Kurşun II kullanarak Anestezili Farelerde Elektrokardiyogram Kayıtları

Özet

Küçük farelerde teknik olarak kolay, ucuz, hızlı ve uygun fiyatlı ve gelişmiş hassasiyetle yapılabilen bir EKG protokolü salıyoruz. Bu yöntemi farelerde farmakolojik ajanlar, genetik modifikasyonlar ve hastalık modellerini incelemek için bir tarama yaklaşımı olarak öneriyoruz.

Özet

Elektrokardiyogram kardiyak iletim sistemini değerlendirmek için değerli bir araçtır. Hayvan araştırmaları elektrokardiyogram ile ilgili yeni genetik ve farmakolojik bilgilerin oluşturulmasına yardımcı olmuştur. Ancak, fareler gibi vivo küçük hayvanlarda elektrokardiyogram ölçümleri yapmak zor olmuştur. Bu amaçla, birçok avantajı ile anestezili farelerde bir elektrokardiyogram kayıt yöntemi kullanılır: bu teknik olarak basit bir işlemdir, ucuz, kısa ölçüm süresi vardır, ve uygun fiyatlı, genç fareler bile. Anestezi kullanımı ile sınırlamalara rağmen, kontrol ve deney grupları arasında karşılaştırmalar gelişmiş hassasiyet ile yapılabilir. Bu protokolün geçerliliğini belirlemek için fareleri otonom sinir sisteminin agonistleri ve antagonistleri ile tedavi ettik ve sonuçlarımızı önceki raporlarla karşılaştırdık. EKG protokolümüzde atropin ile tedavide artmış kalp hızları ve QTc aralıkları, karbachol tedavisinden sonra kalp hızlarında ve QTc aralıklarında azalma, izoprenaline ile daha yüksek kalp hızları ve QTc aralıkları saptandı ancak propranolol uygulamasında EKG parametrelerinde herhangi bir değişiklik olmadı. Bu sonuçlar, bu EKG protokolünün güvenilirliğini onaylayan önceki raporlarla desteklenir. Bu nedenle, bu yöntem, yüksek maliyet ve teknik zorluklar nedeniyle aksi takdirde denenmeyecek EKG ölçümlerinin yapılmasında bir tarama yaklaşımı olarak kullanılabilir.

Giriş

Elektrokardiyogram (EKG), kalp atışı elektriksel aktivitesini ölçen bir test, kardiyak iletim sistemini değerlendirmek için değerli bir araçtır. EKG ile ölçülen parametreler arasında kalp hızı, PR aralığı, QRS süresi ve QT aralığı sayılabilir. Kısacası, PR aralığı purkinje lifleri atriyoventriküler düğüm yoluyla atriyal sinüs düğümü nden seyahat etmek için bir elektrik impuls için gerekli olan zamana karşılık gelir; QRS süresi Purkinje sistemi ve ventriküler miyokardiyum yoluyla ventriküler depolarizasyon için zaman; ve QT aralığı ventriküler repolarizasyon süresidir.

Farelerdeki EKG kayıtları, araştırmacıların kardiyak fonksiyonu incelemelerine ve aritmi, atriyal fibrilasyon ve kalp yetmezliği gibi kardiyak fenotiplerin fizyolojik ve patofizyolojik mekanizmalarını belirlemelerine yardımcı olmalıdır. Çoğu kardiyovasküler araştırma genetiği değiştirilmiş fare modellerinde çalışmalar almıştır. Genetik olarak manipüle edilmiş küçük farelerden EKG kayıtları hakkında anlamlı veri elde etmek genellikle zordur.

