JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

عصير البنكرياس هو مصدر ثمين للمؤشرات الحيوية لسرطان البنكرياس البشري. نصف هنا طريقة لإجراء الجمع أثناء الجراحة. للتغلب على التحدي المتمثل في اعتماد هذا الإجراء في نماذج الفئران ، نقترح عينة بديلة ، السائل الخلالي للورم ، ونصف هنا بروتوكولين لعزله.

Abstract

سرطان البنكرياس الغدي (PDAC) هو السبب الرئيسي الرابع للوفاة المرتبطة بالسرطان ، وسرعان ما يصبح السبب الثاني. هناك حاجة ملحة للمتغيرات المرتبطة بأمراض البنكرياس المحددة للمساعدة في التشخيص التفريقي قبل الجراحة وتوصيف المريض. عصير البنكرياس هو سائل جسم غير مستكشف نسبيا ، والذي ، بسبب قربه من موقع الورم ، يعكس التغيرات في الأنسجة المحيطة. هنا نصف بالتفصيل إجراء الجمع أثناء الجراحة. لسوء الحظ ، فإن ترجمة مجموعة عصير البنكرياس إلى نماذج الفئران من PDAC ، لإجراء دراسات ميكانيكية ، أمر صعب للغاية من الناحية الفنية. السائل الخلالي الورمي (TIF) هو السائل خارج الخلية ، خارج الدم والبلازما ، والذي يستحم الخلايا السرطانية واللحمية. على غرار عصير البنكرياس ، بالنسبة لخصائصه لجمع وتركيز الجزيئات الموجودة في البلازما ، يمكن استغلال TIF كمؤشر على التغيرات البيئية الدقيقة وكمصدر قيم للمؤشرات الحيوية المرتبطة بالأمراض. نظرا لأن TIF لا يمكن الوصول إليه بسهولة ، فقد تم اقتراح تقنيات مختلفة لعزله. نصف هنا طريقتين بسيطتين ومتساهلتين تقنيا لعزله: الطرد المركزي للأنسجة وإزالة الأنسجة.

Introduction

سرطان البنكرياس الغدي القنوي (PDAC) هو واحد من الأورام الأكثر عدوانية ، وسرعان ما يصبح السبب الرئيسي الثاني للوفاة1،2،3. وهي معروفة ببيئتها الدقيقة المثبطة للمناعة وعدم استجابتها لبروتوكولات العلاج المناعي4. حاليا ، لا يزال الاستئصال الجراحي هو الخيار العلاجي الوحيد ل PDAC ، ولكن هناك تواتر عال من الانتكاسات المبكرة ومضاعفات ما بعد الجراحة. عدم وجود أعراض محددة حتى مرحلة متقدمة لا يسمح بالتشخيص المبكر ، مما يساهم في المواعيد النهائية للمرض. علاوة على ذلك ، فإن تداخل الأعراض بين PDAC وأمراض البنكرياس الحميدة الأخرى يمكن أن يعوق تحقيق تشخيص سريع وموثوق به مع استراتيجيات التشخيص الحالية. يمكن أن يؤدي تحديد المتغيرات المرتبطة بأمراض البنكرياس المحددة إلى تسهيل عملية صنع القرار الجراحي وتحسين تنميط المريض.

تم تحقيق نتائج واعدة في اكتشاف المؤشرات الحيوية باستخدام سوائل الجسم التي يسهل الوصول إليها ، مثل الدم5،6،7 ، البول8 ، اللعاب9 وعصير البنكرياس 10،11،12. وقد استغلت العديد من الدراسات نهج "omics" الشاملة ، مثل التقنيات الجينومية والبروتينية والأيضية ، لتحديد الجزيئات أو التوقيعات المرشحة التي يمكن أن تميز بين PDAC وغيرها من أمراض البنكرياس الحميدة. لقد أثبتنا مؤخرا أن عصير البنكرياس ، وهو سائل جسم غير مستكشف نسبيا ، يمكن استخدامه لتحديد التوقيعات الأيضية للمرضى الذين لديهم ملامح سريرية متميزة12. عصير البنكرياس هو سائل غني بالبروتين ، والذي يتراكم إفراز خلايا قنوات البنكرياس ويتدفق إلى قناة البنكرياس الرئيسية ، ثم إلى القناة الصفراوية المشتركة الرئيسية. نظرا لقربه من البنكرياس ، يمكن أن يتأثر بشدة بالاضطرابات البيئية الدقيقة التي تسببها كتلة الورم (الشكل 1) ، وبالتالي فهو أكثر إفادة من الدم أو البول ، أو التنميط القائم على الأنسجة. استكشفت العديد من الدراسات إمكانات عصير البنكرياس لتحديد المؤشرات الحيوية الجديدة للمرض باستخدام أساليب مختلفة ، بما في ذلك التحليل الخلوي 13 ، والتحليل البروتيني الذي أجراه قياس الطيف الكتلي 14,15 ، وتقييم العلامات الجينية واللاجينية مثل طفرات K-ras و p53 16,17 ، والتغيرات في مثيلة الحمض النووي 18 ، و miRNAs 19 . من الناحية الفنية ، يمكن جمع عصير البنكرياس أثناء الجراحة أو بإجراءات طفيفة التوغل ، مثل الموجات فوق الصوتية بالمنظار ، أو تصوير البنكرياس الصفراوي الرجعي ، أو عن طريق الجمع بالمنظار لإفراز عصير الاثني عشر20. ليس من الواضح بعد إلى أي مدى يتأثر تكوين عصير البنكرياس بتقنية الجمع المستخدمة. نصف هنا إجراء الجمع أثناء العملية الجراحية ونوضح أن عصير البنكرياس يمكن أن يمثل مصدرا ثمينا للمؤشرات الحيوية PDAC.

