تسجيلات تخطيط القلب الكهربائي في الفئران المُضجرة باستخدام الرصاص الثاني

Summary

نقدم بروتوكول تخطيط القلب الذي هو من الناحية الفنية سهلة وغير مكلفة وسريعة وبأسعار معقولة في الفئران الصغيرة، ويمكن أن يؤديها مع حساسية معززة. نقترح هذه الطريقة كمقاربة فحص لدراسة العوامل الدوائية والتعديلات الجينية ونماذج الأمراض في الفئران.

Abstract

تخطيط القلب الكهربائي هو أداة قيمة لتقييم نظام الاتّاق القلبي. وقد ساعدت البحوث الحيوانية على توليد معلومات جينية ودوائية جديدة فيما يتعلق بكهربية القلب. ومع ذلك ، فإن إجراء قياسات تخطيط القلب في الحيوانات الصغيرة في الجسم الحي ، مثل الفئران ، كان تحديًا. لتحقيق هذه الغاية، استخدمنا طريقة تسجيل تخطيط القلب في الفئران المُخدّرة مع العديد من المزايا: إنها إجراء بسيط من الناحية الفنية، وغير مكلفة، ووقت قياس قصير، وبأسعار معقولة، حتى في الفئران الصغيرة. على الرغم من القيود مع استخدام التخدير، يمكن إجراء مقارنات بين التحكم والمجموعات التجريبية مع حساسية معززة. تعاملنا مع الفئران مع ناهضين والخصوم من الجهاز العصبي اللاإرادي لتحديد صحة هذا البروتوكول وقارنا نتائجنا مع التقارير السابقة. كشف بروتوكول ECG لدينا زيادة معدلات ضربات القلب وفترات QTc على العلاج مع الأتروبين، وانخفاض معدلات ضربات القلب وفترات QTc بعد العلاج كارباكول، وارتفاع معدلات ضربات القلب وفترات QTc مع isoprenaline ولكن لم يلاحظ أي تغيير في معلمات ECG على إدارة بروبرانولول. هذه النتائج مدعومة من قبل التقارير السابقة، مما يؤكد موثوقية هذا البروتوكول ECG. وهكذا، يمكن استخدام هذه الطريقة كنهج فرز لإجراء قياسات تخطيط القلب التي لولا ذلك لن يكون محاولة بسبب ارتفاع التكلفة والصعوبات التقنية.

Introduction

يُـُـُـــــُـــــــُــــــــــــــُــــــــــــــــــــــــــيَّ مخطط القلب الكهربائي (ECG)، وهو اختبار يقيس النشاط الكهربائي لنبضات القلب، أداة قيِّمة لتقييم نظام التوصيل القلبي. تشمل المعلمات التي يتم قياسها بواسطة تخطيط القلب معدل ضربات القلب، وفاصل العلاقات العامة، ومدة QRS، وفترة QT. باختصار، يتوافق الفاصل الزمني للعلاقات العامة مع الوقت المطلوب للدافع الكهربائي للسفر من عقدة الجيوب الأنفية الأذينية عبر العقدة الأذينية إلى ألياف بوركينجي؛ مدة QRS هي الوقت المناسب لفك القطب البطيني أن يحدث من خلال نظام Purkinje و عضلة القلب البطينية; وفترة QT هي مدة إعادة قطبية البطين.

وقد ساعدت تسجيلات ECG في الفئران الباحثين على فحص وظيفة القلب وتحديد الآليات الفسيولوجية والفيزيولوجية للنمط الظاهري القلبي ، مثل عدم انتظام ضربات القلب ، والرجفان الأذيني ، وفشل القلب. وقد شملت معظم البحوث القلبية الوعائية دراسات في نماذج الماوس المعدلة وراثيا. غالبًا ما يكون من الصعب الحصول على بيانات ذات مغزى عن تسجيلات ECG من الفئران الصغيرة التي تم التلاعب بها وراثيًا.

