suya batırılmış olarak saklanabilir.
   3. PBS'yi aspire edin, kesici ucu ters çevirin ve kesici uç membranını çevresine dikkatlice kesin. Forseps kullanarak, matris tapasını rahatsız etmemeye dikkat ederek transwell membranı çıkarın.
   4. Petri kabında, matris fişini kurtarmak için kesici uca dokunun.
   5. Matris tapasına Histogel (37 °C'de tutulur) gibi bir damla Numune işleme jeli ekleyin ve jel katılaşana kadar 4 °C'de tutun.
   6. Fişi gömme bir kasete aktarın, artan etanol konsantrasyonları (% 70, 90 ve% 100) ile dehidratatın, ksilen içinde temizleyin ve parafin mumuna gömülün.
   7. Bir mikrotom üzerinde 7 μm kesitler kesin ve pozitif yüklü slaytlarda toplayın.
2. Organoidlerin immünofloresan boyanması
   1. Balmumunu temizlemek için slaytları 30 dakika boyunca 65 ° C'ye yerleştirin.
   2. Bölümleri ksilen'e daldırarak deparaffinize edin ve etanol konsantrasyonlarını azaltarak rehidratlayın.
   3. Antijen maskesini kaldırma çözeltisinde, ticari olarak temin edilebilen bir retriever kullanarak sitrik asit bazında, slaytları çözeltiye 15 dakika batırarak yüksek sıcaklıkta antijen alımı gerçekleştirin (Malzeme Tablosu).
   4. Bir pap kalem kullanarak dokuyu hidrofobik bir bariyerle çevreleyin.
   5. Birincil antikorlar ve doku arasındaki spesifik olmayan boyamayı, Bloke edici tamponda inkübe ederek bloke edin.
   6. Kapsüllenmiş bir odada 4 °C'de gece boyunca inkübasyon çözeltisinde seyreltilmiş birincil antikorların uygun konsantrasyonundaki bölümleri inkübe edin.
   7. Bölümleri bir yıkama tamponu ile oda sıcaklığında 3 kat durulayın.
   8. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca uygun florokrom konjuge sekonder antikor konsantrasyonunda inkübe edin.
   9. Bölümleri oda sıcaklığında %0,1 Ara 20-TBS ile 3 kat durulayın. bölümleri DAPI'de (1 μg/mL) 5 dakika boyunca inkübe edin. Bölümleri TBS'de (Tris tamponlu salin) %0,1 Aralık 20 ile bir kez durulayın, kurutun ve bir montaj çözeltisine monte edin (Şekil 4 ve Şekil 5).
      NOT: İmmünofloresan boyama için kullanılan primer ve sekonder antikorların kaynak ve optimal çalışma seyreltmesi Malzeme Tablosunda yer almaktadır.

Sonuçlar

Kaynak akciğer dokusu
Trakea ve ekstrapulmoner bronş (Şekil 1A) proksimal hava yolu epitel hücrelerinin ve sonraki jenerasyon proksimal organoidlerin izolasyonunda kaynak doku olarak kullanıldı. Hem parankimi hem de çapı 2 mm'den küçük küçük hava yollarını içeren distal akciğer dokusu (Şekil 1A), küçük hava yolu ve alveoler epitel hücrelerinin (distal akciğer epiteli) izolasyonu ve küçük hava yolu veya alveoler orga...