figure-introduction-3027
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لجمع عصير البنكرياس. (أ) تمثيل تخطيطي يصور إفراز عصير البنكرياس في قناة البنكرياس وجمعه أثناء الجراحة. يظهر الجزء الداخلي صورة مقربة للبيئة الدقيقة للورم: يجمع عصير البنكرياس الجزيئات التي تطلقها الخلايا السرطانية واللحمية في قنوات البنكرياس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

سيكون جمع عصير البنكرياس في نماذج الفئران الوراثية وتقويم العظام من PDAC موضع تقدير من منظور استغلال هذا السائل الحيوي في الدراسات الميكانيكية قبل السريرية. ومع ذلك ، يمكن أن يكون هذا الإجراء صعبا للغاية من الناحية الفنية وغير ممكن للنماذج الأبسط مثل الأورام تحت الجلد. لهذا السبب ، حددنا السائل الخلالي للورم (TIF) كمصدر بديل لعصير البنكرياس ، لخصائصه المماثلة المتمثلة في العمل كمؤشر على الاضطرابات المحيطة. السائل الخلالي (IF) هو السائل خارج الخلية ، الموجود خارج الأوعية الدموية واللمفاوية ، والذي يستحم خلايا الأنسجة21. يتأثر تكوين IF بكل من الدورة الدموية للعضو والإفراز المحلي ؛ في الواقع ، تنتج الخلايا المحيطة بنشاط وتفرز البروتينات في IF21. يعكس الخلالي التغيرات البيئية الدقيقة للأنسجة المحيطة ، وبالتالي يمكن أن يمثل مصدرا قيما لاكتشاف المؤشرات الحيوية في العديد من السياقات المرضية ، مثل الأورام. يمكن استخدام التركيز العالي للبروتينات المفرزة محليا في TIF لتحديد الجزيئات المرشحة لاختبارها كمؤشرات حيوية تنبؤية أو تشخيصية في البلازما22،23،24. أثبتت العديد من الدراسات أن TIF عينة مناسبة للنهج البروتينية عالية الإنتاجية ، مثل تقنيات قياس الطيف الكتلي 23،24،25 ، وكذلك نهج ELISA متعدد الإرسال26 ، وتوصيف الحمض النووي الريبي الميكروي27.

تم اقتراح عدة طرق لعزل IF في الأورام ، والتي يمكن تصنيفها على نطاق واسع على أنها في الجسم الحي (الترشيح الفائق الشعري 28،29،30،31 وغسيل الكلى المجهري32،33،34،35) وطرق خارج الجسم الحي (الطرد المركزي للأنسجة22،36،37،38 و إزالة الأنسجة39،40،41،42). تمت مراجعة هذه التقنيات بتفصيل واسعالنطاق 43,44. وينبغي أن يأخذ اختيار الطريقة المناسبة في الحسبان مسائل من قبيل التحليلات والتطبيقات النهائية والحجم المسترد. استخدمنا مؤخرا هذا النهج كدليل على المبدأ لإثبات النشاط الأيضي المختلف للأورام من خطين من خلايا سرطان البنكرياس الغدي الفئران12. استنادا إلى الأدبيات24,38 ، اخترنا استخدام طريقة الطرد المركزي منخفضة السرعة لتجنب كسر الخلايا وتخفيفها من المحتوى داخل الخلايا. تعكس كل من كمية الجلوكوز واللاكتات في TIF الخصائص المختلفة للتحلل السكري لخطي الخلايا المختلفين. هنا نصف بالتفصيل بروتوكول الطريقتين الأكثر استخداما لعزل TIF: الطرد المركزي للأنسجة وإزالة الأنسجة (الشكل 2).