هناك عدة طرق لتنفيذ ECGs في الفئران¹. تشير الدراسات إلى أن تسجيلات ECG في الحيوانات الواعية مفضلة على الحيوانات المخدرة عندما يكون ذلك ممكنًا منذ أن تم تأسيس آثار التخدير على وظيفة القلب². اثنين من البروتوكولات التي تسجل ECG في الفئران واعية هي من ملاحظة¹. نظام ECG القياسات الراديوية هو المعيار الذهبي لرصد مستمر على المدى الطويل من ECG في الفئران^{واعية 1،3}. على الرغم من قوتها في تسجيلها في حالة واعية، قياسات ECG ذات المقاييس المشعة مقرونة لديها عدة قيود، بما في ذلك ارتفاع النفقات للإعداد والزرع، ومتطلباتها من مشغل من ذوي الخبرة العالية، وفترة تثبيت أكثر من 1 أسبوع، حاجتها للفئران الكبيرة (> 20 غرام)، واقتناء الرصاص واحد فقط من تسجيل ECG¹. نظام آخر يستخدم أقطاب موصلة بحجم مخلب جزءا لا يتجزأ من منصة يسمح تسجيلات ECG في الفئران واعية دون تخدير أو يزرع^1،4. هذا النظام غير الغازية هو طريقة بديلة في الحالات التي نظم القياس الإشعاعي غير متوفرة نظرا لأنه لديه العديد من المزايا: لا شرط من العلاج الجراحي، لا حاجة للتخدير، وانخفاض التكلفة لكل ماوس (الإعداد الأولي فقط مكلفة)، وقت قصير للقياس، والقدرة على تحمل تكاليف حديثي الولادة^1،,4. العيب الرئيسي لهذا النظام هو أنه لا يناسب الرصد المستمر على المدى الطويل¹.

هنا نقدم طريقة أخرى غير مكلفة وبسيطة ، وسريعة ECG تسجيل في الفئران مخدر ، وتبين صحتها وحساسيتها من خلال تنفيذ تخطيط القلب بعد الحصار الذاتي / تحفيز نظام تصريف القلب. نقترح هذه الطريقة ECG لفحص آثار العوامل الدوائية، والتعديلات الجينية، ونماذج الأمراض في الفئران.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل اللجنة المحلية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، جامعة كيونغ هي (رقم الترخيص: KHUASP(SE)-18-108) ومطابقة لدليل المعاهد الوطنية للصحة الأمريكية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.

1- تجريبية

1. الحفاظ على جميع الفئران (39 الفئران، Balb / c، ذكر، 7\u20129 أسابيع) في منشأة خالية من مسببات الأمراض وفقا لتوجيه لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.
2. الحفاظ على الفئران على 12 ساعة دورة خفيفة / داكنة في درجة حرارة ثابتة مع حرية الوصول إلى الطعام والماء.

2- إعداد التخدير

ملاحظة: يستخدم ثلاثي البروموإيثانول على تركيبات الكيتامين وisoflurane، على أساس استقرار معدل ضربات القلب وإعادة إنتاج تخطيط صدى القلب في الفئران ثلاثي البرومومييثانول-تخدير^1,5,6

1. جعل حل الأسهم من 2،2،2-tribromoethanol بتركيز 1 غرام لكل 1 مل الكحول اميل الثالثية. دافئ عند 40\u201245 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. يُخزن عند 4 درجة مئوية لمدة 12 شهرًا.
2. للعمل حل، وتمييع 0.5 مل من حل الأسهم في 19.5 مل من المالحة (0.9٪ كلوريد) إلى 25 ملغ / مل. دافئة عند 40\u201245 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. يُخزن عند 4 درجة مئوية لمدة شهر واحد.