Farelerde EG yapmak için çeşitli yöntemler vardır^1. Yapılan çalışmalar, anestezinin kardiyak fonksiyon üzerindeki etkileri iyi anlaşıldığından, bilinçli hayvanlarda EKG kayıtlarının anestezili hayvanlara göre tercih edildiğini göstermektedir². Bilinçli farelerde EKG kaydeden iki protokol¹not 1'dir. EKG radyotelemetri sistemi bilinçli farelerde EKG sürekli uzun vadeli izleme için altın standart^1,3. Bilinçli bir durumda kaydedilmesindeki gücüne rağmen, radyotelemetri-birleştirilmiş EKG ölçümleri kurulum ve implant için yüksek gider, son derece deneyimli bir operatör gereksinimi, 1 haftadan fazla bir stabilizasyon süresi, büyük fareleriçin ihtiyacı (> 20 g) ve EKG^kaydınınsadece tek bir kurşununun alınması 1 dahil olmak üzere çeşitli sınırlamalar vardır. Bir platforma gömülü pençe büyüklüğünde iletken elektrotlar kullanan başka bir sistem anestezi veya implantlar olmadan bilinçli farelerde EKG kayıtları sağlar^1,4. Bu non-invaziv sistem birçok avantajı vardır beri radyotelemetri sistemleri kullanılamaz durumlarda alternatif bir yöntemdir: cerrahi tedavi gerek yok, anestezi gerek yok, fare başına düşük maliyet (sadece ilk kurulum pahalı), ölçüm için kısa süre, ve neonates uygun fiyatlı^1,4. Bu sistemin en büyük dezavantajı sürekli uzun vadeli izleme için uygun olmamasıdır^1.

Burada anestezili farelerde başka bir ucuz, basit ve hızlı EKG kayıt yöntemi ni savuruyor uzlaşıyorum ve kardiyak iletim sisteminin otonom bloku/stimülasyonu sonrası EKG yaparak geçerliliğini ve hassasiyetini gösteriyoruz. Farelerde farmakolojik ajanların, genetik modifikasyonların ve hastalık modellerinin etkilerini taramalar için bu EKG yöntemini öneriyoruz.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Kyung Hee Üniversitesi (lisans numarası: KHUASP(SE)-18-108) laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için yerel komite tarafından onaylandı ve ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak kabul edildi.

1. Deneysel hayvanlar

1. Tüm fareleri (39 fare, Balb/c, erkek, 7\u20129 haftalık) laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı kılavuzuna göre patojensiz bir tesiste tutun.
2. Fareleri 12 saat açık/karanlık bir döngüde, yiyecek ve suya ücretsiz erişim le sabit sıcaklıkta koruyun.

2. Anestezilerin hazırlanması

NOT: Tribromoetanol ketamin kombinasyonları ve izofluran üzerinde kullanılır, kalp hızı istikrarı ve tribromoetanol-anestezili farelerde ekokardiyografi tekrarlanabilirlik dayalı^1,5,6

1. 1 mL tersiyer alik alkol başına 1 g konsantrasyonda 2,2,2-tribromoetanol bir stok çözeltisi olun. 40\u201245 °C'de 24 saat boyunca Sıcak, 4 °C'de 12 ay boyunca saklayın.
2. Çalışma çözeltisi için, 19,5 mL tuzlu (%0,9 NaCl) ile 25 mg/mL arasında 0,5 mL stok çözeltisini seyreltin. 40\u201245 °C'de 1 saat boyunca 1 saat boyunca 4 °C'de 1 ay boyunca Sıcak.

3. EKG sistem kurulumu

1. Bir faredeki EKG sinyalleri çevresel gürültü ve harekete duyarlı olduğundan, 2 m içinde gürültü veya titreşim olmayacak şekilde sistemi kurduğunuzdan emin olun.
2. Donanım kurulumunu hazırlayın: veri toplama sistemi, bir biyo amplifikatörü ve EKG veri analiz yazılımı yla yüklü bir bilgisayar.
   1. Güç kablosunu kullanarak veri toplama sistemini şebekeye (AC) bağlayın.
   2. Usb kablosu kullanarak veri toplama sistemini bilgisayara bağlayın.
   3. Biyo amplifikatörün arka panelindeki sinyal çıkışını, veri toplama sisteminin ön panelindeki analog girişe kablo kullanarak bağlayın.
   4. Veri toplama sisteminin I²C çıkışını I²C kablosunu kullanarak biyo amplifikatörün I²C girişine bağlayın.
   5. 3-kurşunlu biyo amplifikatör kablosunu biyo amplifikatörün ön panelindeki 6 iğneli giriş soketine bağlayın.
   6. Arka paneldeki anahtarı kullanarak veri toplama sistemini açın.
      NOT: Kısaca, sinyaller bir biyo amplifikatör ile yükseltilir ve aşağıdaki kanal ayarları ile bilgisayarlı veri toplama ve analiz sistemi kullanılarak kaydedilir: örnekleme oranı 2 k/s, 20 mV aralığı ve 200 Hz düşük geçişfiltre ayarı.
3. Analiz yazılımı programını açın ve EKG veri alımı için ayarlayın.
   1. Kuruluma Git | Kanal Ayarları. Numune Oranını 2 k/s olarak Range ayarlayın. Giriş Amplifikatörü Low Pass'ın 200 Hz'ine ayarlayın.
   2. EKG Analizine Git | EKG Ayarları. Algılama ve Analiz Ayarları önceden ayarlanmış "Fare" seçin.
   3. Ortalama panelinde, Ortalama Görünüm ve Tablo Görünümü için tek bir ortalama sinyaliçine N (örneğin, 4 atım veya 60 s) ardışık kardiyak döngüleri biraraya getirmeyi seçin.
   4. QTc panelinde QT aralığının kalp hızı düzeltilmiş değeri olarak tanımlanan "Bazett" yöntemini seçin: QTc = QT / (RR/100)^0.5, RR aralığı = 60 / kalp hızı⁷.

