Pankreatik adenokarsinomun tümör mikroçevresini araştırmak için proksimal sıvıların izolasyonu

Özet

Pankreas suyu, insan pankreas kanseri için değerli bir biyobelirteç kaynağıdır. Burada intraoperatif toplama prosedürü için bir yöntem tarif ediyoruz. Bu prosedürü murin modellerinde benimseme zorluğunun üstesinden gelmek için, alternatif bir örnek, tümör interstisyel sıvısı öneriyoruz ve burada izolasyonu için iki protokol açıklıyoruz.

Özet

Pankreatik adenokarsinom (PDAC), kansere bağlı ölümlerin dördüncü önde gelen nedenidir ve yakında ikinci olacaktır. Preoperatif ayırıcı tanıya ve hasta profillemesine yardımcı olmak için spesifik pankreas patolojileriyle ilişkili değişkenlere acil ihtiyaç vardır. Pankreas suyu, tümör bölgesine yakınlığı nedeniyle çevredeki dokudaki değişiklikleri yansıtan nispeten keşfedilmemiş bir vücut sıvısıdır. Burada intraoperatif toplama prosedürünü ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Ne yazık ki, mekanik çalışmalar yapmak için pankreas suyu koleksiyonunu PDAC'nin murin modellerine çevirmek teknik olarak çok zordur. Tümör interstisyel sıvısı (TIF), tümör ve stromal hücreleri yıkayan kan ve plazma dışındaki hücre dışı sıvıdır. Pankreas suyuna benzer şekilde, plazmada seyreltilmiş olarak bulunan molekülleri toplama ve konsantre etme özelliği nedeniyle, TIF, mikro çevresel değişikliklerin bir göstergesi ve hastalıkla ilişkili biyobelirteçlerin değerli bir kaynağı olarak kullanılabilir. TIF'ye kolayca erişilemediğinden, izolasyonu için çeşitli teknikler önerilmiştir. Burada izolasyonu için iki basit ve teknik olarak iddiasız yöntem açıklıyoruz: doku santrifüjleme ve doku elüsyonu.

Giriş

Pankreatik duktal adenokarsinom (PDAC) en agresif tümörlerden biridir ve kısa sürede ikinci önde gelen ölüm nedeni haline gelecektir ^1,2,3. İmmünsüpresif mikro çevresi ve immünoterapi protokollerine yanıt vermemesi ile bilinir⁴. Günümüzde cerrahi rezeksiyon PDAC için hala tek küratif seçenektir, ancak erken nüks ve cerrahi sonrası komplikasyonların yüksek sıklığı vardır. İleri bir aşamaya kadar spesifik semptomların olmaması, erken tanıya izin vermez ve hastalığın son tarihlerine katkıda bulunur. Ayrıca, PDAC ve diğer benign pankreas patolojileri arasındaki semptomların örtüşmesi, mevcut tanı stratejileri ile hızlı ve güvenilir bir tanı konmasını engelleyebilir. Spesifik pankreas patolojileri ile ilişkili değişkenlerin tanımlanması, cerrahi karar verme sürecini kolaylaştırabilir ve hasta profillemesini iyileştirebilir.

