הקלטות אלקטרוג בעכברים מונערים באמצעות הפניה II

Summary

אנו מציגים פרוטוקול א-א קל, זול, מהיר ובמחיר סביר בעכברים קטנים, וניתן לבצעו ברגישות מוגברת. אנו מציעים שיטה זו כגישה הקרנה עבור לימוד סוכני תרופתי, שינויים גנטיים, מודלים מחלות בעכברים.

Abstract

האלקטרוקרדיולוגית היא כלי רב ערך להערכת מערכת ההולכה הלב. מחקר בעלי חיים עזר ליצור מידע גנטי ותרופתי הרומן לגבי בדיקה חשמלית. עם זאת, הפיכת מדידות אלקטרוג בחיות קטנות בvivo, כגון עכברים, הייתה מאתגרת. למטרה זו, השתמשנו בשיטת הקלטה אלקטרולבית בעכברים מסוערים עם יתרונות רבים: זהו הליך פשוט מבחינה טכנית, הוא זול, יש זמן מדידה קצר, והוא במחיר סביר, אפילו בעכברים צעירים. למרות מגבלות השימוש בהרדמה, ניתן לבצע השוואות בין שליטה לקבוצות נסיוניות ברגישות מוגברת. התייחסו לעכברים עם אגוניסטים ואנטוניסטים של מערכת העצבים האוטונומית כדי לקבוע את תוקפו של פרוטוקול זה ולהשוות את התוצאות שלנו עם דוחות קודמים. פרוטוקול א. א שלנו זיהה שיעורי לב מוגברת ומרווחי QTc על הטיפול עם אטרופין, ירידה בשיעורי הלב ומרווחי QTc לאחר הטיפול carbachol, ושיעורי הלב גבוה יותר מרווחי QTc עם isoprenaline אבל לא לשים לב לשינוי בפרמטרים של א. א. בניהול של propranolol. תוצאות אלה נתמכות על-ידי דוחות קודמים, ומאשרים את האמינות של פרוטוקול זה. לפיכך, ניתן להשתמש בשיטה זו כגישת הקרנה להכנת מדידות אק ג שאחרת לא הייתה מנוסה עקב בעיות בעלות גבוהה ובקשיים טכניים.

Introduction

האלקטרוקרדיולוגית, מבחן המודד את הפעילות החשמלית של פעימות הלב, הוא כלי רב ערך להערכת מערכת ההולכה הלב. הפרמטרים הנמדדים על-ידי ה-אק ג כוללים קצב לב, מרווח זמן יחסי ציבור, משך QRS, ו-QT מרווח. בקצרה, מרווח יחסי ציבור תואם את הזמן הנדרש עבור דחף חשמלי לנוע מן הצומת פרפור באמצעות הצומת מלוח לסיבים Purkinje; QRS משך הוא הזמן של depolarization חדרית להתרחש דרך מערכת Purkinje ושריר הלב החדרית; ו-QT מרווח הוא משך הזמן של repolarization חדרית.

הקלטות אק ג בעכברים סייעו לחוקרים לבחון את תפקוד הלב ולקבוע את המנגנונים הפיסיולוגיים והפתופיזילוגיים של פנוטיפים לב, כגון הפרעה בקצב הלב, פרפור פרוזדורי, ואי ספיקת לב. רוב מחקר לב וכלי דם יש מחקרים מהונדסים גנטית מודלים העכבר. לעתים קרובות הוא מאתגר להשיג נתונים משמעותיים על הקלטות א מ עכברים קטנים כי כבר מניפולציות גנטית.