4. EKG ölçümü

1. Fareyi hassas bir ölçeğe yerleştirin ve ağırlığını kaydedin.
2. Tribromoetanol (kg vücut ağırlığı başına 18 mL çalışma çözeltisi (b.w.)) çalışma çözeltisi intraperitoneal (yani) enjeksiyonu ile farede anestezi indüklemek.
3. Anestezili fareyi supine pozisyonunda yerleştirin. Farenin tamamen anestezi li olduğundan emin olun (2 dk'dan az).
4. Elektrotları akupunktur iğneleri ile subkutan olarak sağ ve sol ön bacaklara ve sol arka ekvonlara kurşun II EKG şemasına göre yerleştirin ve bantla düzeltin(Şekil 1). Eklenen elektrotların derinliğinin ve konumunun deneyler boyunca tutarlı olduğundan emin olun.
5. Elektrotların diğer uçlarını 3 kurşunlu biyo amplifikatör kablosunun kurşun kablolarının diğer ucundaki üç koplu konektöre tıklayarak bağlayın.
6. Enjektör ilaçları (i.p.) anestezikler teslim edildikten 3 dakika sonra(Şekil 2).
7. Anestezikenjekte ettikten sonra EKG 10 dk'yı kaydetmeye başlayın. Kayıt tamamlandıktan sonra, analiz için anestezi kattıktan sonra 12 ila 17 dk EKG verilerini kullanın.
8. EKG kayıt seansının sonunda elektrotları dikkatlice çıkarın.

5. EKG veri analizi

1. EKG Analizine Git | Ortalama Görünüm ve yazılımın P dalgasının, QRS kompleksinin ve T dalgasının tek tek atımlarının başlangıcını ve sonunu doğru bir şekilde tanımladığından emin olun. Gerekirse, bu dalgaların ve aralıkların el ile düzeltilmesi, yanlış yerleştirilmiş imleçlerin uygun konumlara taşınması ile mümkündür.
   NOT: Şekil 3A'datasvir edildiği gibi, PR aralığı P dalgasının başlangıcını QRS kompleksinin (çoğunlukla fare EKG'sinde eksik Q dalgası) kapsar. QRS süresi Q dalgasının başlangıcından (öncelikle fare EKG'sindeki Bir R dalgası) S dalgasının sonuna kadar uzanır. QT aralığı, Q dalgasının (çoğunlukla fare EKG'sindeki R dalgası) T dalgasının sonuna kadar başlangıcını oluşturur. İnsan EKG⁸göre fare EKG bir Q dalgası ve ST segmentinin daha kısa süre ve yokluğu unutmayın.
2. EKG Analizine Git | Tablo Görünümü ve Ortalama Görünüm penceresinde tek tek vuruşları kontrol ederek doğru tanımlanmış EKG verilerini seçin.
   NOT: Şekil 3 gerçek fare EKG sinyallerinin birkaç örneğini göstermektedir. Şekil 3A, P dalgası, QRS kompleksi ve T dalgası ile ilgili olarak doğru şekilde tanımlanmış normal bir yabani tip sinyali temsil eder. PQRS dalgalarının bilgisayarlı seçimi, Şekil 3B'de P dalgasının başlangıcını yanlış yerleştiren normal bir yabani tip sinyal gibi hatalı yanlış yerleşimlere neden olabilir. Şekil 3C'de QRS kompleksinin sonunu yanlış yerleştiren ve QRS süresinin aşırı tahmin edilebilen bir EKG sinyali. Şekil 3D'de QRS kompleksinin ucunu yanlış yerleştiren bir EKG sinyali, belirsiz T dalgası ve Şekil 3E tanımlanmamış T dalgası ile Bir EKG sinyali nedeniyle QRS kompleksinin hafife alınarak sonuçlanır. Dışlama veya manuel düzeltmeler olmadan, PQRS aralıkları üzerinde veya hafife olabilir. Doğru tanımlanmış EKG sinyallerini ve hedef zirveleri kaçırmayan sinyalleri seçtiğinizden emin olun. Sonuç olarak, B, C, D ve E(Şekil 3)gibi olgular genel olarak EKG parametrelerinin doğru bir şekilde tahmin edilmesinde dışlanır.
3. Tablo Görünümü'ndeki ilgi çekici EKG verilerini seçin ve bunları bir elektronik tablo dosyasına kopyalayın/yapıştırın.

