Elektrokardiogrammaufnahmen bei anästhesierten Mäusen mit Blei II

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein EKG-Protokoll, das technisch einfach, kostengünstig, schnell und erschwinglich bei kleinen Mäusen ist und mit erhöhter Empfindlichkeit durchgeführt werden kann. Wir schlagen diese Methode als Screening-Ansatz für die Untersuchung von pharmakologischen Wirkstoffen, genetischen Modifikationen und Krankheitsmodellen bei Mäusen vor.

Zusammenfassung

Das Elektrokardiogramm ist ein wertvolles Werkzeug zur Beurteilung des Herzleitsystems. Die Tierforschung hat dazu beigetragen, neuartige genetische und pharmakologische Informationen über das Elektrokardiogramm zu generieren. Elektrokardiogrammmessungen bei Kleintieren in vivo, wie Mäusen, waren jedoch eine Herausforderung. Zu diesem Zweck haben wir bei anästhesierten Mäusen ein Elektrokardiogramm-Aufnahmeverfahren mit vielen Vorteilen angewandt: Es ist ein technisch einfaches Verfahren, ist kostengünstig, hat kurze Messzeit und ist auch bei jungen Mäusen erschwinglich. Trotz der Einschränkungen bei der Verwendung von Anästhesie können Vergleiche zwischen Kontroll- und Versuchsgruppen mit erhöhter Empfindlichkeit durchgeführt werden. Wir behandelten Mäuse mit Agonisten und Antagonisten des autonomen Nervensystems, um die Gültigkeit dieses Protokolls zu bestimmen und verglichen unsere Ergebnisse mit früheren Berichten. Unser EKG-Protokoll erkannte erhöhte Herzfrequenzen und QTc-Intervalle bei der Behandlung mit Atropin, verminderte Herzfrequenzen und QTc-Intervalle nach der Carbachol-Behandlung sowie höhere Herzfrequenzen und QTc-Intervalle mit Isoprenalin, bemerkten jedoch keine Änderung der EKG-Parameter bei der Verabreichung von Propranolol. Diese Ergebnisse werden durch frühere Berichte unterstützt, die die Zuverlässigkeit dieses EKG-Protokolls bestätigen. Daher kann diese Methode als Screening-Ansatz für EKG-Messungen verwendet werden, die sonst aufgrund hoher Kosten und technischer Schwierigkeiten nicht versucht würden.

Einleitung

Das Elektrokardiogramm (EKG), ein Test, der die elektrische Aktivität des Herzschlags misst, ist ein wertvolles Werkzeug zur Bewertung des Herzleitsystems. Zu den Parametern, die mit einem EKG gemessen werden, gehören Herzfrequenz, PR-Intervall, QRS-Dauer und QT-Intervall. Kurz gesagt, PR-Intervall entspricht der Zeit, die für einen elektrischen Impuls benötigt wird, um vom Atrial-Sinusknoten durch den atrioventrikulären Knoten zu den Purkinje-Fasern zu reisen; QRS-Dauer ist die Zeit für die ventrikuläre Depolarisation durch das Purkinje-System und das ventrikuläre Myokard; und QT-Intervall ist die Dauer der ventrikulären Repolarisation.

EKG-Aufnahmen bei Mäusen haben Forschern geholfen, die Herzfunktion zu untersuchen und die physiologischen und pathophysiologischen Mechanismen von Herzphänotypen wie Herzrhythmusstörungen, Vorhofflimmern und Herzinsuffizienz zu bestimmen. Die meisten kardiovaskulären Forschungen haben Studien mit gentechnisch veränderten Mausmodellen durchgeführt. Es ist oft eine Herausforderung, aussagekräftige Daten über EKG-Aufnahmen von kleinen Mäusen zu erhalten, die genetisch manipuliert wurden.

Es gibt mehrere Methoden zur Durchführung von EKGs bei Mäusen¹. Studien deuten darauf hin, dass EKG-Aufnahmen bei bewussten Tieren nach Möglichkeit gegenüber anästhesierten Tieren bevorzugt werden, da die Auswirkungen der Anästhesie auf die Herzfunktion gut etabliert sind². Zwei Protokolle, die EKG bei bewussten Mäusen aufzeichnen, sind von Anmerkung¹. Das EKG-Radiotelemetriesystem ist der Goldstandard für die kontinuierliche Langzeitüberwachung von EKG bei bewussten Mäusen^1,3. Trotz ihrer Stärke, in einem bewussten Zustand aufgezeichnet zu werden, haben radiotelemetriegekoppelte EKG-Messungen mehrere Einschränkungen, einschließlich des hohen Aufwands für den Aufbau und für das Implantat, seine Anforderung an einen erfahrenen Bediener, eine Stabilisierungszeit von über 1 Woche, seinen Bedarf an großen Mäusen (> 20 g) und die Erfassung von nur einer einzigen Leitung der EKG-Aufnahme¹. Ein anderes System, das in einer Plattform eingebettete leitfähige Elektroden in Pfotengröße verwendet, ermöglicht EKG-Aufnahmen bei bewussten Mäusen ohne Anästhesie oder Implantate^1,4. Dieses nicht-invasive System ist eine alternative Methode in Situationen, in denen Radiotelemetriesysteme nicht verfügbar sind, da es viele Vorteile hat: keine Notwendigkeit der chirurgischen Behandlung, keine Notwendigkeit der Anästhesie, niedrige Kosten pro Maus (nur die Ersteinrichtung ist teuer), kurze Zeit für die Messung und erschwingliche Neonate^1,4. Der Hauptnachteil dieses Systems ist, dass es nicht für eine kontinuierliche Langzeitüberwachung geeignet ist¹.

Hier führen wir eine weitere kostengünstige, einfache und schnelle EKG-Aufnahmemethode bei anästhesierten Mäusen ein und demonstrieren deren Gültigkeit und Empfindlichkeit durch die Durchführung eines EKG nach autonomer Blockade/Stimulation des Herzleitsystems. Wir schlagen diese EKG-Methode zum Screening der Auswirkungen von pharmakologischen Wirkstoffen, genetischen Modifikationen und Krankheitsmodellen bei Mäusen vor.

Protokoll

Alle tierischen Verfahren wurden vom lokalen Komitee für die Pflege und Verwendung von Labortieren, Kyung Hee University (Lizenznummer: KHUASP(SE)-18-108) genehmigt und entsprachen dem US National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

1. Versuchstiere

1. Halten Sie alle Mäuse (39 Mäuse, Balb/c, männlich, 7-u20129 Wochen alt) in einer pathogenfreien Anlage gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren.
2. Halten Sie die Mäuse auf einem 12 h Licht/Dunkel-Zyklus bei konstanter Temperatur mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser.

2. Vorbereitung von Anästhetika

HINWEIS: Tribromethanol wird über Ketamin-Kombinationen und Isofluran verwendet, basierend auf der Stabilität der Herzfrequenz und der Reproduzierbarkeit der Echokardiographie bei tribromoethanol-anästhesierten Mäusen^1,5,6

1. Machen Sie eine Lagerlösung von 2,2,2-Tribromethanol in einer Konzentration von 1 g pro 1 ml tertiärem Amylalkohol. Bei 40-u201245 °C für 24 h erwärmen. 12 Monate bei 4 °C lagern.
2. Für arbeitslösungslösungslösungslösungslösungswert 0,5 ml Stammlösung in 19,5 ml Saline (0,9% NaCl) bis 25 mg/ml verdünnen. 1 H bei 4 °C aufwärmen. 1 Monat bei 4 °C lagern.

3. Einrichtung des EKG-Systems

1. Stellen Sie sicher, dass das System so eingerichtet wird, dass es innerhalb von 2 m zu keinen Geräuschen oder Vibrationen kommt, da EKG-Signale in einer Maus empfindlich auf Umgebungsgeräusche und -bewegungen reagieren.
2. Bereiten Sie die Hardware-Einrichtung vor: ein Datenerfassungssystem, ein Bioverstärker und ein Computer, der mit einer EKG-Datenanalysesoftware installiert ist.
   1. Schließen Sie das Datenerfassungssystem über das Netzkabel an das Netz (AC) an.
   2. Schließen Sie das Datenerfassungssystem über ein USB-Kabel an den Computer an.
   3. Schließen Sie den Signalausgang auf der Rückseite des Bioverstärkers über ein Kabel an einen analogen Eingang an der Frontplatte des Datenerfassungssystems an.
   4. Schließen Sie den I²C-Ausgang des Datenerfassungssystems über das^I2C-Kabel an den^I2C-Eingang des Bioverstärkers an.
   5. Schließen Sie das 3-Leiter-Bioverstärkerkabel an die 6-polige Eingangsbuchse an der Frontplatte des Bioverstärkers an.
   6. Schalten Sie das Datenerfassungssystem über den Schalter auf der Rückseite ein.
      HINWEIS: Kurz gesagt, die Signale werden durch einen Bioverstärker verstärkt und mit einem computergestützten Datenerfassungs- und Analysesystem mit den folgenden Kanaleinstellungen aufgezeichnet: Abtastrate von 2 k/s, Reichweite von 20 mV und Tiefpassfiltereinstellung von 200 Hz.
3. Öffnen Sie das Analysesoftwareprogramm und richten Sie es für die EKG-Datenerfassung ein.
   1. Gehen Sie zu Setup | Kanaleinstellungen. Stellen Sie die Abtastrate auf 2 k/s ein. Stellen Sie den Bereich auf 20 mV ein. Stellen Sie den Eingangsverstärker auf 200 Hz von Low Pass ein.
   2. Zur EKG-Analyse | EKG-Einstellungen. Wählen Sie "Maus" in der Voreinstellung der Erkennungs- und Analyseeinstellungen.
   3. Wählen Sie im Mittelungsfenster aus, um N (z. B. 4 Schläge oder 60 s) aufeinander folgende Herzzyklen zu einem einzigen durchschnittlichen Signal für die Mittelungs- und Tabellenansicht zu verketten.
   4. Wählen Sie im QTc-Panel die "Bazett"-Methode aus, die als herzfrequenzkorrigierter Wert des QT-Intervalls definiert ist: QTc = QT / (RR/100)^0,5, RR-Intervall = 60 / Herzfrequenz⁷.

4. EKG-Messung

1. Platzieren Sie eine Maus auf einer Präzisionsskala und zeichnen Sie ihr Gewicht auf.
2. Induzieren Anästhesie in der Maus durch intraperitoneale (i.p.) Injektion einer Arbeitslösung von Tribromoethanol (18 ml Arbeitslösung pro kg Körpergewicht (b.w.)).
3. Platzieren Sie eine anästhesierte Maus in Supine-Position. Stellen Sie sicher, dass die Maus vollständig beästhesiert ist (weniger als 2 min).
4. Setzen Sie die Elektroden mit Akupunkturnadeln subkutan in die rechte und linke Vorderbeine und das linke Hinterglied nach dem Blei-II-EKG-Schema ein und fixieren Sie sie mit Klebeband (Abbildung 1). Stellen Sie sicher, dass die Tiefe und Position der eingesetzten Elektroden während der Experimente konsistent sind.
5. Schließen Sie die anderen Enden der Elektroden an, indem Sie sie in die drei Schnappverbinder am anderen Ende der Bleidrähte des 3-Leiter-Bioverstärkerkabels klicken.
6. Injektion von Medikamenten (i.p.) 3 min nach Derentäubung der Anästhetika geliefert wurden (Abbildung 2).
7. Beginnen Sie mit der Aufnahme des EKG 10 min nach der Injektion von Anästhetika. Sobald die Aufzeichnung abgeschlossen ist, verwenden Sie die EKG-Daten von 12 bis 17 min nach Injektion von Anästhetika für die Analyse.
8. Entfernen Sie am Ende der EKG-Aufnahmesitzung die Elektroden vorsichtig.

