납 II를 사용하여 마취 마우스의 심전도 기록

요약

우리는 기술적으로 쉽게, 저렴, 빠르고, 작은 마우스에서 저렴하고 저렴한 ECG 프로토콜을 제시하고, 향상된 감도로 수행 할 수 있습니다. 우리는 마우스에 있는 약리학 에이전트, 유전 수정 및 질병 모형을 공부하기 위한 검열 접근으로 이 방법을 건의합니다.

초록

심전도는 심장 전도 시스템을 평가하기위한 귀중한 도구입니다. 동물 연구는 심전도에 관한 새로운 유전 및 약리학적 정보를 생성하는 데 도움이되었습니다. 그러나, 마우스와 같은 생체 내의 작은 동물에서 심전도 측정을 하는 것은 도전적이고 있습니다. 이를 위해, 우리는 많은 장점을 가진 마취 마우스에서 심전도 기록 방법을 사용했습니다 : 그것은 기술적으로 간단한 절차이며, 저렴하고, 짧은 측정 시간을 가지고 있으며, 어린 쥐에서도 저렴합니다. 마취를 사용하는 한계에도 불구하고 제어 그룹과 실험 그룹 간의 비교는 향상된 감도로 수행 될 수 있습니다. 우리는 이 프로토콜의 타당성을 결정하기 위하여 자율 신경계의 작용제 그리고 길항제를 가진 마우스를 취급하고 이전 보고와 우리의 결과를 비교했습니다. 우리의 심전도 프로토콜은 atropine를 가진 처리에 증가한 심박수 및 QTC 간격을 검출했습니다, carbachol 처리 후에 심박수 및 QTC 간격을 감소시키고, 이소프레네랄린을 가진 더 높은 심박수 및 QTC 간격그러나 propranolol의 관리에 ECG 매개변수에 있는 어떤 변경도 주의하지 않았습니다. 이러한 결과는 이전 보고서에서 지원되며 이 심전도 프로토콜의 신뢰성을 확인합니다. 따라서, 이 방법은 높은 비용 및 기술적 어려움으로 인해 시도되지 않을 심전도 측정을 만들기 위한 스크리닝 접근법으로 사용될 수 있다.

서문

심장 박동의 전기 적 활성을 측정하는 심전도 (ECG)는 심장 전도 시스템을 평가하는 귀중한 도구입니다. 심전도에 의해 측정되는 매개 변수에는 심박수, PR 간격, QRS 지속 시간 및 QT 간격이 포함됩니다. 간단히 말해서, PR 간격은 심방 부비동 노드에서 대상동맥 노드를 통해 Purkinje 섬유로 이동하는 데 필요한 시간에 해당합니다. QRS 지속 시간은 Purkinje 시스템 및 심실 심근을 통해 심실 탈극화가 발생하는 시간입니다. 및 QT 간격은 심실 재양극화의 지속 시간입니다.

마우스의 심전도 기록은 연구원이 심장 기능을 검토하고 부정맥, 심방 세동 및 심부전과 같은 심장 표현형의 생리적 및 병리학적 메커니즘을 결정하는 데 도움이 되었습니다. 대부분의 심혈관 연구는 유전자 조작 마우스 모형에 있는 연구 결과를 관련시켰습니다. 유전적으로 조작된 작은 쥐로부터 심전도 기록에 대한 의미 있는 데이터를 얻는 것은 종종 어려운 일입니다.