קיימות מספר שיטות לביצוע ECGs בעכברים¹. מחקרים מראים כי הקלטות א בעלי חיים מודע מעדיפים על בעלי חיים מורדם כאשר הדבר אפשרי מאז השפעות ההרדמה על תפקוד הלב כבר מבוססת היטב². שני פרוטוקולים שהקליטו את א. ג. בעכברים מודעים הם של הערה¹. מערכת רדיוטלמטריה אק היא התקן הזהב לניטור מתמשך לטווח ארוך של א. ב. עכברים מודעים^1,3. למרות הכוח שלהם להיות מוקלט במצב מודע, מדידות רדיוטלמטריה ביחד יש מספר מגבלות, כולל הוצאות גבוהות עבור ההתקנה ועל השתל, הדרישה של מפעיל מנוסה מאוד, תקופת ייצוב של מעל 1 שבוע, הצורך בעכברים גדולים (> 20 g), ורכישת רק קצה אחד של הקלטת^{א 1}. מערכת אחרת המשתמשת אלקטרודות מוליך בגודל כפה מוטבע בפלטפורמה מאפשר הקלטות אק בעכברים מודעים ללא הרדמה או שתלים^1,4. מערכת זו שאינה פולשנית היא שיטה חלופית במצבים בהם מערכות רדיוטלמטריה אינן זמינות מאז יש לו יתרונות רבים: אין דרישה של טיפול כירורגי, אין צורך של הרדמה, עלות נמוכה לכל עכבר (רק ההתקנה הראשונית היא יקרה), זמן קצר למדידה, ומחיר סביר של neonates^1,4. החיסרון העיקרי של מערכת זו הוא כי הוא אינו מתאים ניטור לטווח ארוך מתמשך¹.

כאן אנו מציגים עוד שיטה זולה, פשוטה ומהירה של הקלטה בעכברים המדמדגים ומדגימים את תוקפו ורגישותו על ידי ביצוע אק ג לאחר המצור האוטונומי/גירוי של מערכת ההולכה הלב. אנו מציעים את שיטת א. א. לסינון ההשפעות של סוכני תרופתי, שינויים גנטיים ודגמי מחלות בעכברים.

Protocol

כל ההליכים בעלי החיים אושרו על ידי הוועדה המקומית לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, קיונג הי אוניברסיטת (מספר רשיון: ח'ASP (SE)-18-108) ו-תאמו את ארה ב המכונים הלאומיים של מדריך בריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.

1. בעלי חיים ניסיוניים

1. שמור את כל העכברים (39 עכברים, Balb/c, זכר, 7 \ u20129 שבועות בן) במתקן ללא פתוגן לפי המדריך לטיפול ולשימוש של חיות מעבדה.
2. שמרו על העכברים על מחזור מהיר/כהה בטמפרטורה של 12 שעות, עם גישה חופשית למזון ולמים.

2. הכנת הרדמה

הערה: tribromoethanol משמש על ידי שילובים קטמין ו isofלוריאן, על בסיס היציבות של קצב הלב ואת השגות של אקו קרדיוגרפיה ב tribromoethanol-מורדם בעכברים^1,5,6

1. הפוך פתרון מניות של 2, 2, 2-tribromoethanol בריכוז של 1 גרם לאלכוהול ניטריט שלישוני 1. חם ב 40 \ u201245 ° c עבור 24 שעות ביממה חנות ב 4 ° c עבור 12 חודשים.
2. עבור פתרון העבודה, לדלל 0.5 mL של פתרון מניות 19.5 mL של תמיסת מלח (0.9% הנאל) ל 25 מ"ג/mL. חמים ב-40 \ u201245 ° c במשך 1 h. חנות ב 4 ° צ' עבור 1 חודש.

3. התקנת מערכת א. א.