figure-introduction-6681
الشكل 2: التمثيل التخطيطي لطرق عزل السائل الخلالي للورم. توضيح تخطيطي للتقنيات الموصوفة بالتفصيل في البروتوكول ، وهي الطرد المركزي للأنسجة (A) وإزالة الأنسجة (B). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Protocol

بالنسبة لجميع المرضى المسجلين ، تم جمع الدم المحيطي وعصير البنكرياس في وقت الجراحة وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل اللجنة الأخلاقية للمؤسسة. تم تسجيل جميع المرضى في الدراسة بعد التوقيع على موافقة مستنيرة بما في ذلك جمع العينات البيولوجية والبيانات السريرية. تمت الموافقة على الدراسة من قبل اللجنة الأخلاقية للمؤسسة (البروتوكول رقم ICH-595 ، الموافقة الصادرة في مايو 2009). تم مطابقة الإجراءات التي تنطوي على الفئران ورعايتها مع إرشادات الاتحاد الأوروبي والمبادئ التوجيهية المؤسسية (معرف البروتوكول 121/2016-PR).

1. عزل عصير البنكرياس

ملاحظة: يتم تنفيذ سحب عصير البنكرياس في سياق إجراء مفتوح لاستئصال البنكرياس (على سبيل المثال، استئصال البنكرياس والاثني عشر، استئصال البنكرياس الكلي، استئصال البنكرياس البعيد) من قبل مجموعة من جراحي البنكرياس الخبراء.

  1. اختيار المريض
    1. النظر في الإجراء أي مريض المقرر لاستئصال البنكرياس مفتوحة.
    2. تأكد من الإدراج إذا كان حجم قناة البنكرياس الرئيسية يعتبر كافيا للسماح باسترجاع عصير البنكرياس. يعتبر الحد الأدنى لقطر قناة البنكرياس الرئيسية 2 مم في التصوير المقطعي المحوسب المعزز بالتباين.
  2. دراسة ما قبل الجراحة لقناة البنكرياس في التصوير المقطعي المحوسب المعزز بالتباين للمساعدة في التخطيط لاسترجاع عصير البنكرياس
    1. توطين ثلاثي الأبعاد لقناة البنكرياس الرئيسية داخل الغدة على مستوى عنق البنكرياس: قياس مسافة قناة البنكرياس الرئيسية من هامش البنكرياس الأمامي والعلوي والسفلي على شرائح المقطع العرضي ، والعروض الإكليلية والسهمية. بمجرد الدخول إلى غرفة العمليات ، استخدم هذه القياسات لتقريب المكان الصحيح لثقب البنكرياس لتعليب قناة Wirsung واسترداد عصير البنكرياس.
  3. إعداد المواد
    1. المواد المعقمة: افتح المغلف المعقم لإبرة واحدة سعة 25 جم ومحقنة واحدة سعة 3 مل ، وضعها في الحقل المعقم بالتعاون مع ممرضة الفرك.
    2. مادة غير معقمة: احتفظ بأنبوب اختبار فراغ K2EDTA سعة 3 مل جاهزا في متناول اليد في غرفة العمليات لتخزين السائل.
  4. إعداد المريض
    1. ضع المريض على سرير غرفة العمليات. حث التخدير العام المختلط ، باستخدام ريميفنتانيل ، سيفوران وروكورونيوم ، ثم التنبيب والبدء في تهوية المريض. ضع المريض في الاستلقاء الضعيف مع وضع الذراع اليمنى على الجسم واختطاف الذراع اليسرى إلى 90 درجة مثبتة على لوح ذراعين.
    2. تطهير جلد البطن في موقع الشق. إنشاء والحفاظ على حقل معقم على البطن لف المريض.
  5. الإجراء الجراحي
    1. إجراء شق تحت الوربي والوصول إلى تجويف البطن. ضع تراجع بطن روشارد للتعرض للأعضاء.
    2. كشف وتعبئة البنكرياس من خلال مناورة كوتشر ، وفتح الرباط المعدي ، وشق الأنسجة خلف الصفاق على طول الحدود العليا والسفلية للبنكرياس مما يخلق مستوى تشريح بين عنق البنكرياس والوريد المساريقي العلوي الموجود خلفيا.
    3. بمجرد تعبئة البنكرياس وتعريضه ، انتقل إلى سحب عصير البنكرياس قبل تقسيم عنق البنكرياس.
  6. تحديد وتوطين قناة البنكرياس
    1. تقدير موقع قناة البنكرياس باستخدام القياس المأخوذ في التصوير ثم ملامسة السطح الأمامي للبنكرياس لتحديد موقعه بدقة.
  7. مجموعة من عصير البنكرياس
    1. امسك رأس البنكرياس والاثني عشر من الأسفل وارفعه باليد اليسرى ، مع تحديد موقع قناة البنكرياس بالرقم الأول.
    2. تمسك باليد اليمنى لمحقنة 3 مل مع إبرة 25 G مثبتة عليها.
    3. استخدم اليد اليمنى لإدخال الإبرة في البنكرياس بعيدا إلى الإبهام الأيسر. حدد عمق الاختراق ودرجة ميل الإبرة بناء على قياسات ما قبل الجراحة وعلى تصور اختراق جدار القناة.
    4. سحب العصير مع حقنة. إذا لم يكن من الممكن استرداد العصير ، فقم بنقل الإبرة في الاتجاهات الأربعة في محاولة لتعليب قناة البنكرياس.
    5. بمجرد استرداد عصير البنكرياس ، انقله خارج الحقل المعقم وانقله إلى أنبوب اختبار الفراغ K2EDTA سعة 3 مل. احتفظ بها عند 4 درجات مئوية حتى يتم نقل العينة إلى المختبر وانتقل إلى مزيد من المعالجة في أقرب وقت ممكن.
      ملاحظة: يختلف حجم عصير البنكرياس الذي يمكن استرداده باستخدام هذا الإجراء اختلافا كبيرا ، حيث يتراوح تقريبا من 0.2 مل إلى 3 مل في تجربتنا. تعتمد كمية العصير المستردة بشكل كبير على المريض: بعد قناة Wirsung والحالة الوظيفية للبنكرياس (يعمل مقابل الغدة الضمورية). في تجربتنا لا يوجد وسيلة مناسبة يمكن استخدامها لزيادة كمية عصير البنكرياس المستردة.