3. ECG نظام الإعداد

1. تأكد من إعداد النظام بحيث لا يوجد ضوضاء أو اهتزاز في غضون 2 متر منذ إشارات ECG في الماوس حساسة للضوضاء البيئية والحركة.
2. إعداد إعداد الأجهزة: نظام اكتساب البيانات، مكبر للصوت الحيوي، وجهاز كمبيوتر مثبت مع برنامج تحليل بيانات تخطيط القلب.
   1. قم بتوصيل نظام الحصول على البيانات بالمينايون (التيار المتردد) باستخدام كابل الطاقة.
   2. قم بتوصيل نظام الحصول على البيانات بالكمبيوتر باستخدام كبل USB.
   3. قم بتوصيل إخراج الإشارة على اللوحة الخلفية لمكبر الصوت الحيوي بمدخل تناظري على اللوحة الأمامية لنظام الحصول على البيانات باستخدام كابل.
   4. توصيل إخراج I²C من نظام الحصول على البيانات لإدخال I²C من مكبر الصوت الحيوي باستخدام كبل I²C.
   5. قم بتوصيل كابل مكبر الصوت الحيوي ثلاثية الرصاص بمأخذ الإدخال المكون من 6 دبوس على اللوحة الأمامية لمكبر الصوت الحيوي.
   6. قم بتشغيل نظام الحصول على البيانات باستخدام المفتاح في اللوحة الخلفية.
      ملاحظة: باختصار، يتم تضخيم الإشارات من خلال مكبر للصوت الحيوي وتسجّل باستخدام نظام محوسب لحيازة البيانات وتحليلها مع إعدادات القناة التالية: معدل أخذ العينات من 2 ك/س، ونطاق 20 mV، والإعداد منخفض النجاح للتصفية 200 هرتز.
3. افتح برنامج التحليل واضبطه للحصول على بيانات تخطيط القلب.
   1. الانتقال إلى الإعداد | إعدادات القناة. تعيين معدل العينة إلى 2 ك / س. تعيين المدى إلى 20 mV. تعيين مكبر الصوت المدخلات إلى 200 هرتز من ممر منخفض.
   2. اذهب إلى تحليل ECG | إعدادات تخطيط القلب. اختر "الماوس" في الإعدادات الإعداد المسبق للكشف والتحليل.
   3. في لوحة متوسط، اختر لسَلسَلة N (على سبيل المثال، 4 دقات أو 60 s) دورات القلب المتتالية في إشارة متوسط واحد لعرض المتوسط وعرض الجدول.
   4. في لوحة QTc، حدد طريقة "Bazett" ، والتي تعرف بأنها قيمة معدل ضربات القلب تصحيح الفترة QT: QTc = QT / (RR/100)^0.5، فاصل RR = 60 / معدل ضربات القلب⁷.

4. قياس ECG

1. ضع الماوس على مقياس دقيق وسجل وزنه.
2. حث التخدير في الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق (i.p.) من محلول عمل من ثلاثي البرومويثانول (18 مل من حل العمل لكل كيلوغرام من وزن الجسم (b.w.)).
3. وضع الماوس تخدير في موقف سوبين. تأكد من أن الماوس مُجَدَّد بالكامل (أقل من 2 دقيقة).
4. إدراج الأقطاب الكهربائية مع الإبر الوخز بالإبر تحت الجلد في اليمين واليسار forelimbs و hindlimb اليسار وفقا لمخطط 2 ECG الرصاص وإصلاحها مع الشريط (الشكل 1). تأكد من أن عمق وموضع الأقطاب الكهربائية المدرجة متناسقة طوال التجارب.
5. قم بتوصيل الأطراف الأخرى من الأقطاب الكهربائية بالنقر فوقها في الموصلات المفاجئة الثلاثة في الطرف الآخر من أسلاك الرصاص من كابل مكبرات الصوت الحيوي ثلاثية الرصاص.
6. المخدرات عن طريق الحقن (i.p.) 3 دقائق بعد أن تم تسليم التخدير (الشكل 2).
7. ابدأ بتسجيل 10 دقيقة من ECG بعد حقن التخدير. بمجرد الانتهاء من التسجيل، استخدم بيانات تخطيط القلب من 12 إلى 17 دقيقة بعد حقن التخدير للتحليل.
8. في نهاية جلسة تسجيل تخطيط القلب ، قم بإزالة الأقطاب الكهربائية بعناية.