Biyobelirteç keşfinde umut verici sonuçlar, kan^5,6,7, idrar⁸, tükürük⁹ ve pankreas suyu^10,11,12 gibi kolay erişilebilir vücut sıvıları kullanılarak elde edilmiştir. Birçok çalışma, PDAC ve diğer iyi huylu pankreas rahatsızlıkları arasında ayrım yapabilecek aday molekülleri veya imzaları tanımlamak için genomik, proteomik ve metabolomik teknikler gibi kapsamlı "omik" yaklaşımlardan yararlanmıştır. Son zamanlarda, nispeten keşfedilmemiş bir vücut sıvısı olan pankreas suyunun, farklı klinik profillere sahip hastaların metabolik imzalarını tanımlamak için kullanılabileceğini gösterdik¹². Pankreas suyu, pankreas duktal hücrelerinin sekretomunu biriktiren ve ana pankreas kanalına ve daha sonra ana ortak safra kanalına akan protein bakımından zengin bir sıvıdır. Pankreasa yakınlığı nedeniyle, tümör kütlesinin neden olduğu mikro çevresel pertürbasyonlardan güçlü bir şekilde etkilenebilir (Şekil 1) ve bu nedenle kan veya idrardan veya doku bazlı profillemeden daha bilgilendiricidir. Birçok çalışma, sitolojik analiz 13, kütle-spektrometri^14,15 tarafından gerçekleştirilen proteomik analiz, K-ras ve p53 mutasyonları gibi genetik ve epigenetik belirteçlerin değerlendirilmesi 16,17^, DNA metilasyonundaki değişiklikler ¹⁸ ve miRNA'lar ¹⁹ dahil olmak üzere çeşitli yaklaşımlar kullanarak pankreas suyunun hastalığın yeni biyobelirteçlerini tanımlama potansiyelini araştırmıştır. . Teknik olarak, pankreas suyu intraoperatif olarak veya endoskopik ultrason, retrograd kolanjiyo-pankreatografi gibi minimal invaziv prosedürlerle veya duodenal meyve suyu sekresyonu^20'nin endoskopik toplanmasıyla toplanabilir. Kullanılan toplama tekniğinden pankreas suyu bileşiminin ne ölçüde etkilendiği henüz belli değildir. Burada intraoperatif toplama prosedürünü açıklıyoruz ve pankreas suyunun PDAC biyobelirteçleri için değerli bir kaynak olabileceğini gösteriyoruz.

Şekil 1: Pankreas suyu koleksiyonunun şematik gösterimi. (A) Pankreas suyunun pankreas kanalına salgılanmasını ve ameliyat sırasında toplanmasını gösteren şematik gösterim. İç kısım, tümör mikro ortamının yakın çekimini gösterir: pankreas suyu, pankreas kanallarındaki tümör ve stromal hücreler tarafından salınan molekülleri toplar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

PDAC'nin genetik ve ortotopik fare modellerinde pankreas suyunun toplanması, bu biyoakışkanın klinik öncesi mekanik çalışmalarda kullanılması perspektifinde takdir edilecektir; Bununla birlikte, bu prosedür teknik olarak çok zor olabilir ve deri altı tümörler gibi daha basit modeller için uygun değildir. Bu nedenle, tümör interstisyel sıvısını (TIF), çevredeki pertürbasyonların bir göstergesi olarak hareket etme özelliğine benzer özelliği nedeniyle, pankreas suyuna alternatif bir kaynak olarak tanımladık. İnterstisyel sıvı (IF), kan ve lenfatik damarların dışında bulunan, doku hücrelerini yıkayan hücre dışı sıvıdır²¹. IF bileşimi hem organa kan dolaşımından hem de lokal sekresyondan etkilenirse; Aslında, çevreleyen hücreler aktif olarak IF^21'de protein üretir ve salgılar. İnterstisyum, çevredeki dokuların mikro çevresel değişikliklerini yansıtır ve bu nedenle tümörler gibi çeşitli patolojik bağlamlarda biyobelirteç keşfi için değerli bir kaynak olabilir. TIF'deki lokal olarak salgılanan proteinlerin yüksek konsantrasyonu, plazmada prognostik veya tanısal biyobelirteçler olarak test edilecek aday molekülleri tanımlamak için kullanılabilir^22,23,24. Birçok çalışma, TIF'nin kütle spektrometri teknikleri^23,24,25, multipleks ELISA yaklaşımları 26 ve mikroRNA profilleme²⁷ gibi yüksek verimli proteomik yaklaşımlar için uygun bir örnek olduğunu kanıtlamıştır.

Tümörlerde IF'nin izolasyonu için, in vivo (kılcal ultrafiltrasyon 28,29,30,31 ve mikrodiyaliz 32,33,34,35) ve ex vivo yöntemler (doku santrifüjleme^22,36,37,38 ve doku elüsyonu 39,40,41,42). Bu teknikler ayrıntılı olarak gözden geçirilmiştir^43,44. Uygun yöntemin seçimi, aşağı akış analizleri ve uygulamaları ve kurtarılan hacim gibi konuları dikkate almalıdır. Son zamanlarda bu yaklaşımı, iki murin pankreatik adenokarsinom hücre hattından tümörlerin farklı metabolik aktivitesini göstermek için bir ilke kanıtı olarak kullandık¹². ^Literatür 24,38'e dayanarak^, hücre kırılmasını ve hücre içi içerikten seyreltmeyi önlemek için düşük hızlı santrifüjleme yöntemini kullanmayı seçtik. TIF'deki hem glikoz hem de laktat miktarı, iki farklı hücre hattının farklı glikolitik özelliklerini yansıtıyordu. Burada, TIF'nin izolasyonu için en sık kullanılan iki yöntemin protokolünü ayrıntılı olarak açıklıyoruz: doku santrifüjleme ve doku elüsyonu (Şekil 2).