6. İstatistiksel analiz

1. İstatistiksel bir programı kullanarak istatistiksel analiz gerçekleştirin. Deneysel koşullar kör ile verileri analiz edin. 2 grup karşılaştırmalar için Öğrencinin t-testive Mann-Whitney U-testini gerçekleştirin. Her şekildeki sayılar, her grup için kullanılan fare sayısını gösterir. Sonuçları ortalama ± SEM olarak bildirin.
2. P < 0.05 u-testi ile arasındaki farklılıkları istatistiksel olarak anlamlı olarak göz önünde bulundurun: *, p < 0.05; **, p < 0.01; ve ***, p < 0.005 ile ilgili kontroller.

Sonuçlar

Farmakolojik deneyler

Noninvaziv EKG ölçümümüzün otonom modülasyonun kardiyak iletim sistemi üzerindeki etkisini yansıtıp yansıtmadığını belirlemek için, normal Balb/c farelere otonom sinir sisteminin (ANS) agonistleri ve antagonistleri ile meydan okundu. Atropin ve karbachol parasempatik otonom blokozekmonve stimülasyon etkisi için kullanılan, sırasıyla, propranolol ve isoprenaline sempatik otonom bloker ve stimülasyon ortaya çıkarmak için uygulandı ...

Tartışmalar

Protokolde birkaç kritik adım vardır. Çevredeki ortam gürültü ve titreşimden arındırılmış olmalıdır. EKG elektrotları, ekleme adımı nın teknik olarak deneyimli olana kadar ön deneyler gerektirdiği, tutarlı ve düzenli bir şekilde derinin altına yerleştirilmelidir. Ayrıca anestezi hazırlanıp uygun şekilde depolanmalıdır ve uygun dozda kullanılmalıdır. Son olarak, PQRS dalgaları Ortalama Görünüm penceresinde tek tek EKG vuruşlarında uygun şekilde bulunmalıdır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402-25G	anesthetics, Avertin
Animal	Japan SLC, Inc., Shizuoka, Japan		Balb/c mice, male, aged 7-9 weeks
Atropine	Sigma-Aldrich	A0123	parasympathetic antagonist
BioAmp	AD Instruments, Bella Vista, Australia	ML132	bio amplifier
Carbachol	Sigma-Aldrich	C4382	parasympathetic agonist
Electrodes with acupuncture needles	DongBang Acupuncture Inc., Sungnam, Korea	DB106	0.20 x 15 mm
Isoprenaline	Sigma-Aldrich	I2760	sympathetic agonist
LabChart 8	AD Instruments, Bella Vista, Australia		data analysis software
Mouse food	LabDiet, St. Louis, MO, USA	5L79	Mouse diet
PowerLab 2/28	AD Instruments, Bella Vista, Australia		data acquisition system
Propranolol	Sigma-Aldrich	P0884	sympathetic antagonist
SPSS Statistics program	SPSS	SPSS 25.0	statistics program