5- تحليل بيانات تخطيط تخطيط كهربية القلب

1. اذهب إلى تحليل ECG | متوسط عرض والتأكد من أن البرنامج يحدد بشكل صحيح بداية ونهاية موجة P ، مجمع QRS ، و T موجة في يدق الفردية. إذا لزم الأمر، يمكن التصحيح اليدوي لهذه الموجات والفواصل الزمنية عن طريق تحريك المؤشرات في غير موضعها إلى المواضع المناسبة.
   ملاحظة: كما هو موضح في الشكل 3A، يمتد الفاصل الزمني للعلاقات العامة في بداية الموجة P إلى تلك التي من مجمع QRS (غالبًا ما يكون مفقودًا Q wave في ECG الماوس). تمتد مدة QRS من بداية موجة Q (في المقام الأول موجة R في تخطيط الماوس) إلى نهاية الموجة S. الفاصل الزمني QT يتضمن بداية موجة Q (معظمها الموجة R في الماوس ECG) إلى نهاية موجة T. لاحظ مدة أقصر وغياب موجة Q وST قطعة في ECG الماوس نسبة إلى ECG^{الإنسان 8.}
2. اذهب إلى تحليل ECG | عرض الجدول وحدد بيانات تخطيط القلب المعرّف بشكل صحيح عن طريق التحقق من الدقات الفردية في نافذة عرض المتوسط.
   ملاحظة: يظهر الشكل 3 عدة أمثلة من إشارات تخطيط الانبعاثات الماوس الفعلي. يمثل الشكل 3A إشارة طبيعية من نوع البرية التي تم تحديدها بشكل صحيح فيما يتعلق بموجة P، ومركّع QRS، و WAVE T. يمكن أن يؤدي الاختيار المحوسب لموجات PQRS إلى حالات خاطئة من ضياع االخطأ، كما هو الحال في الشكل 3B إشارة طبيعية من النوع البرية التي تضع في غير محلها بداية موجة P. في الشكل 3C إشارة ECG التي في وضع غير صحيح نهاية مجمع QRS، مما أدى إلى المبالغة في تقدير مدة QRS. في الشكل 3D إشارة تخطيط القلب التي في غير محلها نهاية مجمع QRS، مما أدى إلى التقليل من شأن مجمع QRS بسبب موجة T غامضة والشكل 3E إشارة تخطيط القلب مع موجة T غير قابلة للعرف. بدون استبعاد أو تصحيحات يدوية، يمكن أن تكون فواصل PQRS أكثر أو التقليل من شأنها. تأكد من تحديد إشارات تخطيط القلب التي تم تحديدها بشكل صحيح والإشارات التي لا تفوت القمم المستهدفة. وبالتالي، فإن مثل هذه الحالات، بما في ذلك باء وجيم و دال وهاء(الشكل 3)،مستبعدة في التقدير الدقيق لبارامترات تخطيط الانبعاثات في عام.
3. حدد بيانات تخطيط القلب ذات الأهمية في "طريقة عرض الجدول"، ثم نسخها/لصقها إلى ملف جدول بيانات.

6 - التحليل الإحصائي

1. إجراء التحليل الإحصائي باستخدام برنامج الإحصائيات. تحليل البيانات مع الظروف التجريبية أعمى. قم بإجراء اختبار t-test و Mann-Whitney U لمقارنات بين مجموعتي. تشير الأرقام في كل رقم إلى عدد أجهزة الماوس المستخدمة لكل مجموعة. الإبلاغ عن النتائج على أنها متوسط ± SEM.
2. النظر في الاختلافات مع p < 0.05 بواسطة U-test لتكون ذات دلالة إحصائية: *, p < 0.05; **, p < 0.01; و ***، p < 0.005 مقابل عناصر التحكم المعنية.

النتائج

التجارب الدوائية

لتحديد ما إذا كان قياس ECG غير الباضع يعكس تأثير التشكيل اللاإرادي على نظام موصل القلب ، تم تحدي فئران Balb / c العادية مع ناهضين وخصوم للنظام العصبي اللاإرادي (ANS). واستخدمت الأتروبين والكارباخول للتأثير الحصار اللاإرادي اللاإرادي اللالاماثي والتحفي?...

Discussion

هناك عدة خطوات هامة في البروتوكول. يجب أن تكون البيئة المحيطة خالية من الضوضاء والاهتزاز. يجب إدخال أقطاب ECG تحت الجلد بشكل ثابت وثابت تتطلب خطوة الإدراج تجارب أولية حتى يتم اختبار الباحث تقنيًا. وعلاوة على ذلك، ينبغي إعداد مخدر وتخزينها بشكل مناسب واستخدامها في الجرعة المناسبة. وأخيراً، ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402-25G	anesthetics, Avertin
Animal	Japan SLC, Inc., Shizuoka, Japan		Balb/c mice, male, aged 7-9 weeks
Atropine	Sigma-Aldrich	A0123	parasympathetic antagonist
BioAmp	AD Instruments, Bella Vista, Australia	ML132	bio amplifier
Carbachol	Sigma-Aldrich	C4382	parasympathetic agonist
Electrodes with acupuncture needles	DongBang Acupuncture Inc., Sungnam, Korea	DB106	0.20 x 15 mm
Isoprenaline	Sigma-Aldrich	I2760	sympathetic agonist
LabChart 8	AD Instruments, Bella Vista, Australia		data analysis software
Mouse food	LabDiet, St. Louis, MO, USA	5L79	Mouse diet
PowerLab 2/28	AD Instruments, Bella Vista, Australia		data acquisition system
Propranolol	Sigma-Aldrich	P0884	sympathetic antagonist
SPSS Statistics program	SPSS	SPSS 25.0	statistics program