마우스^1에서ECG를 수행하기 위한 몇 가지 방법이 있다. 연구 결과에 따르면 마취가 심장 기능에 미치는 영향이 잘^{확립되었기}때문에 의식이 있는 동물의 심전도 기록이 마취 동물보다 선호되는 것으로 2. 의식마우스에서 심전도를 기록하는 두 가지 프로토콜은 노트^1이다. 심전도 방사능 시스템은 의식마우스^1,3에서심전도의 지속적인 장기^{모니터링을}위한 금본위제이다. 의식상태에서 기록되는 데 힘이 있음에도 불구하고, 방사선 망원경 결합 심전도 측정은 설치 및 임플란트에 대한 높은 비용, 고도로 숙련 된 연산자의 요구 사항, 1 주일 이상 안정화 기간, 대형 마우스 (> 20g) 및 ECG 기록^1의단일 리드 만 획득하는 등 몇 가지 한계를 가지고 있습니다. 플랫폼에 내장된 발 크기의 전도성 전극을 사용하는 또 다른 시스템은 마취 나 임플란트^1,,4없이의식이 있는 마우스에서 심전도 기록을 허용한다. 이 비침습적 시스템은 수술 치료 요구 사항, 마취 필요 없음, 마우스 당 저렴한 비용 (초기 설정만 비싸다), 측정 짧은 시간 및 신생아^1,,4의경제성 등 많은 장점이 있기 때문에 방사선 원격 측정 시스템을 사용할 수없는 상황에서 대안 방법입니다. 이 시스템의 주요 단점은 지속적인 장기 모니터링^1에적합하지 않다는 것입니다.

여기서 우리는 마취 된 마우스에서 또 다른 저렴하고 간단하며 빠른 심전도 기록 방법을 소개하고 심장 전도 시스템의 자율 봉쇄 / 자극 후 심전도를 수행함으로써 그 유효성과 감도를 입증합니다. 우리는 마우스에 있는 약리학 에이전트, 유전 수정 및 질병 모형의 효력을 검열하기 위한 이 ECG 방법을 건의합니다.

프로토콜

모든 동물 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 지역위원회에 의해 승인되었다, 경희대학 (라이센스 번호: KHUASP (SE)-18-108) 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 건강 가이드의 미국 국립 연구소에 부합.

1. 실험동물

1. 실험실 동물의 치료 및 사용에 대한 지침에 따라 모든 마우스 (39 마우스, Balb /c, 남성, 7\u20129 주 이전)를 병원체없는 시설에 보관하십시오.
2. 음식과 물에 무료로 액세스 할 수있는 일정한 온도에서 12 h 빛 / 어두운 주기에 마우스를 유지합니다.

2. 마취제 준비

참고: 트리브로모에탄올은 심박수의 안정성과 트리브로메탄올 마취 마우스^1,5,6의 에코카르디그래피의 재현성을 기반으로 케타민 조합 및 이소플루란위에^{사용됩니다.,}

1. 1mL 고등 아밀 알코올 당 1 g의 농도에서 2,2,2-트리브로모에탄올의 재고 용액을 확인합니다. 40\u201245 °C에서 24 시간 동안 따뜻하게 합니다.
2. 작업 용액의 경우 0.5mL의 재고 용액을 식염수(0.9% NaCl)에서 25 mg/mL로 희석하십시오. 40\u201245 °C에서 1 h. 1 개월 동안 4 ° C에서 저장하십시오.