Şekil 2: Tümör interstisyel sıvı izolasyon yöntemlerinin şematik gösterimi. Protokolde ayrıntılı olarak açıklanan tekniklerin, yani doku santrifüjleme (A) ve doku elüsyonu (B) tekniklerinin şematik gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

Kayıt yaptıran tüm hastalar için periferik kan ve pankreas suyu, Kurum Etik Kurulu tarafından onaylanan protokollere göre ameliyat sırasında toplanmıştır. Tüm hastalar, biyolojik örneklerin ve klinik verilerin toplanması da dahil olmak üzere bilgilendirilmiş onam imzalandıktan sonra çalışmaya dahil edildi. Çalışma Kurum Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (protokol numarası ICH-595, Mayıs 2009'da verilen onay). Fareleri ve bakımlarını içeren prosedürler AB ve Kurumsal Kılavuzlara (protokol ID 121/2016-PR) uygundur.

1. Pankreas suyunun izolasyonu

NOT: Pankreas suyunun geri çekilmesi, açık bir pankreas rezeksiyonu prosedürü (örneğin, pankreatikoduodenektomi, total pankreatektomi, distal pankreatektomi) bağlamında, uzman pankreas cerrahlarının bir donanımı tarafından gerçekleştirilir.

1. Hasta seçimi
   1. Açık pankreas rezeksiyonu için planlanan herhangi bir hastayı prosedür için düşünün.
   2. Ana pankreas kanalı boyutunun pankreas suyu alımına izin vermek için yeterli olduğu düşünülürse dahil etmeyi onaylayın. Ana pankreas kanalının çapındaki minimum sınır, kontrastlı BT görüntülemede 2 mm olarak kabul edilir.
2. Pankreas suyu alımının planlanmasına yardımcı olmak için kontrastlı BT görüntülemede pankreas kanalının ameliyat öncesi incelenmesi
   1. Bez içindeki ana pankreas kanalını pankreas boynu seviyesinde üç boyutlu olarak lokalize edin: ana pankreas kanalının enine kesitsel slaytlarda anterior, superior ve inferior pankreas marjından uzaklığını ve koronal ve sagital görüntülemeleri ölçün. Ameliyathaneye girdikten sonra, Wirsung kanalını kanüle etmek ve pankreas suyunu almak için pankreasın delineceği doğru yere yaklaşmak için bu ölçümleri kullanın.
3. Malzemenin hazırlanması
   1. Steril malzeme: Bir adet 25 G iğne ve bir adet 3 mL şırınganın steril zarfını açın ve kese hemşiresinin işbirliği ile steril alana yerleştirin.
   2. Steril olmayan malzeme: Sıvının depolanması için ameliyathanede 3 mL'lik bir K2EDTA vakum test tüpünü elinizin altında bulundurun.
4. Hastanın hazırlanması
