Elettrocardiogramma Registrazioni in Topi anestesizzati utilizzando Lead II

Riepilogo

Vi presentiamo un protocollo ECG tecnicamente facile, economico, veloce e conveniente in piccoli topi e che può essere eseguito con una maggiore sensibilità. Suggeriamo questo metodo come approccio di screening per studiare gli agenti farmacologici, le modifiche genetiche e i modelli di malattia nei topi.

Abstract

L'elettrocardiogramma è uno strumento prezioso per valutare il sistema di conduzione cardiaca. La ricerca sugli animali ha contribuito a generare nuove informazioni genetiche e farmacologiche riguardanti l'elettrocardiogramma. Tuttavia, effettuare misurazioni dell'elettrocardiogramma in piccoli animali in vivo, come i topi, è stato impegnativo. A tal fine, abbiamo usato un metodo di registrazione dell'elettrocardiogramma in topi anestesi con molti vantaggi: è una procedura tecnicamente semplice, è poco costosa, ha poco tempo di misurazione ed è conveniente, anche nei giovani topi. Nonostante le limitazioni con l'utilizzo dell'anestesia, i confronti tra il controllo e i gruppi sperimentali possono essere eseguiti con una maggiore sensibilità. Abbiamo trattato topi con agonisti e antagonisti del sistema nervoso autonomo per determinare la validità di questo protocollo e confrontato i nostri risultati con i rapporti precedenti. Il nostro protocollo ECG ha rilevato un aumento della frequenza cardiaca e degli intervalli QTc sul trattamento con atropina, diminuzione della frequenza cardiaca e intervalli QTc dopo il trattamento con carbacholo, e frequenze cardiache e intervalli QTc più elevati con isoprena, ma non ha notato alcuna modifica nei parametri ECG sulla somministrazione del propranolololo. Questi risultati sono supportati da relazioni precedenti, che confermano l'affidabilità di questo protocollo ECG. Pertanto, questo metodo può essere utilizzato come approccio di screening per effettuare misurazioni ECG che altrimenti non sarebbero tentate a causa di costi elevati e difficoltà tecniche.

Introduzione

L'elettrocardiogramma (ECG), un test che misura l'attività elettrica del battito cardiaco, è uno strumento prezioso per valutare il sistema di conduzione cardiaca. I parametri misurati da un ECG includono la frequenza cardiaca, l'intervallo PR, la durata QRS e l'intervallo QT. In breve, l'intervallo PR corrisponde al tempo necessario affinché un impulso elettrico viaggi dal nodo del seno atriale attraverso il nodo atrioventricolare fino alle fibre Purkinje; La durata QRS è il tempo per la depolarizzazione ventricolare che si verifica attraverso il sistema Purkinje e il miocardio ventricolare; e l'intervallo QT è la durata della ripolarizzazione ventricolare.

Le registrazioni ECG nei topi hanno aiutato i ricercatori a esaminare la funzione cardiaca e a determinare i meccanismi fisiologici e patofisiologici dei fenotipi cardiaci, come l'aritmia, la fibrillazione atriale e l'insufficienza cardiaca. La maggior parte della ricerca cardiovascolare ha coinvolto studi su modelli murini geneticamente ingegnerizzati. Spesso è difficile ottenere dati significativi sulle registrazioni ECG da piccoli topi che sono stati geneticamente manipolati.