1. הקפד להגדיר את המערכת כך שאין רעש או רטט בתוך 2 מ ' מאז אותות אק ג בעכבר רגישים לרעש ותנועה סביבתיים.
2. הכן את התקנת החומרה: מערכת רכישת נתונים, מגבר ביולוגי ומחשב המותקן עם תוכנה לניתוח נתוני א. א.
   1. חבר את מערכת רכישת הנתונים לרשת החשמל (AC) באמצעות כבל החשמל.
   2. חבר את מערכת רכישת הנתונים למחשב באמצעות כבל USB.
   3. חבר את פלט האות בלוח האחורי של מגבר הביו לקלט אנלוגי בלוח הקדמי של מערכת רכישת הנתונים באמצעות כבל.
   4. חבר את הפלט I²c של מערכת רכישת נתונים לכניסת i²c של מגבר ביולוגי באמצעות כבל i²c.
   5. חבר את כבל מגבר ביולוגי תלת-מוביל לשקע הקלט בן 6 הפינים בלוח הקדמי של מגבר הביו.
   6. הפעל את מערכת רכישת הנתונים באמצעות המתג שבלוח האחורי.
      הערה: בקצרה, האותות מוגברים באמצעות מגבר ביולוגי ונרשמים באמצעות מערכת ממוחשבת לרכישת נתונים וניתוח באמצעות הגדרות הערוץ הבא: קצב דגימה של 2 קאראט/s, טווח של 20 mV והגדרת מסנן של 200 Hz.
3. פתח את תוכנת הניתוח והגדר אותה לרכישת נתוני אק ג.
   1. עבור לתוכנית ההתקנה | הגדרות הערוץ. הגדר את קצב הדגימה ל-2 ק/s. הגדר את הטווח ל-20 mV. הגדר את מגבר הקלט ל-200 Hz של מעבר נמוך.
   2. עבור לניתוח א | . הגדרותאק ג בחר "עכבר" בהגדרות הקבועות מראש של איתור וניתוח.
   3. בחלונית ' חישוב ממוצע ', בחרו לשרשר N (לדוגמה, 4 פעימות או 60 s) מחזורי לב רצופים לאות ממוצע יחיד עבור חישוב ממוצע של תצוגה ותצוגת טבלה.
   4. בחלונית QTc, בחר בשיטת "בזלת", המוגדרת כערך מתוקן לקצב הלב של מרווח QT: QTc = QT/(RR/100)^0.5, RR מרווח = 60/פעימות לב⁷.

4. מדידת אק ג

1. הניחו עכבר בקנה מידה מדויק והקליטו את משקלו.
2. לגרום הרדמה בעכבר על ידי הזרקת הצפק (כיתה) הזרקה של פתרון עובד של triרומטוזיס (18 מ ל של פתרון עבודה למשקל הגוף ק"ג (b.w.)).
3. מניחים עכבר מורדם במצב פרקדן. ודא שהעכבר מורדם לחלוטין (פחות מ-2 דקות).
4. הכנס את האלקטרודות עם מחטים אקופונקטורה תת-עורי לימין ושמאל forelimbs שמאל על פי התוכנית המובילה השנייה ג ' אק ולתקן אותם עם קלטת (איור 1). ודא כי העומק והמיקום של האלקטרודות המווספת עקביים במהלך הניסויים.
5. חבר את הקצוות האחרים של האלקטרודות על-ידי לחיצה עליהם לשלושת מחברי ההצמדה בקצה השני של חוטי העופרת של כבל מגבר ביולוגי תלת-מוביל.
6. הכנס תרופות (כלפי) 3 דקות לאחר העברת ההרדמה (איור 2).
7. התחל להקליט את ה -10 דקות לאחר הזרקת הרדמה. לאחר השלמת ההקלטה, השתמש בנתוני ה-א מ-12 עד 17 דקות לאחר הזרקת הרדמה לצורך ניתוח.
8. בסוף פגישת ההקלטה של א. א., הסר בזהירות את האלקטרודות.