   1. Hastayı ameliyathane yatağına yerleştirin. Remifentanil, Sevorane ve Rocuronium kullanarak karışık genel anesteziyi indükleyin, ardından entübe edin ve hastayı ventilasyona başlayın. Hastayı, sağ kolu vücuda sıkışmış ve sol kolu kaçırılmış bir kol tahtasına sabitlenmiş 90 ° 'ye kadar kaçırılmış olarak sırtüstü dekübitus içine yerleştirin.
   2. Karın derisini kesi bölgesinde dezenfekte edin. Hastayı örten karın üzerinde steril bir alan oluşturun ve koruyun.
5. Cerrahi prosedür
   1. Subkostal bir kesi yapın ve karın boşluğuna erişin. Organ maruziyeti için bir Rochard abdominal retraksiyonu konumlandırın.
   2. Kocher manevrası ile pankreasın açığa çıkarılması ve mobilize edilmesi, gastrokolik ligamentin açılması, retroperitoneal dokunun pankreasın superior ve inferior sınırı boyunca kesilmesi, pankreas boynu ile posteriorda yer alan superior mezenterik ven arasında diseksiyon düzlemi oluşturulması.
   3. Pankreas mobilize edildikten ve maruz kaldıktan sonra, pankreas boynunun kesilmesinden önce pankreas suyunun çekilmesine devam edin.
6. Pankreas kanalının tanımlanması ve lokalizasyonu
   1. Görüntülemede alınan ölçümü kullanarak pankreas kanalının yerini tahmin edin ve ardından kesin yerini belirlemek için pankreasın ön yüzeyini palpe edin.
7. Pankreas suyunun toplanması
   1. Pankreas başını ve duodenumu alttan tutun ve pankreas kanalının yerini ilk basamakla işaretleyerek sol elinizle yükseltin.
   2. 25 G iğne takılı 3 mL şırınganın sağ eliyle tutun.
   3. İğneyi pankreasa sokmak için sağ elinizi kullanın, sadece sol başparmağın distalinde. Preoperatif ölçümlere ve kanal duvarına nüfuz etmiş olma algısına dayanarak iğnenin penetrasyon derinliğine ve eğim derecesine karar verin.
   4. Şırınga ile suyu çekin. Meyve suyunu almak mümkün değilse, pankreas kanalını kanüle etmeye çalışırken iğneyi dört yönde yeniden konumlandırın.
   5. Pankreas suyu alındıktan sonra, steril alanın dışına taşıyın ve 3 mL K2EDTA vakum test tüpüne aktarın. Numune laboratuvara aktarılana kadar 4 °C'de tutun ve mümkün olduğunca erken bir zamanda daha fazla işleme devam edin.
      NOT: Bu prosedürle geri kazanılabilecek pankreas suyunun hacmi, deneyimlerimize göre yaklaşık 0,2 mL ila 3 mL arasında değişen büyük ölçüde değişmektedir. Alınan meyve suyu miktarı büyük ölçüde hastaya bağlıdır: Wirsung kanalının boyutu ve pankreasın fonksiyonel durumu (atrofik beze karşı işlevsel). Deneyimlerimize göre, alınan pankreas suyu miktarını artırmak için kullanılabilecek bir yol yoktur.