2. تجهيز عصير البنكرياس

  1. عصير البنكرياس بالطرد المركزي في 400 × غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة أي خلايا أو حطام.
    ملاحظة: يجب أن يكون عصير البنكرياس واضحا وشفافا في اللون قبل الطرد المركزي. يمكن أن يحدث تلوث الدم أثناء الجراحة في بعض الأحيان ، مما يجعل العينة تبدو أكثر غموضا واحمرارا في اللون. النظر في استبعاد هذه العينات من التحليلات الإضافية.
  2. استرجع السوبرناتانت وأليكوت وخزنه عند -80 درجة مئوية حتى إجراء مزيد من التحليلات.

3. تحريض الأورام تحت الجلد

ملاحظة: تم الحصول على خطوط خلايا الفئران Panc02 و DT6606 من البروفيسور لورينزو بيمونتي (معهد سان رافاييل للسكري ، ميلانو ، إيطاليا) والبروفيسور فرانشيسكو نوفيلي (مركز البحوث التجريبية والدراسات الطبية ، تورينو ، إيطاليا) على التوالي ، كما هو موضح سابقا12.

  1. نمو الخلايا السرطانية
    1. خلايا Panc02 و DT6606 في معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 متوسطة تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، 2mM L-Glutamine و 1٪ مضاد حيوي للبنسلين ستربتومايسين.
    2. إذابة الخلايا المجمدة قبل 1-2 أسابيع من حقن الورم ، وفقا لمعدل نمو خط الخلية.
    3. تنمو الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 ورطوبة 95٪ في ظروف معقمة.
    4. افصل الخلايا بمحلول Trypsin / EDTA بنسبة 0.025٪ لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية عندما تصل إلى 80٪ من الالتقاء وتخلص من التربسين عن طريق الطرد المركزي.
      ملاحظة: DT6606 هي خلايا أولية وليست مخلدة ومشتقة من الماوس LSL-KrasG12D-Pdx1-Cre ، ويجب عدم تمريرها أكثر من 3 مرات قبل الحقن في الجسم الحي من أجل الحفاظ على خصائصها الأصلية. يوصى بإذابة خلايا DT6606 قبل 7-10 أيام من الحقن.
  2. حقن الخلايا السرطانية في الجسم الحي
    1. التريبسين الخلايا (انظر الخطوة 3.1.4) وغسلها مرة واحدة مع الفوسفات المخزن مؤقتا المالحة (PBS). تخلص من PBS عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الخلايا في PBS جديدة قبل العد.
    2. عد الخلايا وأعد تعليقها في PBS بتركيز 0.5-1 × 107 خلايا / مل من أجل الحصول على تركيز نهائي من 0.5-1 × 106 خلايا / 100 ميكرولتر للحقن في كل ماوس. تحضير الخلايا الزائدة. حافظ على الخلايا عند 4 درجات مئوية أو على الجليد حتى نهاية الإجراء.
    3. قم بتجميع الحيوانات (أنثى الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر 8 أسابيع) في أقفاص مختلفة وفقا لخطوط أو علاجات خلوية مختلفة.
    4. كبح جماح الحيوانات يدويا وتخديرها باستخدام خليط من الكيتامين (80 ملغم / كغ) و Xylazine (10 ملغ / كغ) أو وفقا للإجراءات المعتمدة محليا.
    5. حلق موقع الحقن ، وعادة ما يكون جناحا فوق الساق ، باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية وقم بتنظيف موقع الحقن بعناية بالكحول.
    6. ماصة لأعلى ولأسفل تعليق الخلية مع حقنة 1 مل ، وإزالة أي فقاعات الهواء عن طريق تحريك المكبس لأعلى ولأسفل. قم بتوصيل إبرة 25 جم بالحقنة وادفع المكبس لأعلى حتى يصل تعليق الخلية إلى فتحة الإبرة.
    7. قرصة جلد الجناح مع ملقط مسطح الرؤوس وإدخال الإبرة بعناية في قاعدة طية الجلد بين الملقط دون ثقب التجويف البريتوني أو العضلات. للتحقق من الموضع الصحيح للإبرة ، حاول بلطف تحريك طرف الإبرة جانبيا تحت الجلد. يجب أن تتحرك الإبرة بحرية.