5. בדיקת נתוני א

1. עבור לניתוח א | חישוב ממוצע של תצוגה ולהבטיח שהתוכנה תזהה כראוי את ההתחלה והסיום של גל ה-P, מתחם QRS ו-T בפעימות בודדות. במידת הצורך, תיקון ידני של גלי ומרווחי זמן אלה אפשרי על-ידי הזזת סמנים שאינם במקומם למיקומים המתאימים.
   הערה: כפי שמתואר באיור 3A, מרווח יחסי הציבור משתרע על תחילתה של גל ה-P של מתחם ה-qrs (החסר ברובו גל Q בעכבר). המשך QRS משתרע מתחילתה של גל Q (בעיקר גל R ב-א עכבר) עד סוף הגל S. מרווח QT כוללת את התחלתה של גל Q (בעיקר גל R ב-א עכבר) עד סוף גל T. שימו לב למשך הזמן הקצר והיעדר גל Q ומקטע ST ב-אק ג ביחס ל-א. ק. האנושי⁸.
2. עבור לניתוח א | תצוגת טבלה ובחירה בנתוני ה-א שזוהו כהלכה על-ידי בדיקת פעימות בודדות בחלון ' חישוב בממוצע תצוגה '.
   הערה: איור 3 מראה מספר דוגמאות של אותות העכבר בפועל. איור 3A מייצג אות רגיל מסוג פראי כי זוהה כראוי לגבי גל P, מורכבות qrs, ו T גל. מבחר ממוחשב של גלי PQRS יכול לגרום מוטעה שגוי, כגון באיור 3B אות רגיל סוג פראי כי מניעת התחלתה של הגל P. באיור 3C אות אק ג שעושה בלתי מבוקר את הקצה של מתחם qrs, והתוצאה היא אומדן יתר של משך qrs. באיור 3D אות אק ג שעושה בלתי מבוקר את הקצה של מתחם qrs, וכתוצאה מכך הערכה של מורכבות qrs בשל גל דו-משמעי ואיור 3d אות א עם גל בלתי מזוהים. ללא הוצאה לאור או תיקונים ידניים, ניתן להתגבר על מרווחי PQRS או להמעיט בערכו. הקפד לבחור את אותות ה-א שזוהו כראוי ואת האותות שאינם מפספסים את פסגות היעד. כתוצאה מכך, מקרים כאלה, כולל B, C, D, ו-E (איור 3), אינם נכללים בהערכת הפרמטרים של א. א. באופן מדויק.
3. בחר את נתוני ה-א של הריבית בתצוגת טבלה והעתק/הדבק אותם לקובץ גיליון אלקטרוני.

6. אנליזה סטטיסטית

1. בצע את הניתוח הסטטיסטי באמצעות תוכנית סטטיסטיקה. לנתח את הנתונים עם התנאים הניסיוניים עיוור. בצע מבחן t-Test של סטודנט, מאן-ויטני U-מבחן להשוואות 2 קבוצות. המספרים בכל אחד מהספרות מציינים את מספר העכברים המשמשים עבור כל קבוצה. דווח על התוצאות כממוצע ± SEM.
2. שקול הבדלים עם p < 0.05 על ידי U-test כדי להיות משמעותי סטטיסטית: *, p < 0.05; * *, p < 0.01; ו * * *, p < 0.005 לעומת שולטת בהתאמה.

תוצאות

ניסויים פרמקולוגיים

כדי לקבוע אם מידת ה-א פולשנית שלנו משקפת את השפעת האפנון האוטונומי על מערכת ההולכה הלב, עכברים רגילים של Balb/c היו מאותגרים עם אגוניסטים ואנטוניסטים של מערכת העצבים האוטונומית (ANS). אטרופין ו carbachol שימשו כדי להשפיע המצור האוטונומי הפאראסימפתטית ו?...

Discussion

קיימים מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול. הסביבה המקיפה צריכה להיות חופשית מרעש ורטט. יש להוסיף את אלקטרודות ה-אק ע מתחת לעור באופן עקבי ובעקביות, ששלב הכניסה דורש ניסויים ראשוניים עד שהחוקר מנוסה באופן טכני. עוד, הרדמה צריך להיות מוכן ומאוחסן כראוי ומשמש במינון הנכון. לבסוף, הגלים של PQRS צריכים ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402-25G	anesthetics, Avertin
Animal	Japan SLC, Inc., Shizuoka, Japan		Balb/c mice, male, aged 7-9 weeks
Atropine	Sigma-Aldrich	A0123	parasympathetic antagonist
BioAmp	AD Instruments, Bella Vista, Australia	ML132	bio amplifier
Carbachol	Sigma-Aldrich	C4382	parasympathetic agonist
Electrodes with acupuncture needles	DongBang Acupuncture Inc., Sungnam, Korea	DB106	0.20 x 15 mm
Isoprenaline	Sigma-Aldrich	I2760	sympathetic agonist
LabChart 8	AD Instruments, Bella Vista, Australia		data analysis software
Mouse food	LabDiet, St. Louis, MO, USA	5L79	Mouse diet
PowerLab 2/28	AD Instruments, Bella Vista, Australia		data acquisition system
Propranolol	Sigma-Aldrich	P0884	sympathetic antagonist
SPSS Statistics program	SPSS	SPSS 25.0	statistics program