2. Pankreas suyunun işlenmesi

1. Herhangi bir hücreyi veya döküntüyü çıkarmak için pankreas suyunu 400 x g'de 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
   NOT: Pankreas suyu, santrifüjlemeden önce berrak ve şeffaf renkte olmalıdır. Ameliyat sırasında kan kontaminasyonu bazen ortaya çıkabilir ve numunenin daha bulanık ve kırmızı renkte görünmesine neden olabilir. Bu tür numuneleri daha sonraki analizlerden hariç tutmayı düşünün.
2. Supernatant, aliquot'u geri kazanın ve daha sonraki analizlere kadar -80 ° C'de saklayın.

3. Subkutan tümörlerin indüksiyonu

NOT: Murin Panc02 ve DT6606 hücre hatları, daha önce açıklandığı gibi sırasıyla Prof. Lorenzo Piemonti (San Raffaele Diyabet Enstitüsü, Milano, İtalya) ve Prof. Francesco Novelli'den (Deneysel Araştırma ve Tıbbi Çalışmalar Merkezi, Torino, İtalya) elde edilmiştir¹².

1. Tümör hücrelerinin büyümesi
   1. Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 ortamındaki Kültür Panc02 ve DT6606 hücreleri% 10 fetal sığır serumu (FBS), 2mM L-Glutamin ve% 1 penisilin-streptomisin antibiyotik içerir.
   2. Dondurulmuş hücreleri, tümör enjeksiyonundan 1-2 hafta önce, hücre hattının büyüme hızına göre çözün.
   3. Steril koşullarda %5 CO₂ ve %95 nem ile 37 °C'de hücreleri büyütün.
   4. Hücreleri% 80 akıcılığa ulaştıklarında 37 ° C'de 5 dakika boyunca% 0.025 Tripsin / EDTA çözeltisi ile ayırın ve santrifüjleme yoluyla tripsini ortadan kaldırın.
      NOT: DT6606, LSL-KrasG12D-Pdx1-Cre fareden türetilen birincil hücrelerdir, ölümsüzleştirilmemiştir ve orijinal özelliklerini korumak için enjeksiyondan önce 3 defadan fazla geçirilmemelidir. DT6606 hücrelerinin enjeksiyondan 7-10 gün önce çözülmesi önerilir.
2. Tümör hücrelerinin in vivo enjeksiyonu
   1. Hücreleri tripsinize edin (bkz. adım 3.1.4) ve bunları bir kez Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ile yıkayın. Santrifüjleme yoluyla PBS'yi ortadan kaldırın ve saymadan önce taze PBS'deki hücreleri yeniden askıya alın.
   2. Hücreleri sayın ve her fareye enjekte edilecek 0.5-1 x 10⁶ hücre / 100 μL'lik bir son konsantrasyona sahip olmak için PBS'de 0.5-1 x 10⁷ hücre / mL konsantrasyonda yeniden askıya alın. Hücreleri fazla hazırlayın. İşlemin sonuna kadar hücreleri 4 ° C'de veya buz üzerinde tutun.
   3. Hayvanları (8 haftalık dişi C57BL/6J fareler) farklı hücre hatlarına veya tedavilere göre farklı kafeslerde gruplandırın.
   4. Hayvanları manuel olarak kısıtlayın ve Ketamin (80 mg / kg) ve Ksilazin (10 mg / kg) karışımı kullanarak veya yerel olarak onaylanmış prosedürlere göre anestezi yapın.
   5. Enjeksiyon bölgesini, genellikle bir bacağın üzerindeki bir kanadı, elektrikli tıraş makinesiyle tıraş edin ve enjeksiyon bölgesini alkolle dikkatlice temizleyin.
   6. 1 mL'lik bir şırınga ile hücre süspansiyonunu yukarı ve aşağı pipetle temizleyin, pistonu yukarı ve aşağı hareket ettirerek hava kabarcıklarını giderin. Şırıngaya 25 G'lik bir iğne takın ve hücre süspansiyonu iğne açıklığına ulaşana kadar pistonu yukarı doğru itin.
   7. Kanadın derisini düz uçlu forseps ile sıkıştırın ve iğneyi, periton boşluğunu veya kas sistemini delmeden forseps arasındaki cilt kıvrımının tabanına dikkatlice yerleştirin. İğnenin doğru pozisyonunu doğrulamak için, iğnenin ucunu cildin altında yavaşça yana doğru hareket ettirmeye çalışın. İğne serbestçe hareket etmelidir.
   8. Yavaşça 100 μL hücre süspansiyonu enjekte edin (0.5-1 x 10⁶ hücre içerir), enjeksiyon bölgesini birkaç saniye hafifçe sıkıştırın ve iğneyi herhangi bir yana doğru hareket etmeden yavaşça geri çekin.
   9. Fareyi kafesine geri döndürün ve anesteziden iyileşmeyi izleyin.
   10. 3-4 hafta boyunca bir kumpas kullanarak tümör büyümesini kontrol edin. Tümörler CO₂ kullanılarak veya lokal olarak onaylanmış prosedürlere göre yaklaşık 0.5-1^cm3'e ulaştığında hayvanları ötenazileştirin.