    8. حقن ببطء 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا (التي تحتوي على 0.5-1 × 106 خلايا) ، وربط بلطف موقع الحقن لبضع ثوان وسحب الإبرة ببطء دون أي حركة جانبية.
    9. أعد الفأر مرة أخرى إلى قفصه وراقب التعافي من التخدير.
    10. تحقق من نمو الورم باستخدام الفرجار لمدة 3-4 أسابيع. القتل الرحيم للحيوانات عندما تصل الأورام إلى حوالي 0.5-1 سم3 باستخدام CO2 أو وفقا للإجراءات المعتمدة محليا.

4. عزل السائل الخلالي للورم (TIF)

  1. استئصال الأورام تحت الجلد
    1. سد أطراف الحيوانات بشريط ورقي وتنظيف الجلد بالكحول. قطع الجلد مفتوحة على البطن من أجل فصله عن الصفاق والمضي قدما حتى الأطراف. استئصال الورم المزروع تحت جلد الجناح بمساعدة المقص والمشابك وفي النهاية مشرط.
    2. قم بوزن الورم واحتفظ به في أنبوب نظيف على الجليد حتى بعد عزل TIF.
  2. عزل TIF عن طريق الطرد المركزي
    1. قطع الورم إلى نصفين ، وشطف الجزأين بسرعة في PBS ولطخها بلطف على ورق الترشيح لإزالة الفائض من PBS. نفذ هذه الخطوات في أسرع وقت ممكن لتجنب التبخر من الورم.
    2. انقل الورم على الفور إلى مصفاة خلايا نايلون 20 ميكرومتر مثبتة فوق أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
    3. جهاز طرد مركزي للأنبوب عند 400 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يحافظ جهاز الطرد المركزي منخفض السرعة هذا على سلامة الخلايا لتجنب تلوث TIF بواسطة المقصورة داخل الخلايا. يمكن اختبار تسرب المحتوى داخل الخلايا في التطبيقات النهائية على سبيل المثال من خلال تقييم وجود بروتينات التدبير المنزلي داخل الخلايا ، مثل البروتينات الريبوسومية25.
    4. استرجع TIF من أسفل الأنبوب ، ثم قم بتجميده على الفور على الثلج الجاف وقم بتخزينه عند -80 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل.
      اختياري: استنادا إلى التحليل البروتيني المصب الذي سيتم إجراؤه، قم بتخفيف العينة في PBS باستخدام كوكتيل مثبط للأنزيم البروتيني لتجنب تدهور جزيئات معينة.
      ملاحظة: اعتمادا على تكوين الورم، في بعض الحالات الأورام الصغيرة جدا لا تنتج أي سوائل.
  3. عزل TIF عن طريق الاستخلاص
    1. قطع الورم إلى قطع صغيرة (≈1-3 مم3) بمقص أو مشرط وشطفه بعناية باستخدام PBS البارد.
      ملاحظة: في هذه الخطوة ، من المهم جدا العمل بسرعة وتنفيذ الحد الأدنى من التلاعب لتجنب تلف الخلايا.
    2. انقل قطع الورم إلى أنبوب 1.5 مل وأضف 500 ميكرولتر من PBS مع كوكتيل مثبط للأنزيم البروتيني لتجنب تدهور التحليلات. احتضان لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    3. استعادة supernatant ونقله إلى أنبوب جديد 1.5 مل. جهاز طرد مركزي عند 1000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة أي خلايا من العينة.
    4. انقل المادة الفائقة إلى أنبوب جديد وأجهزة طرد مركزي مرة أخرى عند 2000 × g لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    5. انقل السوبرنات إلى أنبوب جديد وأجهزة طرد مركزي مرة أخرى عند 20000 × g لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية لإزالة أي حطام. استعادة السوبرناتانت. على الفور aliquot وتجميد عينة TIF على الثلج الجاف وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل.