3. 심전도 시스템 설정

1. 마우스의 심전도 신호가 환경 소음 및 움직임에 민감하기 때문에 2m 이내에 소음이나 진동이 없도록 시스템을 설정해야 합니다.
2. 데이터 수집 시스템, 바이오 증폭기 및 ECG 데이터 분석 소프트웨어와 함께 설치된 컴퓨터와 같은 하드웨어 설정을 준비합니다.
   1. 전원 케이블을 사용하여 데이터 수집 시스템을 AC(주)에 연결합니다.
   2. USB 케이블을 사용하여 데이터 수집 시스템을 컴퓨터에 연결합니다.
   3. 바이오 앰프의 후면 패널의 신호 출력을 케이블을 사용하여 데이터 수집 시스템의 전면 패널에 아날로그 입력에 연결합니다.
   4. I²C 케이블을 이용하여 바이오 앰프의 I²C 입력에 데이터 수집 시스템의 I²C 출력을 연결합니다.
   5. 3리드 바이오 앰프 케이블을 바이오 앰프의 전면 패널의 6핀 입력 소켓에 연결합니다.
   6. 후면 패널의 스위치를 사용하여 데이터 수집 시스템을 켭니다.
      참고: 간단히 말해서, 신호는 바이오 증폭기와 다음 채널 설정과 함께 전산화된 데이터 수집 및 분석 시스템을 사용하여 기록됩니다: 2 k/s의 샘플링 속도, 20mV 범위 및 200Hz의 로우 패스 필터 설정.
3. 분석 소프트웨어 프로그램을 열고 ECG 데이터 수집을 위해 설정합니다.
   1. 설정으로 이동 | 채널 설정. 샘플 속도를 2k/s로 설정합니다. Range 입력 증폭기를 로우 패스200Hz로 설정합니다.
   2. 심전도 분석으로 이동 | 심전도 설정. 검색 및 분석 설정 의 사전 설정에서 "마우스"를 선택합니다.
   3. 평균 패널에서 평균 보기 및 테이블 뷰에 대한 단일 평균 신호로 N(예: 4비트 또는 60s) 연속 심장 주기를 결합하도록 선택합니다.
   4. QTc 패널에서 QT 간격의 심박수 보정 값으로 정의된 "Bazett" 방법을 선택하십시오: QTc = QT/(RR/100)^0.5,RR 간격 = 60/심박수^7.

4. 심전도 측정

1. 마우스를 정밀 척도에 놓고 무게를 기록합니다.
2. 트리브로모에탄올(18mL당 작동 용액의 18mL)의 작업용액의 인트라보네알(i.p.) 주입에 의해 마우스내 마취를 유도한다(b.w.).
3. 마취 된 마우스를 supine 위치에 놓습니다. 마우스가 완전히 마취되었는지(2분 미만)인지 확인합니다.
4. 침술 바늘로 전극을 좌우 앞다리와 왼쪽 뒷다리에 피하로 삽입하고 리드 II ECG 계획에 따라 테이프로 고정하십시오(도1). 삽입된 전극의 깊이와 위치가 실험 전반에 걸쳐 일관되게 유지되도록 합니다.
5. 3리드 바이오 앰프 케이블의 리드 와이어의 다른 쪽 끝에 있는 세 개의 스냅 커넥터에 클릭하여 전극의 다른 끝을 연결합니다.
6. 약물 주입 (i.p.) 마취제가 전달 된 후 3 분(그림 2).
7. 마취제를 주입한 후 10분 후에 심전도 기록을 시작하십시오. 기록이 완료되면 분석용 마취제를 주입한 후 12분에서 17분까지 심전도 데이터를 사용하십시오.
8. 심전도 기록 세션이 끝나면 전극을 조심스럽게 제거합니다.

5. 심전도 데이터 분석

1. 심전도 분석으로 이동 | 평균 보기 및 소프트웨어가 P 웨이브의 시작과 끝, QRS 복합체 및 T 웨이브를 개별 비트에서 올바르게 식별할 수 있도록 합니다. 필요한 경우 잘못 배치된 커서를 적절한 위치로 이동하여 이러한 파도 및 간격을 수동으로 수정할 수 있습니다.
   참고: 도 3A에설명된 바와 같이, PR 간격은 P파의 발병을 QRS 컴플렉스(마우스 심전도에서 대부분 누락된 Q웨이브)에 걸쳐 있습니다. QRS 지속 시간은 Q 웨이브(주로 마우스 심전도의 R 웨이브)의 발병에서 S 파의 끝으로 확장됩니다. QT 간격은 T 파의 끝에 Q 웨이브(주로 마우스 심전도의 R 웨이브)의 발병을 포함한다. 인간 심전도^8에비해 마우스 심전도에서 Q파 및 ST 세그먼트의 짧은 지속 시간 및 부재를 유의한다.
2. 심전도 분석으로 이동 | 평균 보기 창에서 개별 비트를 확인하여 올바르게 식별된 심전도 데이터를 선택하고 선택합니다.
   참고: 그림 3에서는 실제 마우스 심전도 신호의 몇 가지 예를 보여 주어 있습니다. 도 3A는 P웨이브, QRS 복합체 및 T웨이브와 관련하여 올바르게 확인된 일반 야생형 신호를 나타낸다. PQRS 파의 전산화된 선택은 P 파의 발병을 잘못 배치하는 일반적인 야생형 신호인 도 3B와 같은 잘못된 오위를 초래할 수 있다. 그림 3C에서 QRS 컴플렉스의 끝을 잘못 배치하는 심전도 신호로 QRS 지속 시간의 과대 평가가 발생합니다. 도 3D에서 QRS 컴플렉스의 끝을 잘못 배치하는 심전도 신호로 인해 모호한 T 파및 도 3E에 의한 QRS 복합체의 과소평가가 식별 가능한 T 웨이브를 가진 심전도 신호를 과소평가하게 됩니다. 제외 또는 수동 수정 없이 PQRS 간격을 초과하거나 과소 평가할 수 있습니다. 올바르게 식별된 ECG 신호와 대상 피크를 놓치지 않는 신호를 선택해야 합니다. 따라서 B, C, D 및 E(그림3)를포함한 이러한 경우는 일반적으로 ECG 파라미터를 정확하게 추정하는 데 배제됩니다.
3. 테이블 뷰에서 관심 있는 ECG 데이터를 선택하고 스프레드시트 파일에 복사/붙여넣습니다.

6. 통계 분석

1. 통계 프로그램을 사용하여 통계 분석을 수행합니다. 눈멀게 된 실험 조건으로 데이터를 분석합니다. 2그룹 비교를 위해 학생의 t-test및 Mann-Whitney U-테스트를 수행합니다. 각 그림의 숫자는 각 그룹에 사용되는 마우스 수를 나타냅니다. 결과를 평균 ± SEM으로 보고합니다.
2. U-테스트에 의한 p&05와의 차이점을 통계적으로 유의하게 고려하십시오: *, p< 0.05; p **, p p&01; 및 ***, p & 0.005 대 각각의 컨트롤.

결과

약리학 실험

우리의 비침습적 심전도 측정이 심장 전도 시스템에 자율 변조의 영향을 반영하는지 여부를 결정하기 위해, 일반 Balb /c 마우스는 자율 신경계 (ANS)의 작용제 및 길항제와 도전했다. 아트로핀과 카르바콜은 각각 부교감 자율 봉쇄 및 자극을 위해 사용되었으며, 프로프라놀롤과 이소프레네랄린은 각각^9개의동정적인 자율 봉쇄와 자극?...

토론

프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 주변 환경은 소음과 진동이 없어야 합니다. 심전도 전극은 연구원이 기술적으로 경험할 때까지 삽입 단계에 예비 실험이 필요한 피부 아래에 안정적으로 일관되게 삽입되어야 합니다. 또한, 마취제는 적절하게 준비및 저장하고 적절한 용량으로 사용되어야 한다. 마지막으로 PQRS 파동은 평균 보기 창의 개별 ECG 비트에 적절하게 위치해야 합니다.

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402-25G	anesthetics, Avertin
Animal	Japan SLC, Inc., Shizuoka, Japan		Balb/c mice, male, aged 7-9 weeks
Atropine	Sigma-Aldrich	A0123	parasympathetic antagonist
BioAmp	AD Instruments, Bella Vista, Australia	ML132	bio amplifier
Carbachol	Sigma-Aldrich	C4382	parasympathetic agonist
Electrodes with acupuncture needles	DongBang Acupuncture Inc., Sungnam, Korea	DB106	0.20 x 15 mm
Isoprenaline	Sigma-Aldrich	I2760	sympathetic agonist
LabChart 8	AD Instruments, Bella Vista, Australia		data analysis software
Mouse food	LabDiet, St. Louis, MO, USA	5L79	Mouse diet
PowerLab 2/28	AD Instruments, Bella Vista, Australia		data acquisition system
Propranolol	Sigma-Aldrich	P0884	sympathetic antagonist
SPSS Statistics program	SPSS	SPSS 25.0	statistics program