4. Tümör interstisyel sıvısının (TIF) izolasyonu

1. Subkutan tümörlerin eksizyonu
   1. Hayvanların uzuvlarını kağıt bantla bloke edin ve cildi alkolle temizleyin. Peritondan ayırmak ve uzuvlara kadar devam etmek için cildi karın üzerinde açın. Kanadın derisi altında yetişen tümörü makas, kelepçe ve sonunda bir neşter yardımıyla tüketin.
   2. Tümörü tartın ve TIF'nin izolasyonunu takip edene kadar buz üzerinde temiz bir tüpte tutun.
2. Santrifüjleme ile TIF'nin izolasyonu
   1. Tümörü ikiye bölün, iki parçayı PBS'de hızlı bir şekilde durulayın ve PBS fazlalığını gidermek için filtre kağıdına hafifçe lekeleyin. Tümörden buharlaşmayı önlemek için bu adımları mümkün olduğunca hızlı uygulayın.
   2. Tümörü derhal 50 mL'lik bir konik tüpün üzerine yapıştırılmış 20 μm naylon hücre süzgecine aktarın.
   3. Tüpü 4 ° C'de 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj yapın.
      NOT: Bu düşük hızlı santrifüjleme, hücre bütünlüğünü korur ve TIF'nin hücre içi bölme tarafından kontaminasyonunu önler. Hücre içi içerik sızıntısı, örneğin ribozomal proteinler²⁵ gibi hücre içi temizlik proteinlerinin varlığını değerlendirerek aşağı akış uygulamalarında test edilebilir.
   4. TIF'yi tüpün dibinden geri kazanın, sonunda aliquot edin ve hemen kuru buz üzerinde dondurun ve daha fazla analize kadar -80 ° C'de saklayın.
      İsteğe bağlı: Yapılacak aşağı akış proteomik analizine dayanarak, spesifik moleküllerin bozulmasını önlemek için numuneyi PBS'de bir proteaz inhibitörü kokteyli ile seyreltin.
      NOT: Tümörün bileşimine bağlı olarak, bazı durumlarda çok küçük tümörler herhangi bir sıvı vermez.
3. TIF'nin elüsyon ile izolasyonu
   1. Tümörü makas veya neşterle küçük parçalara (≈^{1-3 mm3}) kesin ve soğuk PBS ile dikkatlice durulayın.
      NOT: Bu adımda, hücre hasarını önlemek için hızlı çalışmak ve minimum manipülasyon yapmak çok önemlidir.
   2. Tümör parçalarını 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın ve analitlerin bozulmasını önlemek için bir proteaz inhibitörü kokteyli ile 500 μL PBS ekleyin. 37 °C'de 1 saat inkübe edin ve% 5 CO₂.
   3. Süpernatantı geri kazanın ve yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın. Numuneden herhangi bir hücreyi çıkarmak için 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj yapın.
   4. Süpernatantı yeni bir tüpe aktarın ve 4 ° C'de 8 dakika boyunca 2.000 x g'de tekrar santrifüj yapın.
   5. Süpernatantı yeni bir tüpe aktarın ve herhangi bir döküntüyü gidermek için 4 ° C'de 30 dakika boyunca 20.000 x g'de tekrar santrifüj yapın. Süper natantı kurtarın. TIF numunesini derhal aliquot ve kuru buz üzerinde dondurun ve daha fazla analize kadar -80 ° C'de saklayın.

Sonuçlar

Yukarıda tarif edilen prosedürü takip ederek PDAC (n=31) ve pankreatit (n=2), papiller-ampulla tümörleri (n=4), nöroendokrin tümörler (n=2), intraduktal papiller müsinöz neoplazi (IPMN; n=1)¹² dahil olmak üzere diğer benign pankreas rahatsızlıkları (PDAC olmayan, n=9) olan hastalardan pankreas suyu elde etmek için izlendi. Pankreas suyu örnekleri daha sonra nükleer manyetik rezonans (¹H-NMR) kullanılarak metabolomik analize tabi ^tutuldu1...

Tartışmalar

Bu çalışmada, büyük ölçüde keşfedilmemiş bir sıvı biyopsisi olan pankreas suyunu intraoperatif olarak toplama tekniğini tanımladık. Son zamanlarda pankreas suyunun hastalığın metabolik belirteçlerinin bir kaynağı olarak kullanılabileceğini gösterdik¹². Kan ^5,6,7, idrar⁸ ve tükürük⁹ gibi diğer sıvı biyopsiler üzerinde yapılan metabolomik analizler, P...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	BD Biosciences	309659
1.5 mL Eppendorf tube	Greiner BioOne	GR616201
20 µm nylon cell strainer	pluriSelect	43-50020-03
25G needle	BD Biosciences	305122
3 mL K2EDTA vacutainer	BD Biosciences	366473
3 mL syringe	BD Biosciences	309656
50 mL Falcon tube	Corning	352098
Clamps	Medicon	06.20.12
Disposable scalpel	Medicom	9000-10
Fetal bovine serum	Microtech	MG10432
Flat-tipped forceps	Medicon	06.00.10
Penicillin-Streptomycin	Lonza	ECB3001D
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Protease inhibitor cocktail	Roche	34044100
RPMI medium	Euroclone	ECB9006L
Scissors	Medicon	02.04.09
Trypsin/EDTA 1x	Lonza	BE17-161F
Ultraglutamine 100x	Lonza	BE17-605E/U1