النتائج

اتبعنا الإجراء الموصوف أعلاه للحصول على عصير البنكرياس من المرضى الذين يعانون من PDAC (n = 31) وغيرها من أمراض البنكرياس الحميدة (غير PDAC ، n = 9) ، بما في ذلك التهاب البنكرياس (n = 2) ، أورام الحليمي الأمبولا (n = 4) ، أورام الغدد الصماء العصبية (n = 2) ، الأورام المخاطية الحليمية داخل القنوات (IPMN ؛ n = 1)

Discussion

في هذه الدراسة ، وصفنا تقنية جمع عصير البنكرياس أثناء العملية الجراحية ، وهي خزعة سائلة غير مستكشفة إلى حد كبير. لقد أظهرنا مؤخرا أنه يمكن استغلال عصير البنكرياس كمصدر للعلامات الأيضية للمرض12. أظهر تحليل الأيض على الخزعات السائلة الأخرى ، مثل الدم5،6...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

ونشكر روبرتا ميغليوري على المساعدة التقنية. تلقى البحث الذي أدى إلى هذه النتائج تمويلا من الجمعية الإيطالية للبحوث في كانكرو (AIRC) في إطار مشروع IG2016-ID.18443 - P.I. Marchesi Federica. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو اتخاذ قرار النشر أو إعداد المخطوطة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringeBD Biosciences309659
1.5 mL Eppendorf tubeGreiner BioOneGR616201
20 µm nylon cell strainerpluriSelect43-50020-03
25G needleBD Biosciences305122
3 mL K2EDTA vacutainerBD Biosciences366473
3 mL syringeBD Biosciences309656
50 mL Falcon tubeCorning352098
ClampsMedicon06.20.12
Disposable scalpelMedicom9000-10
Fetal bovine serumMicrotechMG10432
Flat-tipped forcepsMedicon06.00.10
Penicillin-StreptomycinLonzaECB3001D
Phosphate-Buffered Saline (PBS)Sigma-AldrichD8537
Protease inhibitor cocktailRoche34044100
RPMI mediumEurocloneECB9006L
ScissorsMedicon02.04.09
Trypsin/EDTA 1xLonzaBE17-161F
Ultraglutamine 100xLonzaBE17-605E/U1