Esistono diversi metodi per eseguire ECG nei topi¹. Gli studi suggeriscono che le registrazioni ECG negli animali coscienti sono preferite rispetto agli animali anestesizzati quando possibile poiché gli effetti dell'anestesia sulla funzione cardiaca sono stati ben stabiliti². Due protocolli che registrano L'ECG in topi coscienti sono di nota¹. Il sistema di radiotelemetria ECG è lo standard d'oro per il monitoraggio continuo a lungo termine di ECG in topi coscienti^1,3. Nonostante la loro forza nell'essere registrati in uno stato cosciente, le misurazioni ECG accoppiate alla radiotelemetry hanno diverse limitazioni, tra cui l'elevata spesa per la configurazione e per l'impianto, il suo requisito di un operatore altamente esperto, un periodo di stabilizzazione di oltre 1 settimana, la sua necessità di topi di grandi dimensioni (> 20 g), e l'acquisizione di un solo lead di registrazione ECG¹. Un altro sistema che utilizza elettrodi conduttivi di dimensioni dosare incorporati in una piattaforma consente registrazioni ECG in topi coscienti senza anestesia o impianti^1,4. Questo sistema non invasivo è un metodo alternativo in situazioni in cui i sistemi di radiotelemetrynono non sono disponibili in quanto non ha molti vantaggi: nessun requisito di trattamento chirurgico, nessuna necessità di anestesia, basso costo per mouse (solo la configurazione iniziale è costosa), tempo per la misurazione e convenienza dei neonati^1,4. Lo svantaggio principale di questo sistema è che non è adatto per il monitoraggio continuo a lungo termine¹.

Qui introduciamo un altro metodo di registrazione ECG economico, semplice e veloce in topi anestesizzati e dimostriamo la sua validità e sensibilità eseguendo un ECG dopo blocco/stimolazione autonomica del sistema di conduzione cardiaca. Suggeriamo questo metodo ECG per lo screening degli effetti degli agenti farmacologici, delle modifiche genetiche e dei modelli di malattia nei topi.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal comitato locale per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, Kyung Hee University (numero di licenza: KHUASP(SE)-18-108) e conformi alla Guida degli Istituti nazionali di salute degli Stati Uniti per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.

1. Animali sperimentali

1. Tenere tutti i topi (39 topi, Balb/c, maschi, 7-u20129 settimane) in una struttura priva di agenti patogeni, come da guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio.
2. Mantenere i topi su un ciclo di 12 h luce / buio a temperatura costante con accesso gratuito al cibo e all'acqua.

2. Preparazione di anestetici

NOTA: Il tribromoetanolo viene utilizzato su combinazioni di ketamina e isoflurane, in base alla stabilità della frequenza cardiaca e alla riproducibilità dell'ecocardiografia nei topi tribromoetanolo-anestesizzati^1,5,6

1. Fare una soluzione di magazzino di 2,2,2-tribromoetanolo ad una concentrazione di 1 g per 1 mL di alcool terziario di amil. Riscaldare a 40,u201245 gradi centigradi per 24 h. Conservare a 4 gradi centigradi per 12 mesi.
2. Per la soluzione di lavoro, diluire 0,5 mL di soluzione stock in 19,5 mL di salina (0,9% NaCl) a 25 mg/mL. Riscaldare a 40-u201245 s per 1 h. Conservare a 4 gradi centigradi per 1 mese.

3. Configurazione del sistema ECG

1. Assicurarsi di impostare il sistema in modo che non vi sia rumore o vibrazione entro 2 m poiché i segnali ECG nel mouse sono sensibili al rumore e al movimento ambientale.
2. Preparare la configurazione hardware: un sistema di acquisizione dati, un amplificatore biologico e un computer installato con un software di analisi dei dati ECG.
   1. Collegare il sistema di acquisizione dati alla rete elettrica (AC) utilizzando il cavo di alimentazione.
   2. Collegare il sistema di acquisizione dati al computer utilizzando un cavo USB.
   3. Collegare l'uscita del segnale sul pannello posteriore dell'amplificatore biologico a un ingresso analogico sul pannello anteriore del sistema di acquisizione dati utilizzando un cavo.
   4. Collegare l'uscita I²C del sistema di acquisizione dati all'ingresso I²C dell'amplificatore biologico utilizzando il cavo I²C.
   5. Collegare il cavo dell'amplificatore bio a 3 cavi alla presa di ingresso a 6 pin sul pannello anteriore dell'amplificatore biologico.
   6. Accendere il sistema di acquisizione dati utilizzando l'interruttore sul pannello indietro.
      NOTA: In breve, i segnali vengono amplificati attraverso un amplificatore biologico e registrati utilizzando un sistema computerizzato di acquisizione e analisi dei dati con le seguenti impostazioni di canale: velocità di campionamento di 2 k/s, intervallo di 20 mV e impostazione del filtro passa-basso di 200 Hz.
3. Aprire il programma software di analisi e configurarlo per l'acquisizione dei dati ECG.
   1. Andare a Setup (Configurazione) Impostazioni canale. Impostare la frequenza di campionamento su 2 k/s. Impostare l'intervallo su 20 mV. Impostare l'amplificatore di ingresso su 200 Hz di passaggio basso.
   2. Vai all'analisi ECG Impostazioni ECG. Scegliere "Mouse" nella finestra delle impostazioni Rilevamento e Analisi.
   3. Nel pannello Media, scegliere di concatenare N (ad esempio, 4 battute o 60 s) cicli cardiaci consecutivi in un unico segnale medio per la vista in media e la vista tabella.
   4. Nel pannello QTc, selezionare il metodo "Bazett", definito come il valore corretto della frequenza cardiaca dell'intervallo QT: QTc , QT / (RR/100)^0,5, intervallo RR : 60 / frequenza cardiaca⁷.

4. Misurazione ECG

1. Posizionare il mouse su una bilancia di precisione e registrarne il peso.
2. Indurre l'anestesia nel topo mediante iniezione intraperitoneale (i.p.) di una soluzione di lavoro di tribromoetanolo (18 mL di soluzione di lavoro per kg peso corporeo (b.w.)).
3. Posizionare un topo anetizzato in posizione supina. Assicurarsi che il mouse sia completamente aerato (meno di 2 min).
4. Inserire gli elettrodi con aghi di agopuntura sottocutaneamente negli arti anteriori destro e sinistro e nell'arto posteriore sinistro secondo lo schema ECG di piombo II e fissarli con del nastro adesivo (Figura 1). Assicurarsi che la profondità e la posizione degli elettrodi inseriti siano coerenti durante gli esperimenti.
5. Collegare le altre estremità degli elettrodi facendo clic su di esse nei tre connettori a scatto all'altra estremità dei fili di piombo del cavo dell'amplificatore bio a 3 piombo.
6. Farmaci per l'iniezione (i.p.) 3 min dopo la consegna degli anestetici (Figura 2).
7. Iniziare a registrare l'ECG 10 min dopo l'iniezione di anestetici. Una volta completata la registrazione, utilizzare i dati ECG da 12 a 17 min dopo l'iniezione di anestetici per l'analisi.
8. Alla fine della sessione di registrazione ECG, rimuovere con attenzione gli elettrodi.

5. Analisi dei dati ECG

1. Vai all'analisi ECG Media Vista e assicurarsi che il software identifichi correttamente l'inizio e la fine dell'onda P, del complesso QRS e dell'onda T in singoli battiti. Se necessario, la correzione manuale di queste onde e intervalli è possibile spostando i cursori spostati nelle posizioni appropriate.
   NOTA: come illustrato nella figura 3A, l'intervallo PR si estende l'insorgenza dell'onda P a quella del complesso QRS (per lo più manca l'onda Q in un ECG del mouse). La durata QRS si estende dall'inizio dell'onda Q (principalmente un'onda R in un ECG del topo) fino alla fine dell'onda S. L'intervallo QT comprende l'insorgenza dell'onda Q (per lo più l'onda R in un ECG del topo) fino alla fine dell'onda T. Si noti la durata più breve e l'assenza di un segmento Q wave e ST nel mouse ECG rispetto all'ECG⁸umano .
2. Vai all'analisi ECG Vista tabella e selezionare i dati ECG identificati correttamente controllando le singole battute nella finestra Vista media.
   NOTA: la figura 3 mostra diversi esempi di segnali ECG del mouse effettivi. Figura 3A rappresenta un normale segnale wild-type che è stato identificato correttamente per quanto riguarda P onda, complesso QRS, e onda T. La selezione computerizzata delle onde PQRS può incorrere in errori di spostamento, come nella Figura 3B un normale segnale wild-type che sposta fuori strada l'insorgenza dell'onda P. Nella figura 3C un segnale ECG che sposta male la fine del complesso QRS, con conseguente sopraelevazione della durata di QRS. Nella figura 3D un segnale ECG che sposta male la fine del complesso QRS, con conseguente sottovalutazione del complesso QRS a causa dell'onda T ambigua e Figura 3E un segnale ECG con un'onda T non identificabile. Senza esclusione o correzioni manuali, gli intervalli PQRS possono essere superati o sottovalutati. Assicurarsi di selezionare i segnali ECG che sono stati identificati correttamente e i segnali che non perdono i picchi di destinazione. Di conseguenza, tali casi, tra cui B, C, D ed E(Figura 3),sono esclusi nella stima accurata dei parametri ECG in generale.
3. Selezionare i dati ECG di interesse in Visualizza come tabella e copiarli/incollarli in un file di foglio di calcolo.

6. Analisi statistica

1. Eseguire l'analisi statistica utilizzando un programma di statistiche. Analizzare i dati con le condizioni sperimentali accecate. Esegui il test tdi Student e il Mann-Whitney U-test per i confronti di 2 gruppi. I numeri in ogni figura indicano il numero di topi utilizzati per ogni gruppo. Segnalare i risultati come media : SEM.
2. Considerare le differenze con p < 0,05 per U-test come statisticamente significative: , p < 0,05; p < 0,01; e , p < 0,005 rispetto ai rispettivi controlli.

Risultati

Esperimenti farmacologici

Per determinare se la nostra misurazione ECG non invasiva riflette l'influenza della modulazione autonomica sul sistema di conduzione cardiaca, i normali topi Balb/c sono stati sfidati con agonisti e antagonisti del sistema nervoso autonomo (ANS). L'atropina e il carbacholo sono stati utilizzati rispettivamente per il blocco e la stimolazione autonomici parasimpatici, mentre il propranololo e l'isoprenal sono stati somministrati per provocare il blocc...

Discussione

Il protocollo prevede diversi passaggi critici. L'ambiente circostante dovrebbe essere libero da rumore e vibrazioni. Gli elettrodi ECG devono essere inseriti sotto la pelle in modo stabile e coerente di cui il passo di inserimento richiede esperimenti preliminari fino a quando il ricercatore è tecnicamente esperto. Inoltre, l'anestetico deve essere preparato e conservato in modo appropriato e utilizzato alla dose appropriata. Infine, le onde PQRS dovrebbero essere posizionate in modo appropriato nelle singole battute E...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402-25G	anesthetics, Avertin
Animal	Japan SLC, Inc., Shizuoka, Japan		Balb/c mice, male, aged 7-9 weeks
Atropine	Sigma-Aldrich	A0123	parasympathetic antagonist
BioAmp	AD Instruments, Bella Vista, Australia	ML132	bio amplifier
Carbachol	Sigma-Aldrich	C4382	parasympathetic agonist
Electrodes with acupuncture needles	DongBang Acupuncture Inc., Sungnam, Korea	DB106	0.20 x 15 mm
Isoprenaline	Sigma-Aldrich	I2760	sympathetic agonist
LabChart 8	AD Instruments, Bella Vista, Australia		data analysis software
Mouse food	LabDiet, St. Louis, MO, USA	5L79	Mouse diet
PowerLab 2/28	AD Instruments, Bella Vista, Australia		data acquisition system
Propranolol	Sigma-Aldrich	P0884	sympathetic antagonist
SPSS Statistics program	SPSS	SPSS 25.0	statistics program