膵臓腺癌の腫瘍微小環境を調べるための近位液の分離

要約

膵液は、ヒト膵臓がんのバイオマーカーの貴重な供給源です。ここでは、術中収集手順の方法について説明します。マウスモデルでこの手順を採用するという課題を克服するために、代替サンプルである腫瘍間質液を提案し、ここではその分離のための2つのプロトコルについて説明します。

要約

膵臓腺癌(PDAC)は、癌関連の死因の4番目に多い原因であり、まもなく2番目になります。術前の鑑別診断と患者のプロファイリングを支援するために、特定の膵臓の病状に関連する変数が緊急に必要です。膵液は比較的未踏の体液であり、腫瘍部位に近接しているため、周囲の組織の変化を反映しています。ここでは、術中の収集手順について詳しく説明します。残念ながら、膵液採取をPDACのマウスモデルに変換して機構研究を行うことは、技術的に非常に困難です。腫瘍間質液(TIF)は、腫瘍細胞と間質細胞を浸す血液と血漿の外側の細胞外液です。膵液と同様に、血漿中で希釈された分子を収集して濃縮する特性のために、TIFは微小環境変化の指標として、また疾患関連バイオマーカーの貴重な供給源として利用することができる。TIFは容易にアクセスできないため、TIFを分離するための様々な技術が提案されている。ここでは、その単離のための2つの簡単で技術的に要求の厳しい方法、すなわち組織遠心分離と組織溶出について説明します。

概要

膵管腺癌(PDAC)は最も攻撃的な腫瘍の1つであり、まもなく2番目に多い死因になります^1,2,3。免疫抑制性の微小環境と免疫^{療法プロトコル4}に対する無反応でよく知られています。現在、外科的切除は依然としてPDACの唯一の治癒選択肢ですが、早期再発や術後合併症の頻度は高くなっています。進行期までの特定の症状の欠如は早期診断を可能にしず、疾患の期限に寄与する。さらに、PDACと他の良性膵臓病理との間の症状の重複は、現在の診断戦略による迅速で信頼性の高い診断の達成を妨げる可能性がある。特定の膵臓の病状に関連する変数を特定することで、外科的意思決定プロセスを促進し、患者のプロファイリングを改善する可能性があります。

バイオマーカーの発見における有望な結果は、血液^5,6,7、尿^8、唾液9、膵液^10,11,12などの容易に入手しやすい体液を使用して達成されています。多くの研究では、ゲノム、プロテオミクス、メタボローム技術などの包括的な「オミクス」アプローチを利用して、PDACと他の良性膵臓疾患を区別できる候補分子またはシグネチャを特定しています。私たちは最近、比較的未踏の体液である膵液を使用して、異なる臨床プロファイルを持つ患者の代謝シグネチャを特定できることを示しました¹²。膵液はタンパク質が豊富な液体で、膵管細胞の分泌物を蓄積し、主膵管に流れ、次に主総胆管に流れます。膵臓に近接しているため、腫瘍塊によって引き起こされる微小環境の摂動の影響を強く受ける可能性があるため(図1)、血液や尿、または組織ベースのプロファイリングよりも有益です。いくつかの研究は、細胞学的分析13、質量分析によるプロテオミクス分析14,15、K-rasおよびp53変異^16,17、DNAメチル化の変化¹⁸、および^miRNA19を含むさまざまなアプローチを使用して、疾患の新しいバイオマーカーを特定するための膵液の可能性を調査してきました。.技術的には、膵液は、術中または内視鏡的超音波、逆行性胆管 - 膵造影などの低侵襲処置で、または十二指腸液分泌物の内視鏡的収集によって収集することができる²⁰。膵液組成物が、使用される収集技術によってどの程度影響を受けるかはまだ明らかではない。ここでは、術中の収集手順について説明し、膵液がPDACバイオマーカーの貴重な供給源になり得ることを示します。

図1:膵液採取の模式図。 (A)手術中の膵管への膵液の分泌とその採取を示す模式図。挿入図は腫瘍微小環境のクローズアップを示しています:膵液は膵管内の腫瘍および間質細胞によって放出される分子を収集します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

PDACの遺伝的および同所性マウスモデルにおける膵液の収集は、前臨床機構研究でこの生体液を利用するという観点から高く評価されます。ただし、この手順は技術的に非常に困難な場合があり、皮下腫瘍などの単純なモデルでは実行できません。このため、腫瘍間質液(TIF)は、周囲の摂動の指標として機能するという同様の特性から、膵液の代替源として同定されました。間質液(IF)は、細胞外液であり、血管およびリンパ管の外側に見られ、組織細胞²¹を浸すものである。IF組成は、臓器への血液循環と局所分泌の両方の影響を受けます。実際、周囲の細胞は^IF21でタンパク質を活発に産生および分泌します。間質は周囲の組織の微小環境の変化を反映しているため、腫瘍などのいくつかの病理学的状況におけるバイオマーカー発見の貴重な情報源となる可能性があります。TIF中の高濃度の局所分泌タンパク質は、血漿中の予後または診断バイオマーカーとして試験される候補分子を同定するために使用することができる^22、23、24。いくつかの研究は、TIFが質量分析技術^23、24、25、マルチプレックスELISAアプローチ^26、およびマイクロRNAプロファイリング²⁷などのハイスループットプロテオミクスアプローチに適したサンプルであることを証明しています。

腫瘍におけるIFの単離のためにいくつかのアプローチが提案されており、これはin vivo(毛細血管限外濾過28、29、^30、31および微小透析^32、33、34、35)およびex vivo法(組織遠心分離²²、36^、37、38および組織溶出39,40,41,42)。これらの技術は、広範囲に詳細に検討されている^43,44。適切な方法の選択では、下流の分析とアプリケーション、回収量などの問題を考慮する必要があります。私たちは最近、このアプローチを原理の証明として使用して、2つのマウス膵臓腺癌細胞株からの腫瘍の異なる代謝活性を実証しました¹²。文献^24,38に基づいて、細胞内含有量からの細胞の破壊と希釈を避けるために、低速遠心分離法を使用することを選択しました。TIF中のグルコースと乳酸の両方の量は、2つの異なる細胞株の異なる解糖特性を反映していました。ここでは、TIFの単離に最も一般的に使用される2つの方法である組織遠心分離と組織溶出のプロトコルについて詳しく説明します(図2)。

図2:腫瘍間質液分離法の概略図。 プロトコル、すなわち組織遠心分離(A)および組織溶出(B)に詳細に記載された技術の概略図。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

プロトコル

登録されたすべての患者について、末梢血と膵液は、施設の倫理委員会によって承認されたプロトコルに従って手術時に収集されました。すべての患者は、生物学的標本と臨床データの収集を含むインフォームドコンセントに署名した後、研究に登録されました。この研究は、機関の倫理委員会によって承認されました(プロトコル番号ICH-595、2009年5月に発行された承認)。マウスとそのケアを含む手順は、EUおよび機関ガイドライン(プロトコルID 121/2016-PR)に準拠していました。

1.膵液の分離

注:膵液の回収は、膵切除の開腹手術(例:.、膵頭十二指腸切除術、全膵切除術、遠位膵切除術)専門の膵臓外科医の装備によって実行されます。

1. 患者の選択
   1. 手術のために、開腹膵臓切除が予定されている患者を検討してください。
   2. 主膵管サイズが膵液回収を可能にするのに十分であると考えられる場合は、包含を確認します。主膵管の直径の最小限界は、造影CT画像では2mmと見なされます。
2. 造影CT撮影時の膵管の術前研究による膵液回収計画
   1. 膵頸部のレベルで腺内の主膵管を三次元的に局在化:断面スライド上の前膵臓、上および下膵臓縁からの主膵管の距離、および冠状および矢状レンダリングを測定する。手術室に入ったら、これらの測定値を使用して、ウィルスン管をカニューレ挿入し、膵液を採取するために膵臓を穿刺する正しい場所を概算します。
3. 材料の準備
   1. 滅菌材料:25G針1本と3mLシリンジ1本の滅菌封筒を開き、スクラブ看護師の協力を得て滅菌フィールドに配置します。
   2. 無菌材料:3 mL K2EDTA真空試験管を手術室に用意して、液体を保管してください。
4. 患者の準備
   1. 患者を手術室のベッドに置きます。レミフェンタニル、セボラン、ロクロニウムを使用して混合全身麻酔を誘発し、挿管して患者の換気を開始します。右腕を体に押し込み、左腕をアームボードに固定して90度に外転した状態で、患者を仰臥位の褥瘡に配置します。
   2. 切開部位の腹部の皮膚を消毒します。患者をドレープする腹部に無菌場を作成して維持します。
5. 手術
   1. 肋骨下切開を行い、腹腔へのアクセスを得る。臓器露出のためにロシャード腹部収縮を配置します。
   2. Kocher操作、胃結腸靭帯の開口部、膵臓の上および下境界に沿った後腹膜組織の切開によって膵臓を露出させ、動員し、膵頸部と後方に位置する上腸間膜静脈との間に解剖面を作成する。
   3. 膵臓が動員されて露出したら、膵頸部の切片化の前に膵液離脱に進みます。
6. 膵管の同定と局在化
   1. イメージングで得られた測定値を使用して膵管の位置を推定し、次に膵臓の前面を触診してその正確な位置を特定します。
7. 膵液のコレクション
   1. 膵頭と十二指腸を下から持ち、左手で持ち上げて、膵管の位置を最初の桁でマークします。
   2. 25 Gの針を取り付けた状態で、3 mLシリンジの右手でつかみます。
   3. 右手を使用して、左親指のすぐ遠位にある膵臓に針を挿入します。術前の測定値と管壁を貫通したという認識に基づいて、針の浸透深さと傾斜度を決定します。
   4. 注射器でジュースを引き出します。ジュースを取り出すことができない場合は、膵管をカニューレ挿入しようとして針を4方向に再配置します。
   5. 膵液が回収されたら、それを滅菌場の外に移動し、3mLのK2EDTA真空試験管に移します。サンプルがラボに移されるまで4°Cに保ち、できるだけ早くさらなる処理に進みます。
      注:この手順で回収できる膵液の量は大きく異なり、私たちの経験では約0.2mLから3mLの範囲です。回収されるジュースの量は、患者に大きく依存します:Wirsung管の寸法と膵臓の機能状態(機能対萎縮腺)。私たちの経験では、回収される膵液の量を増やすために使用できる手段はありません。