References

  1. Costello, E., Greenhalf, W., Neoptolemos, J. P. New biomarkers and targets in pancreatic cancer and their application to treatment. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (8), 435-444 (2012).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2020. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 70 (1), 7-30 (2020).
  3. Neoptolemos, J. P., et al. Therapeutic developments in pancreatic cancer: current and future perspectives. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (6), 333-348 (2018).
  4. Sahin, I. H., Askan, G., Hu, Z. I., O'Reilly, E. M. Immunotherapy in pancreatic ductal adenocarcinoma: an emerging entity. Annals of Oncology. 28 (12), 2950-2961 (2017).
  5. Mayerle, J., et al. Metabolic biomarker signature to differentiate pancreatic ductal adenocarcinoma from chronic pancreatitis. Gut. 67 (1), 128-137 (2018).
  6. Bathe, O. F., et al. Feasibility of identifying pancreatic cancer based on serum metabolomics. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 20 (1), 140-147 (2011).
  7. Mayers, J. R., et al. Elevation of circulating branched-chain amino acids is an early event in human pancreatic adenocarcinoma development. Nature Medicine. 20 (10), 1193-1198 (2014).
  8. Napoli, C., et al. Urine metabolic signature of pancreatic ductal adenocarcinoma by (1)h nuclear magnetic resonance: identification, mapping, and evolution. Journal of Proteome Research. 11 (1), 1274-1283 (2012).
  9. Sugimoto, M., Wong, D. T., Hirayama, A., Soga, T., Tomita, M. Capillary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomics identified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles. Metabolomics. 6 (1), 78-95 (2010).
  10. Chen, R., et al. Comparison of pancreas juice proteins from cancer versus pancreatitis using quantitative proteomic analysis. Pancreas. 34 (1), 70-79 (2007).
  11. Mori, Y., et al. A minimally invasive and simple screening test for detection of pancreatic ductal adenocarcinoma using biomarkers in duodenal juice. Pancreas. 42 (2), 187-192 (2013).
  12. Cortese, N., et al. Metabolome of Pancreatic Juice Delineates Distinct Clinical Profiles of Pancreatic Cancer and Reveals a Link between Glucose Metabolism and PD-1+ Cells. Cancer Immunology Research. , (2020).
  13. Tanaka, M., et al. Cytologic Analysis of Pancreatic Juice Increases Specificity of Detection of Malignant IPMN-A Systematic Review. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 17 (11), 2199-2211 (2019).
  14. Chen, K. T., et al. Potential prognostic biomarkers of pancreatic cancer. Pancreas. 43 (1), 22-27 (2014).
  15. Tian, M., et al. Proteomic analysis identifies MMP-9, DJ-1 and A1BG as overexpressed proteins in pancreatic juice from pancreatic ductal adenocarcinoma patients. BMC Cancer. 8, 241 (2008).
  16. Shi, C., et al. Sensitive and quantitative detection of KRAS2 gene mutations in pancreatic duct juice differentiates patients with pancreatic cancer from chronic pancreatitis, potential for early detection. Cancer Biology & Therapy. 7 (3), 353-360 (2008).
  17. Rogers, C. D., et al. Differentiating pancreatic lesions by microarray and QPCR analysis of pancreatic juice RNAs. Cancer Biology & Therapy. 5 (10), 1383-1389 (2006).
  18. Matsubayashi, H., et al. DNA methylation alterations in the pancreatic juice of patients with suspected pancreatic disease. Cancer Research. 66 (2), 1208-1217 (2006).
  19. Cote, G. A., et al. A pilot study to develop a diagnostic test for pancreatic ductal adenocarcinoma based on differential expression of select miRNA in plasma and bile. The American Journal of Gastroenterology. 109 (12), 1942-1952 (2014).
  20. Yu, J., et al. Digital next-generation sequencing identifies low-abundance mutations in pancreatic juice samples collected from the duodenum of patients with pancreatic cancer and intraductal papillary mucinous neoplasms. Gut. , (2016).
  21. Wiig, H., Swartz, M. A. Interstitial fluid and lymph formation and transport: physiological regulation and roles in inflammation and cancer. Physiological Reviews. 92 (3), 1005-1060 (2012).
  22. Haslene-Hox, H., et al. A new method for isolation of interstitial fluid from human solid tumors applied to proteomic analysis of ovarian carcinoma tissue. PLoS One. 6 (4), 19217 (2011).
  23. Zhang, J., et al. In-depth proteomic analysis of tissue interstitial fluid for hepatocellular carcinoma serum biomarker discovery. British Journal of Cancer. 117 (11), 1676-1684 (2017).
  24. Sullivan, M. R., et al. Quantification of microenvironmental metabolites in murine cancers reveals determinants of tumor nutrient availability. Elife. 8, (2019).