5. EKG-Datenanalyse

1. Zur EKG-Analyse | Mittelwertanzeigen und sicherstellen, dass die Software den Start und das Ende der P-Welle, des QRS-Komplexes und der T-Welle in einzelnen Beats korrekt identifiziert. Bei Bedarf ist eine manuelle Korrektur dieser Wellen und Intervalle möglich, indem falsch platzierte Cursor an die entsprechenden Positionen bewegt werden.
   HINWEIS: Wie in Abbildung 3Adargestellt, erstreckt sich das PR-Intervall über den Beginn der P-Welle bis zum DES QRS-Komplexes (meist fehlende Q-Welle in einem Maus-EKG). Die QRS-Dauer erstreckt sich vom Beginn der Q-Welle (hauptsächlich einer R-Welle in einem Maus-EKG) bis zum Ende der S-Welle. Das QT-Intervall umfasst den Beginn der Q-Welle (meist die R-Welle in einem Maus-EKG) bis zum Ende der T-Welle. Beachten Sie die kürzere Dauer und das Fehlen eines Q-Wellen- und ST-Segments im Maus-EKG relativ zum menschlichen EKG⁸.
2. Zur EKG-Analyse | Tabellenansicht und wählen Sie die korrekt identifizierten EKG-Daten aus, indem Sie einzelne Beats im Fenster Mittelungsansicht überprüfen.
   HINWEIS: Abbildung 3 zeigt mehrere Beispiele für tatsächliche Maus-EKG-Signale. Abbildung 3A stellt ein normales Wildtypsignal dar, das in Bezug auf P-Welle, QRS-Komplex und T-Welle korrekt identifiziert wurde. Die computergestützte Auswahl von PQRS-Wellen kann zu fehlerhaften Fehlstellungen führen, z. B. in Abbildung 3B ein normales Wildtypsignal, das den Beginn der P-Welle verlegt. In Abbildung 3C ein EKG-Signal, das das Ende des QRS-Komplexes verlegt, was zu einer Überschätzung der QRS-Dauer führt. In Abbildung 3D ein EKG-Signal, das das Ende des QRS-Komplexes verlegt, was zu einer Unterschätzung des QRS-Komplexes aufgrund der mehrdeutigen T-Welle und Abbildung 3E eines EKG-Signals mit einer nicht identifizierbaren T-Welle führt. Ohne Ausschluss oder manuelle Korrekturen können PQRS-Intervalle über- oder unterschätzt werden. Achten Sie darauf, die EKG-Signale auszuwählen, die korrekt identifiziert wurden, und die Signale, die die Zielspitzen nicht verfehlen. Folglich sind solche Fälle, einschließlich B, C, D und E (Abbildung 3), bei der genauen Schätzung der EKG-Parameter im Allgemeinen ausgeschlossen.
3. Wählen Sie die von Interesse sindden EKG-Daten in der Tabellenansicht aus, und kopieren/einfügen Sie sie in eine Tabellenkalkulationsdatei.

6. Statistische Analyse

1. Führen Sie die statistische Analyse mithilfe eines Statistikprogramms durch. Analysieren Sie die Daten mit den geblendeten Versuchsbedingungen. Führen Sie Den T-Testund den Mann-Whitney U-Test für 2-Gruppen-Vergleiche durch. Die Zahlen in jeder Abbildung geben die Anzahl der Mäuse an, die für jede Gruppe verwendet wird. Melden Sie die Ergebnisse als Mittelwert - SEM.
2. Berücksichtigen Sie die Unterschiede mit p < 0,05 durch U-Test als statistisch signifikant: *, p < 0,05; **, p < 0,01; und ***, p < 0.005 im Vergleich zu den jeweiligen Steuerelementen.

Ergebnisse

Pharmakologische Experimente

Um festzustellen, ob unsere nichtinvasive EKG-Messung den Einfluss der autonomen Modulation auf das Herzleitsystem widerspiegelt, wurden normale Balb/c-Mäuse mit Agonisten und Antagonisten des autonomen Nervensystems (ANS) herausgefordert. Atropin und Carbachol wurden verwendet, um parasympathische autonome Blockade bzw. Stimulation zu bewirken, während Propranolol und Isoprenalin verabreicht wurden, um sympathische autonome Blockade und Stimulat...

Diskussion

Es gibt mehrere wichtige Schritte im Protokoll. Die Umgebung sollte frei von Lärm und Vibrationen sein. Die EKG-Elektroden müssen stabil und konsequent unter die Haut eingeführt werden, deren Einfügeschritt Vorversuche erfordert, bis der Forscher technisch erfahren ist. Darüber hinaus sollte das Anästhetikum entsprechend zubereitet und gelagert und in der richtigen Dosis verwendet werden. Schließlich sollten die PQRS-Wellen in den einzelnen EKG-Beats im Fenster Mittelungsansicht entsprechend lokalisiert werden.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402-25G	anesthetics, Avertin
Animal	Japan SLC, Inc., Shizuoka, Japan		Balb/c mice, male, aged 7-9 weeks
Atropine	Sigma-Aldrich	A0123	parasympathetic antagonist
BioAmp	AD Instruments, Bella Vista, Australia	ML132	bio amplifier
Carbachol	Sigma-Aldrich	C4382	parasympathetic agonist
Electrodes with acupuncture needles	DongBang Acupuncture Inc., Sungnam, Korea	DB106	0.20 x 15 mm
Isoprenaline	Sigma-Aldrich	I2760	sympathetic agonist
LabChart 8	AD Instruments, Bella Vista, Australia		data analysis software
Mouse food	LabDiet, St. Louis, MO, USA	5L79	Mouse diet
PowerLab 2/28	AD Instruments, Bella Vista, Australia		data acquisition system
Propranolol	Sigma-Aldrich	P0884	sympathetic antagonist
SPSS Statistics program	SPSS	SPSS 25.0	statistics program