2.膵液の加工

1. 膵液を400 x g で4°Cで10分間遠心分離し、細胞や破片を取り除きます。
   注:膵液は、遠心分離前に色が透明で透明である必要があります。手術中の血液汚染が発生することがあり、サンプルの色が濁り、赤く見えます。このようなサンプルを今後の分析から除外することを検討してください。
2. 上清を回収し、アリコートして、さらに分析するまで-80°Cで保存します。

3.皮下腫瘍の誘導

注:マウスのPanc02およびDT6606細胞株は、前述のように、それぞれロレンツォ・ピエモンティ教授(サンラファエレ糖尿病研究所、イタリア、ミラノ)およびフランチェスコ・ノヴェッリ教授(実験研究医学研究センター、トリノ、イタリア)から入手した¹²。

1. 腫瘍細胞の増殖
   1. 10%ウシ胎児血清(FBS)、2mM L-グルタミンおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシン抗生物質を含むロズウェルパーク記念研究所(RPMI)1640培地でPanc02およびDT6606細胞を培養します。
   2. 凍結細胞は腫瘍注入の1〜2週間前に、細胞株の増殖速度に応じて解凍する。
   3. 無菌状態で5%の_CO2 と95%の湿度で37°Cで細胞を増殖させます。
   4. 細胞が80%コンフルエントに達したら、0.025%トリプシン/EDTA溶液で37°Cで5分間細胞を分離し、遠心分離によってトリプシンを除去します。
      注:DT6606は、LSL-KrasG12D-Pdx1-Creマウスに由来する、不死化されていない初代細胞であり、元の特性を維持するために、 in vivo で注射する前に3回以上継代しないでください。注射の7〜10日前にDT6606細胞を解凍することをお勧めします。
2. 腫瘍細胞のインビボ注射
   1. 細胞をトリプシン処理し(ステップ3.1.4を参照)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で一度洗浄します。遠心分離によってPBSを除去し、カウントする前に細胞を新鮮なPBSに再懸濁します。
   2. 細胞をカウントし、0.5-1 x 10⁷ 細胞/ mLの濃度でPBSに再懸濁して、最終濃度0.5-1 x^{10 6} 細胞/ 100 μLにして各マウスに注入します。過剰に細胞を準備します。手順が終了するまで、細胞を4°Cまたは氷上に保ちます。
   3. 動物(8週齢の雌C57BL / 6Jマウス)を、さまざまな細胞株または治療法に従って、さまざまなケージにグループ化します。
   4. 動物を手動で拘束し、ケタミン(80 mg / kg)とキシラジン(10 mg / kg)の混合物を使用して、または地元で承認された手順に従って麻酔をかけます。.
   5. 注射部位(通常は脚の上の側面)を電気かみそりで剃り、注射部位をアルコールで慎重に清掃します。
   6. 1 mLシリンジで細胞懸濁液を上下にピペットで動かし、ピストンを上下に動かして気泡を取り除きます。25 Gの針をシリンジに取り付け、細胞懸濁液が針の開口部に達するまでピストンを上に押します。
   7. 平らな先端の鉗子で脇腹の皮膚をつまみ、腹腔や筋肉組織を穿刺することなく、鉗子の間の皮膚のひだの付け根に針を慎重に挿入します。針の正しい位置を確認するには、針の先端を皮膚の下で横にそっと動かしてみてください。針は自由に動くはずです。
   8. 100 μLの細胞懸濁液(0.5-1 x 10⁶ 細胞を含む)をゆっくりと注入し、注射部位を数秒間穏やかにクランプし、横方向に動かさずに針をゆっくりと引き出します。
   9. マウスをケージに戻し、麻酔からの回復を監視します。
   10. キャリパーを使用して腫瘍の成長を3〜4週間確認します。腫瘍がCO₂を使用して、または地元で承認された手順に従って約0.5〜1cm³に達したときに動物を安楽死させる。

4.腫瘍間質液(TIF)の分離

1. 皮下腫瘍の切除
   1. 紙テープで動物の手足を塞ぎ、アルコールで皮膚をきれいにします。腹膜からそれを分離し、手足まで進むために腹部の皮膚を切り開きます。はさみ、クランプ、そして最終的にはメスの助けを借りて、脇腹の皮膚の下で成長した腫瘍を切除します。
   2. 腫瘍の重量を量り、TIFの分離が続くまで氷上のきれいなチューブに保管します。
2. 遠心分離によるTIFの単離
   1. 腫瘍を半分に切り、2つの部分をPBSですばやくすすぎ、ろ紙でやさしく吸い取って余分なPBSを取り除きます。腫瘍からの蒸発を避けるために、これらの手順をできるだけ早く実行してください。
   2. 腫瘍を直ちに、50 mLのコニカルチューブの上に固定された20 μmのナイロンセルストレーナーに移します。
   3. チューブを400 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
      注:この低速遠心分離は、細胞内コンパートメントによるTIFの汚染を回避して細胞の完全性を維持します。細胞内コンテンツ漏出は、例えばリボソームタンパク質²⁵などの細胞内ハウスキーピングタンパク質の存在を評価することによって、下流用途で試験することができる。
   4. チューブの底からTIFを回収し、最終的に分注し、すぐにドライアイスで凍結し、さらに分析するまで-80°Cで保管します。
      オプション:実行するダウンストリームプロテオミクス分析に基づいて、特定の分子の分解を避けるために、プロテアーゼ阻害剤カクテルでサンプルをPBSで希釈します。
      注:腫瘍の組成によっては、非常に小さな腫瘍が体液を生成しない場合があります。
3. 溶出によるTIFの単離
   1. 腫瘍をハサミまたはメスで小片(≈1〜3 mm³)に切り、冷たいPBSで慎重にすすいでください。
      注:このステップでは、細胞の損傷を避けるために、迅速に作業し、最小限の操作を実行することが非常に重要です。
   2. 腫瘍片を1.5 mLチューブに移し、分析種の分解を避けるためにプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む500 μLのPBSを追加します。37°C、5%_CO2で1時間インキュベートします。
   3. 上清を回収し、新しい1.5 mLチューブに移します。1,000 x g で4°Cで5分間遠心分離し、サンプルから細胞を除去します。
   4. 上清を新しいチューブに移し、2,000 x g で4°Cで8分間遠心分離します。
   5. 上清を新しいチューブに移し、20,000 x g で4°Cで30分間遠心分離して、破片を取り除きます。上清を回収する。TIFサンプルを直ちに分注してドライアイスに凍結し、さらに分析するまで-80°Cで保存します。

結果

上記の手順に従って、PDAC(n=31)および膵炎(n=2)、乳頭状膨大腫瘍(n=4)、神経内分泌腫瘍(n=2)、膵管内乳頭粘液性腫瘍(IPMN;n=1)¹²を含む他の良性膵臓疾患(非PDAC、n=9)の患者から膵液を採取した。次に、膵液サンプルを核磁気共鳴(1H-NMR)¹²を用いたメタボローム分析に供しました。高分子(リポタンパク質、脂質など)の幅広いNMRシグナルをフィルタリ...

ディスカッション

本研究では,術中に膵液を採取する技術について述べ,未踏の体液生検である.私たちは最近、膵液が疾患¹²の代謝マーカーの供給源として利用できることを示しました。血液⁵、^6、7、尿^8、唾液⁹などの他のリキッドバイオプシーのメタボローム分析は、PDACと健康な被験者?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	BD Biosciences	309659
1.5 mL Eppendorf tube	Greiner BioOne	GR616201
20 µm nylon cell strainer	pluriSelect	43-50020-03
25G needle	BD Biosciences	305122
3 mL K2EDTA vacutainer	BD Biosciences	366473
3 mL syringe	BD Biosciences	309656
50 mL Falcon tube	Corning	352098
Clamps	Medicon	06.20.12
Disposable scalpel	Medicom	9000-10
Fetal bovine serum	Microtech	MG10432
Flat-tipped forceps	Medicon	06.00.10
Penicillin-Streptomycin	Lonza	ECB3001D
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Protease inhibitor cocktail	Roche	34044100
RPMI medium	Euroclone	ECB9006L
Scissors	Medicon	02.04.09
Trypsin/EDTA 1x	Lonza	BE17-161F
Ultraglutamine 100x	Lonza	BE17-605E/U1