  25. Matas-Nadal, C., et al. Evaluation of Tumor Interstitial Fluid-Extraction Methods for Proteome Analysis: Comparison of Biopsy Elution versus Centrifugation. Journal of Proteome Research. 19 (7), 2598-2605 (2020).
  26. Espinoza, J. A., et al. Cytokine profiling of tumor interstitial fluid of the breast and its relationship with lymphocyte infiltration and clinicopathological characteristics. Oncoimmunology. 5 (12), 1248015 (2016).
  27. Halvorsen, A. R., et al. Profiling of microRNAs in tumor interstitial fluid of breast tumors - a novel resource to identify biomarkers for prognostic classification and detection of cancer. Molecular Oncology. 11 (2), 220-234 (2017).
  28. Yang, S., Huang, C. M. Recent advances in protein profiling of tissues and tissue fluids. Expert Review of Proteomics. 4, 515-529 (2007).
  29. Huang, C. M., et al. Mass spectrometric proteomics profiles of in vivo tumor secretomes: capillary ultrafiltration sampling of regressive tumor masses. Proteomics. 6 (22), 6107-6116 (2006).
  30. Leegsma-Vogt, G., Janle, E., Ash, S. R., Venema, K., Korf, J. Utilization of in vivo ultrafiltration in biomedical research and clinical applications. Life Sciences. 73 (16), 2005-2018 (2003).
  31. Schneiderheinze, J. M., Hogan, B. L. Selective in vivo and in vitro sampling of proteins using miniature ultrafiltration sampling probes. Analytical Chemistry. 68 (21), 3758-3762 (1996).
  32. Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry. Proteomics Clinical Applications. 5 (11-12), 636-643 (2011).
  33. Xu, B. J., et al. Microdialysis combined with proteomics for protein identification in breast tumor microenvironment in vivo. Cancer Microenvironment. 4 (1), 61-71 (2010).
  34. Bendrik, C., Dabrosin, C. Estradiol increases IL-8 secretion of normal human breast tissue and breast cancer in vivo. The Journal of Immunology. 182 (1), 371-378 (2009).
  35. Ao, X., Stenken, J. A. Microdialysis sampling of cytokines. Methods. 38 (4), 331-341 (2006).
  36. Ho, P. C., et al. Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses. Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).
  37. Choi, J., et al. Intraperitoneal immunotherapy for metastatic ovarian carcinoma: Resistance of intratumoral collagen to antibody penetration. Clinical Cancer Research. 12 (6), 1906-1912 (2006).
  38. Wiig, H., Aukland, K., Tenstad, O. Isolation of interstitial fluid from rat mammary tumors by a centrifugation method. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (1), 416-424 (2003).
  39. Li, S., Wang, R., Zhang, M., Wang, L., Cheng, S. Proteomic analysis of non-small cell lung cancer tissue interstitial fluids. World Journal of Surgical Oncology. 11, 173 (2013).
  40. Fijneman, R. J., et al. Proximal fluid proteome profiling of mouse colon tumors reveals biomarkers for early diagnosis of human colorectal cancer. Clinical Cancer Research. 18 (9), 2613-2624 (2012).
  41. Teng, P. N., Hood, B. L., Sun, M., Dhir, R., Conrads, T. P. Differential proteomic analysis of renal cell carcinoma tissue interstitial fluid. Journal of Proteome Research. 10 (3), 1333-1342 (2011).
  42. Turtoi, A., et al. Novel comprehensive approach for accessible biomarker identification and absolute quantification from precious human tissues. Journal of Proteome Research. 10 (7), 3160-3182 (2011).
  43. Wagner, M., Wiig, H. Tumor Interstitial Fluid Formation, Characterization, and Clinical Implications. Frontiers in Oncology. 5, 115 (2015).
  44. Haslene-Hox, H., Tenstad, O., Wiig, H. Interstitial fluid-a reflection of the tumor cell microenvironment and secretome. Biochimica Biophysica Acta. 1834 (11), 2336-2346 (2013).
  45. Hsieh, S. Y., et al. Secreted ERBB3 isoforms are serum markers for early hepatoma in patients with chronic hepatitis and cirrhosis. Journal of Proteome Research. 10, 4715-4724 (2011).
  46. Sun, W., et al. Characterization of the liver tissue interstitial fluid (TIF) proteome indicates potential for application in liver disease biomarker discovery. Journal of Proteome Research. 9 (2), 1020-1031 (2010).
  47. Haslene-Hox, H., et al. Increased WD-repeat containing protein 1 in interstitial fluid from ovarian carcinomas shown by comparative proteomic analysis of malignant and healthy gynecological tissue. Biochimica Biophysica Acta. 1834 (11), 2347-2359 (2013).
  48. Wang, T. H., et al. Stress-induced phosphoprotein 1 as a secreted biomarker for human ovarian cancer promotes cancer cell proliferation. Molecular & Cellular Proteomics. 9, 1873-1884 (2010).
  49. Gromov, P., et al. Up-regulated proteins in the fluid bathing the tumour cell microenvironment as potential serological markers for early detection of cancer of the breast. Molecular Oncology. 4 (1), 65-89 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

165

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved