Enregistrements d’électrocardiogramme chez des souris anesthésiées à l’aide de plomb II

Résumé

Nous présentons un protocole ECG qui est techniquement facile, peu coûteux, rapide et abordable chez les petites souris, et peut être exécuté avec une sensibilité accrue. Nous suggérons cette méthode comme approche de dépistage pour l’étude des agents pharmacologiques, des modifications génétiques, et des modèles de maladie chez les souris.

Résumé

L’électrocardiogramme est un outil précieux pour évaluer le système de conduction cardiaque. La recherche animale a contribué à générer de nouvelles informations génétiques et pharmacologiques concernant l’électrocardiogramme. Cependant, faire des mesures d’électrocardiogramme chez de petits animaux in vivo, comme les souris, a été difficile. À cette fin, nous avons utilisé une méthode d’enregistrement d’électrocardiogramme chez des souris anesthésiées avec de nombreux avantages : il s’agit d’une procédure techniquement simple, peu coûteuse, a un court temps de mesure et est abordable, même chez les jeunes souris. Malgré les limitations avec l’utilisation de l’anesthésie, les comparaisons entre le contrôle et les groupes expérimentaux peuvent être effectuées avec une sensibilité accrue. Nous avons traité des souris avec des agonistes et des antagonistes du système nerveux autonome pour déterminer la validité de ce protocole et avons comparé nos résultats avec des rapports précédents. Notre protocole d’ECG a détecté des fréquences cardiaques accrues et des intervalles de QTc sur le traitement avec l’atropine, les fréquences cardiaques diminuées et les intervalles de QTc après traitement de carbachol, et des fréquences cardiaques plus élevées et des intervalles de QTc avec l’isoprenaline mais n’ont noté aucun changement dans les paramètres d’ECG sur l’administration du propranolol. Ces résultats sont étayés par des rapports précédents, confirmant la fiabilité de ce protocole ECG. Ainsi, cette méthode peut être utilisée comme une approche de dépistage pour effectuer des mesures ECG qui autrement ne seraient pas tentées en raison de coûts élevés et de difficultés techniques.

Introduction

L’électrocardiogramme (ECG), un test qui mesure l’activité électrique de son rythme cardiaque, est un outil précieux pour évaluer le système de conduction cardiaque. Les paramètres qui sont mesurés par un ECG incluent la fréquence cardiaque, l’intervalle de PR, la durée de QRS, et l’intervalle de QT. En bref, l’intervalle de PR correspond au temps qui est nécessaire pour une impulsion électrique de voyager du nœud atrial de sinus par le noeud atrioventriculaire aux fibres de Purkinje ; La durée de QRS est le temps pour la dépolarisation ventriculaire de se produire par le système de Purkinje et le myocardium ventriculaire ; et l’intervalle QT est la durée de la repolarisation ventriculaire.

Les enregistrements d’ECG chez la souris ont aidé les chercheurs à examiner la fonction cardiaque et à déterminer les mécanismes physiologiques et pathophysiologiques des phénotypes cardiaques, tels que l’arythmie, la fibrillation auriculaire et l’insuffisance cardiaque. La plupart des recherches cardiovasculaires ont impliqué des études sur des modèles de souris génétiquement modifiés. Il est souvent difficile d’obtenir des données significatives sur les enregistrements ECG de petites souris qui ont été génétiquement manipulées.

Il existe plusieurs méthodes pour effectuer des ECG chez les souris¹. Des études suggèrent que les enregistrements d’ECG chez les animaux conscients sont préférés aux animaux anesthésiés lorsque c’est possible puisque les effets de l’anesthésie sur la fonction cardiaque ont été bien établis². Deux protocoles qui enregistrent ECG chez les souris conscientes sont de la note¹. Le système de radiotélémétrie ECG est l’étalon-or pour la surveillance continue à long terme de l’ECG chez les souris conscientes^1,3. Malgré leur force à être enregistrées dans un état conscient, les mesures ECG couplées à la radiotélémétrie ont plusieurs limites, y compris les dépenses élevées pour la configuration et pour l’implant, son exigence d’un opérateur très expérimenté, une période de stabilisation de plus d’une semaine, son besoin de grandes souris (> 20 g), et l’acquisition d’une seule avance de l’enregistrement ECG¹. Un autre système qui utilise des électrodes conductrices de la taille d’une patte intégrées dans une plate-forme permet aux enregistrements ECG chez des souris conscientes sans anesthésie ou implants^1,4. Ce système non invasif est une méthode alternative dans les situations où les systèmes de radiotélémétrie ne sont pas disponibles car il a de nombreux avantages: pas besoin de traitement chirurgical, pas besoin d’anesthésie, faible coût par souris (seule la configuration initiale est coûteuse), peu de temps pour la mesure, et l’abordabilité des nouveau-nés^1,4. Le principal inconvénient de ce système est qu’il n’est pas adapté à une surveillance continue à long terme¹.

Ici, nous introduisons une autre méthode d’enregistrement ECG peu coûteuse, simple et rapide chez les souris anesthésiées et démontrons sa validité et sa sensibilité en effectuant un ECG après le blocus autonome/stimulation du système de conduction cardiaque. Nous suggérons cette méthode ECG pour le dépistage des effets des agents pharmacologiques, des modifications génétiques, et des modèles de maladie chez les souris.

Protocole

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le comité local pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, l’Université Kyung Hee (numéro de licence : KHUASP(SE)-18-108) et conformes au Guide national des Instituts de santé des États-Unis pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.

1. Animaux expérimentaux

1. Gardez toutes les souris (39 souris, Balb/c, mâles, 7\u20129 semaines) dans un établissement exempt d’agents pathogènes selon le guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.
2. Maintenir les souris sur un cycle clair/foncé de 12 h à température constante avec un accès gratuit à la nourriture et à l’eau.

2. Préparation des anesthésiques

NOTE: Tribromoéthanol est utilisé sur les combinaisons de kétamine et isoflurane, basé sur la stabilité de la fréquence cardiaque et la reproductibilité de l’échocardiographie chez les souris tribromoéthanol-anesthésié^1,5,6

1. Faire une solution de stock de 2,2,2-tribromoéthanol à une concentration de 1 g par 1 mL d’alcool amyl tertiaire. Chauffer à 40\u201245 °C pendant 24 h. Conserver à 4 °C pendant 12 mois.
2. Pour la solution de travail, diluer 0,5 mL de solution de stock dans 19,5 mL de solution saline (0,9% NaCl) à 25 mg/mL. Chauffer à 40\u201245 °C pendant 1 h. Conserver à 4 °C pendant 1 mois.

3. Configuration du système ECG

1. Assurez-vous de configurer le système de telle sorte qu’il n’y ait pas de bruit ou de vibration dans les 2 m puisque les signaux ECG dans une souris sont sensibles au bruit et au mouvement de l’environnement.
2. Préparer la configuration matérielle : un système d’acquisition de données, un amplificateur bio et un ordinateur installé avec un logiciel d’analyse de données ECG.
   1. Connectez le système d’acquisition de données au réseau (AC) à l’aide du câble d’alimentation.
   2. Connectez le système d’acquisition de données à l’ordinateur à l’aide d’un câble USB.
   3. Connectez la sortie de signal sur le panneau arrière de l’amplificateur bio à une entrée analogique sur le panneau avant du système d’acquisition de données à l’aide d’un câble.
   4. Connectez la sortie I²C du système d’acquisition de données à l’entrée I²C de l’amplificateur bio à l’aide du câble I²C.
   5. Connectez le câble d’amplificateur bio à 3 plombs à la prise d’entrée de 6 broches sur le panneau avant de l’amplificateur bio.
   6. Activez le système d’acquisition de données à l’aide du panneau de commutation arrière.
      REMARQUE : En bref, les signaux sont amplifiés par un amplificateur bio et enregistrés à l’aide d’un système informatisé d’acquisition et d’analyse de données avec les paramètres suivants : taux d’échantillonnage de 2 k/s, plage de 20 mV et réglage du filtre à faible passage de 200 Hz.
3. Ouvrez le logiciel d’analyse et définissez-le pour l’acquisition de données ECG.
   1. Aller à l’installation | Paramètres du canal. Définissez le taux d’échantillonnage à 2 k/s. Réglez la plage à 20 mV. Réglez l’amplificateur d’entrée sur 200 Hz de Passe basse.
   2. Accédez à l’analyse ECG | Paramètres ECG. Choisissez « Souris » dans les paramètres Préréglage de détection et d’analyse.
   3. Dans le panneau Moyenne, choisissez de concatenate N (par exemple, 4 battements ou 60 s) cycles cardiaques consécutifs dans un signal moyen unique pour la vue moyenne et la vue de table.
   4. Dans le panneau QTc, sélectionnez la méthode « Bazett », qui est définie comme la valeur corrigée de la fréquence cardiaque de l’intervalle QT : QTc = QT / (RR/100)^0,5, intervalle RR = 60 / fréquence cardiaque⁷.

4. Mesure ECG

1. Placez une souris sur une échelle de précision et enregistrez son poids.
2. Induire l’anesthésie chez la souris par injection intrapéritonéale (i.p.) d’une solution de travail de tribromoéthanol (18 mL de solution de travail par kg de poids corporel (b.w.)).
3. Placez une souris anesthésiée en position de supination. Assurez-vous que la souris est complètement anesthésiée (moins de 2 min).
4. Insérez les électrodes avec des aiguilles d’acupuncture sous-cutanéement dans les membres antérieurs de droite et de gauche et le reste arrière gauche selon le schéma ecg de plomb II et fixez-les avec du ruban adhésif (figure 1). Assurez-vous que la profondeur et la position des électrodes insérées sont cohérentes tout au long des expériences.
5. Connectez les autres extrémités des électrodes en cliquant sur elles dans les trois connecteurs snap à l’autre extrémité des fils de plomb du câble d’amplificateur bio à 3 plombs.
6. Médicaments injectables (c.-à-d.) 3 min après l’accouchement des anesthésiques (figure 2).
7. Commencez à enregistrer l’ECG 10 min après l’injection d’anesthésiques. Une fois l’enregistrement terminé, utilisez les données ECG de 12 à 17 min après injection d’anesthésiques pour analyse.
8. À la fin de la session d’enregistrement ECG, retirez soigneusement les électrodes.

5. Analyse des données ECG

1. Accédez à l’analyse ECG | Affichage moyen et s’assurer que le logiciel identifie correctement le début et la fin de l’onde P, le complexe QRS et la vague T dans les battements individuels. Si nécessaire, la correction manuelle de ces ondes et intervalles est possible en déplaçant les curseurs égarés vers les positions appropriées.
   REMARQUE : Comme indiqué dans la figure 3A, l’intervalle de relations publiques s’étend sur le début de l’onde P à celle du complexe QRS (vague Q manquante pour la plupart dans une souris ECG). La durée du QRS s’étend du début de l’onde Q (principalement une onde R dans une souris ECG) à la fin de la vague S. L’intervalle QT comprend le début de l’onde Q (principalement l’onde R dans une souris ECG) jusqu’à la fin de l’onde T. Notez la durée et l’absence plus courtes d’une onde Q et d’un segment ST dans la souris ECG par rapport à l’ECG^{humain 8}.
2. Accédez à l’analyse ECG | Affichez et sélectionnez les données ECG correctement identifiées en vérifiant les battements individuels dans la fenêtre Affichage moyen.
   REMARQUE : La figure 3 montre plusieurs exemples de signaux ECG réels de souris. La figure 3A représente un signal sauvage normal qui a été correctement identifié en ce qui concerne l’onde P, le complexe QRS et l’onde T. La sélection informatisée des ondes PQRS peut entraîner des erreurs erronées, comme dans la figure 3B, un signal normal de type sauvage qui égare le début de l’onde P. À la figure 3C, un signal ECG qui égare la fin du complexe QRS, ce qui entraîne une surestimation de la durée du SRQ. Dans la figure 3D, un signal ECG qui égare la fin du complexe QRS, ce qui entraîne une sous-estimation du complexe QRS en raison de l’onde T ambiguë et de la figure 3E un signal ECG avec une onde T non identifiable. Sans exclusion ni corrections manuelles, les intervalles PQRS peuvent être dépassés ou sous-estimés. Assurez-vous de sélectionner les signaux ECG qui ont été correctement identifiés et les signaux qui ne manquent pas les pics cibles. Par conséquent, de tels cas, y compris B, C, D et E (figure 3), sont exclus dans l’estimation précise des paramètres d’ECG en général.
3. Sélectionnez les données ECG d’intérêt dans l’affichage table et copiez/collez-les dans un fichier de feuille de calcul.

6. Analyse statistique

1. Effectuer l’analyse statistique à l’aide d’un programme de statistiques. Analyser les données avec les conditions expérimentales aveuglées. Effectuez le test tde l’étudiant et le test U mann-whitney pour des comparaisons en deux groupes. Les chiffres de chaque chiffre indiquent le nombre de souris utilisées pour chaque groupe. Signalez les résultats comme moyens ± SEM.
2. Considérez que les différences avec p < 0,05 par U-test sont statistiquement significatives : *, p < 0,05; **, p < 0,01; et ***, p < 0,005 par rapport aux contrôles respectifs.

Résultats

Expériences pharmacologiques

Pour déterminer si notre mesure ECG non invasive reflète l’influence de la modulation autonome sur le système de conduction cardiaque, les souris balb/c normales ont été défiées avec des agonistes et des antagonistes du système nerveux autonome (ANS). L’atropine et le carbachol ont été utilisés pour effectuer le blocus et la stimulation autonomes parasympathiques, respectivement, tandis que le propranolol et l’isoprenaline ont ét...

Discussion

Il y a plusieurs étapes critiques dans le protocole. L’environnement environnant doit être exempt de bruit et de vibrations. Les électrodes ECG doivent être insérées sous la peau de façon stable et cohérente dont l’étape d’insertion nécessite des expériences préliminaires jusqu’à ce que le chercheur soit techniquement expérimenté. En outre, l’anesthésique doit être préparé et stocké de façon appropriée et utilisé à la dose appropriée. Enfin, les ondes PQRS doivent être situées de faç...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402-25G	anesthetics, Avertin
Animal	Japan SLC, Inc., Shizuoka, Japan		Balb/c mice, male, aged 7-9 weeks
Atropine	Sigma-Aldrich	A0123	parasympathetic antagonist
BioAmp	AD Instruments, Bella Vista, Australia	ML132	bio amplifier
Carbachol	Sigma-Aldrich	C4382	parasympathetic agonist
Electrodes with acupuncture needles	DongBang Acupuncture Inc., Sungnam, Korea	DB106	0.20 x 15 mm
Isoprenaline	Sigma-Aldrich	I2760	sympathetic agonist
LabChart 8	AD Instruments, Bella Vista, Australia		data analysis software
Mouse food	LabDiet, St. Louis, MO, USA	5L79	Mouse diet
PowerLab 2/28	AD Instruments, Bella Vista, Australia		data acquisition system
Propranolol	Sigma-Aldrich	P0884	sympathetic antagonist
SPSS Statistics program	SPSS	SPSS 25.0	statistics program