Tartışmalar

Moleküler veya fonksiyonel analiz ve hastalık modellemesi için insan akciğer dokusundan tanımlanmış akciğer hücrelerinin alt popülasyonlarının izolasyonu için güvenilir bir yöntem tanımladık. Yöntemlerin kritik unsurları, taze izole edilmiş hücrelerin antikor aracılı zenginleştirilmesine izin veren yüzey epitoplarının korunması ile doku ayrışmasını sağlama yeteneğini ve bölgeye özgü epitel organoidlerinin verimli bir şekilde üretilmesi için kültür yöntemlerinin optimizasyonunu i...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Isolation
10 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip	Fisher scientific	BD 309646
30 mL Sterile syringes, Luer-Lok Tip	VWR	BD302832
Biohazard bags	VWR	89495-440
Biohazard bags	VWR	89495-440
connecting ring	Pluriselect	41-50000-03
Deoxyribonuclease (lot#SLBF7798V)	sigma Aldrich	DN25-1G
Disposable Petri dishes	Corning/Falcon	25373-187
Funnel	Pluriselect	42-50000
HBSS	Corning	21-023
Liberase TM Research Grade	sigma Aldrich	5401127001
needle 16G	VWR	305198
needle 18G	VWR	305199
PluriStrainer 100 µm (Cell Strainer)	Pluriselect	43-50100-51
PluriStrainer 300 µm (Cell Strainer)	Pluriselect	43-50300-03
PluriStrainer 40 µm (Cell Strainer)	Pluriselect	43-50040-51
PluriStrainer 500 µm (Cell Strainer)	Pluriselect	43-50500-03
PluriStrainer 70 µm (Cell Strainer)	Pluriselect	43-50070-51
Razor blades	VWR	55411-050
Red Blood Cell lysis buffer	eBioscience	00-4333-57
Equipment’s
GentleMACS C Tubes	MACS Miltenyi Biotec	130-096-334
GentleMACS Octo Dissociator	MACS Miltenyi Biotec	130-095-937
Leica ASP 300s Tissue processor
LS Columns	MACS Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MultiStand**	Miltenyi Biotech	130-042-303
Thermomixer	Eppendorf	05-412-503
Thermomixer	Eppendorf	05-412-503
HBSS+ Buffer
Amphotericin B	Thermo fisher scientific	15290018	2ml
EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free	Thermo fisher scientific	AM9260G	500µl
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio-Products	100-106	10ml
HBSS Hank's Balanced Salt Solution 1X 500 ml	VWR	45000-456	500ml bottle
HEPES (1 M)	Thermo fisher scientific	15630080	5ml
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture	Thermo fisher scientific	15640055	5ml
List of antibodies for FACS
Alexa Fluor 647 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody	BioLegend	369820	1:50
BD CompBead Anti-Mouse Ig, K/ Negative control particles set	Fisher Scientific	BDB552843
CD31 MicroBead Kit, human	Miltenyi Biotec	130-091-935	20µl/ 107 total cells
CD45 MicroBeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-801	20µl/ 107 total cells
DAPI	Sigma Aldrich	D9542-10MG	1:10000
FITC anti-human CD235a	BioLegend	349104	1:100
FITC anti-human CD31	BioLegend	303104	1:100
FITC anti-human CD45	BioLegend	304054	1:100
FITC anti-mouse IgM Antibody	BioLegend	406506	1:500
Mouse IgM anti human HT2-280	Terrace Biotech	TB-27AHT2-280	1:300
PE anti-human CD271(NGFR)	BioLegend	345106	1:50
Composition of Organoid Culture mediums
MRC-5	ATCC	CCL-171
PneumaCult -ALI Medium	Stemcell Technologies	5001
Small Airway Epithelial Cell Growth Medium	PromoCell	C-21170
ThinCert Tissue Culture Inserts, Sterile	Greiner Bio-One	662641
Y-27632 (ROCK inhibitor) 100mM stock (1000x)	Stemcell Technologies	72302
Mouse Basal medium:
Amphotericin B	Thermo fisher scientific	15290018	50 µl
DMEM/F-12, HEPES	ThermoFisher scientific	11330032	50 ml
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio-Products	100-106	5 ml
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100X)	ThermoFisher scientific	41400045	500 µl
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture	Thermo fisher scientific	15640055	500 µl
SB431542 TGF-β pathway inhibitor (stock 100 mM)	Stem cell	72234	5 µl
List of antibodies for Immunohistochemistry
Antigen unmasking solution, citric acid based	Vector	H-3300	937 µl in 100ml water
Histogel	Thermo Scientific	HG-4000-012
Primary Antibodies
Anti HT2-280	Terracebiotech	TB-27AHT2-280	1:500
FOXJ1 Monoclonal Antibody (2A5)	Thermo Fisher Scientific	14-9965-82	1:300
Human Uteroglobin/SCGB1A1 Antibody	R and D systems	MAB4218	1:300
Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified [Poly9059]	Biolegend	905901	1:500
MUC5AC Monoclonal Antibody (45M1)	Thermo Fisher Scientific	MA5-12178	1:300
PDPN / Podoplanin Antibody (clone 8.1.1)	LifeSpan Biosciences	LS-C143022-100	1:300
Purified Mouse Anti-E-Cadherin	BD biosciences	610182	1:1000
Sox-2 Antibody	Santa Cruz biotechnologies	sc-365964	1:300
Secondary Antibodies
Donkey anti-rabbit lgG, 488	Thermo Fisher Scientific	A-21206	1:500
FITC anti-mouse IgM Antibody	BioLegend	406506	1:500
Goat anti-Hamster IgG (H+L), Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	A-21113	1:500
Goat anti-Mouse IgG1 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21121	1:500
Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21131	1:500
Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-21134	1:500
Goat anti-Mouse IgG2b Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-21144	1:500
Buffers
Immunohistochemistry Blocking Solution			3% BSA, o.4% Triton-x100 in TBS (Tris based saline)
Immunohistochemistry Incubation Solution			3% BSA, ).1% Triton-X100 in TBS
Immunohistochemistry Washing Solution			TBS with 0.1% Tween 20