Isolamento de Fluidos Proximais para Investigar o Microambiente Tumoral do Adenocarcinoma Pancreático

Resumo

O suco pancreático é uma fonte preciosa de biomarcadores para o câncer de pâncreas humano. Descrevemos aqui um método para o procedimento de coleta intraoperatória. Para superar o desafio de adotar esse procedimento em modelos murinos, sugerimos uma amostra alternativa, o líquido intersticial tumoral, e descrevemos aqui dois protocolos para seu isolamento.

Resumo

O adenocarcinoma pancreático (PDAC) é a quarta principal causa de morte relacionada ao câncer e logo se tornará a segunda. Há uma necessidade urgente de variáveis associadas a patologias pancreáticas específicas para auxiliar o diagnóstico diferencial pré-operatório e o perfil do paciente. O suco pancreático é um fluido corporal relativamente inexplorado, que, devido à sua proximidade com o local do tumor, reflete mudanças no tecido circundante. Aqui descrevemos detalhadamente o procedimento de coleta intraoperatória. Infelizmente, traduzir a coleta de suco pancreático para modelos murinos de PDAC, para realizar estudos mecanicistas, é tecnicamente muito desafiador. O líquido intersticial tumoral (TIF) é o fluido extracelular, fora do sangue e do plasma, que banha as células tumorais e estromais. Da mesma forma que o suco pancreático, por sua propriedade de coletar e concentrar moléculas que são encontradas diluídas no plasma, o TIF pode ser explorado como um indicador de alterações microambientais e como uma valiosa fonte de biomarcadores associados à doença. Como o TIF não é facilmente acessível, várias técnicas têm sido propostas para o seu isolamento. Descrevemos aqui dois métodos simples e tecnicamente pouco exigentes para o seu isolamento: centrifugação tecidual e eluição tecidual.

Introdução

O adenocarcinoma ductal pancreático (ACPD) é um dos tumores mais agressivos, e logo se tornará a segunda principal causa de morte ^1,2,3. É conhecida por seu microambiente imunossupressor e por sua falta de resposta aos protocolos de imunoterapia⁴. Atualmente, a ressecção cirúrgica ainda é a única opção curativa para a ACPD, mas há uma alta frequência de recidivas precoces e complicações pós-cirúrgicas. A falta de sintomas específicos até um estágio avançado não permite um diagnóstico precoce, contribuindo para os prazos da doença. Além disso, a sobreposição de sintomas entre o PDAC e outras patologias pancreáticas benignas pode dificultar a obtenção de um diagnóstico rápido e confiável com as estratégias diagnósticas atuais. A identificação de variáveis associadas a patologias pancreáticas específicas poderia facilitar o processo de tomada de decisão cirúrgica e melhorar o perfil do paciente.

Resultados promissores na descoberta de biomarcadores têm sido alcançados utilizando fluidos corporais de fácil acesso, como sangue ^5,6,7, urina⁸, saliva 9 e suco pancreático^10,11,12. Muitos estudos exploraram abordagens "ômicas" abrangentes, como técnicas genômicas, proteômicas e metabolômicas, para identificar moléculas ou assinaturas candidatas que poderiam discriminar entre PDAC e outras aflições pancreáticas benignas. Recentemente, demonstramos que o suco pancreático, um fluido corporal relativamente inexplorado, pode ser utilizado para identificar assinaturas metabólicas de pacientes com perfis clínicos distintos¹². O suco pancreático é um fluido rico em proteínas, que acumula o secretoma das células ductais pancreáticas e flui para o ducto pancreático principal e, em seguida, para o ducto biliar comum principal. Devido à sua proximidade com o pâncreas, pode ser fortemente afetada por perturbações microambientais induzidas pela massa tumoral (Figura 1) e, portanto, mais informativa do que o sangue ou a urina, ou o perfil baseado em tecidos. Vários estudos têm explorado o potencial do suco pancreático para identificar novos biomarcadores de doença usando várias abordagens, incluindo análise citológica 13, análise proteômica realizada por espectrometria de massa^14,15, avaliação de marcadores genéticos e epigenéticos como mutações K-ras e p53 ^16,17, alterações na metilação do DNA 18 e miRNAs ¹⁹ . Tecnicamente, o suco pancreático pode ser coletado no intraoperatório ou com procedimentos minimamente invasivos, como ultrassonografia endoscópica, colangiopancreatografia retrógrada ou por coleta endoscópica de secreção de suco duodenal²⁰. Ainda não está claro até que ponto a composição do suco pancreático é afetada pela técnica de coleta utilizada. Descrevemos aqui o procedimento de coleta intraoperatória e mostramos que o suco pancreático pode representar uma fonte preciosa de biomarcadores PDAC.

Figura 1: Representação esquemática da coleção de suco pancreático. (A) Representação esquemática que descreve a secreção de suco pancreático no ducto pancreático e sua coleta durante a cirurgia. A inserção mostra um close-up do microambiente tumoral: o suco pancreático coleta moléculas liberadas por células tumorais e estromais nos ductos pancreáticos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A coleta de suco pancreático em modelos genéticos e ortotópicos de camundongos de PDAC seria apreciada na perspectiva de explorar esse biofluido em estudos mecanicistas pré-clínicos; no entanto, esse procedimento pode ser tecnicamente muito desafiador e inviável para modelos mais simples, como tumores subcutâneos. Por esse motivo, identificamos o líquido intersticial tumoral (TIF) como uma fonte alternativa ao suco pancreático, por sua característica semelhante de atuar como um indicador de perturbações circundantes. O líquido intersticial (FI) é o líquido extracelular, encontrado fora dos vasos sanguíneos e linfáticos, que banha as células teciduais²¹. A composição do FI é afetada tanto pela circulação sanguínea para o órgão quanto pela secreção local; de fato, as células circundantes produzem e secretam ativamente proteínas no FI²¹. O interstício reflete as alterações microambientais dos tecidos circundantes e, portanto, pode representar uma fonte valiosa para a descoberta de biomarcadores em vários contextos patológicos, como tumores. A alta concentração de proteínas secretadas localmente no TIF pode ser utilizada para identificar moléculas candidatas a serem testadas como biomarcadores prognósticos ou diagnósticos no plasma^22,23,24. Vários estudos comprovaram que o TIF é uma amostra adequada para abordagens proteômicas de alto rendimento, como técnicas de espectrometria de massa 23,24,25^, bem como abordagens ELISA multiplex 26 e perfil de microRNA ²⁷.

Diversas abordagens têm sido propostas para o isolamento do FI em tumores, que podem ser amplamente categorizados como in vivo (ultrafiltração capilar 28,29,30,31 e microdiálise 32,33,34,35) e métodos ex vivo (centrifugação tecidual ^22,36,37,38 e eluição tecidual 39,40,41,42). Essas técnicas têm sido revisadas em detalhes^{extensivos 43,44}. A escolha do método adequado deverá ter em conta questões como as análises e aplicações a jusante e o volume recuperado. Recentemente, utilizamos essa abordagem como prova de princípio para demonstrar a diferente atividade metabólica de tumores de duas linhagens celulares de adenocarcinoma pancreático murino¹². Com base na literatura^24,38, optou-se por utilizar o método de centrifugação de baixa velocidade para evitar a quebra celular e a diluição do conteúdo intracelular. Tanto a quantidade de glicose quanto o lactato no TIF refletiram as diferentes características glicolíticas das duas linhagens celulares diferentes. Aqui descrevemos detalhadamente o protocolo para os dois métodos mais utilizados para o isolamento de TIF: centrifugação tecidual e eluição tecidual (Figura 2).

Figura 2: Representação esquemática dos métodos de isolamento do líquido intersticial tumoral. Ilustração esquemática das técnicas descritas detalhadamente no protocolo, nomeadamente centrifugação tecidual (A) e eluição tecidual (B). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

Para todos os pacientes inscritos, o sangue periférico e o suco pancreático foram coletados no momento da cirurgia, de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Ética da Instituição. Todos os pacientes foram incluídos no estudo após assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido, incluindo coleta de espécimes biológicos e dados clínicos. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Instituição (protocolo número ICH-595, aprovação emitida em maio de 2009). Os procedimentos envolvendo camundongos e seus cuidados foram conformes às Diretrizes da UE e Institucionais (protocolo ID 121/2016-PR).

1. Isolamento do suco pancreático

NOTA: A retirada do suco pancreático é executada no contexto de um procedimento aberto de ressecção pancreática (por exemplo, pancreaticoduodenectomia, pancreatectomia total, pancreatectomia distal) por uma equipe de cirurgiões pancreáticos especializados.

1. Seleção de pacientes
   1. Considere para o procedimento qualquer paciente agendado para uma ressecção pancreática aberta.
   2. Confirme a inclusão se o tamanho do ducto pancreático principal for considerado suficiente para permitir a recuperação do suco pancreático. O limite mínimo de diâmetro do ducto pancreático principal é considerado de 2 mm na TC com contraste.
2. Estudo pré-operatório do ducto pancreático na tomografia computadorizada (TC) com contraste para ajudar no planejamento da recuperação do suco pancreático
   1. Localizar tridimensionalmente o ducto pancreático principal dentro da glândula ao nível do colo pancreático: meça a distância do ducto pancreático principal da margem pancreática anterior, superior e inferior em lâminas transversais e renderizações coronais e sagitais. Uma vez na sala de cirurgia, use essas medidas para se aproximar do local correto onde perfurar o pâncreas para canular o ducto de Wirsung e recuperar o suco pancreático.
3. Preparação de material
   1. Material estéril: Abra o envelope estéril de uma agulha de 25 G e uma seringa de 3 mL e posicione-os no campo estéril com a cooperação da enfermeira de esfoliação.
   2. Material não estéril: Mantenha um tubo de ensaio a vácuo K2EDTA de 3 mL pronto na sala de cirurgia para o armazenamento do fluido.
4. Preparação do paciente
   1. Posicione o paciente na cama da sala de cirurgia. Induzir anestesia geral mista, usando Remifentanil, Sevorane e Rocurônio, em seguida, intubar e começar a ventilar o paciente. Posicione o paciente em decúbito dorsal com o braço direito dobrado ao corpo e o braço esquerdo abduzido a 90° graus preso em uma armboard.
   2. Desinfetar a pele do abdômen no local da incisão. Crie e mantenha um campo estéril no abdômen cobrindo o paciente.
5. Procedimento cirúrgico
   1. Realize uma incisão subcostal e obtenha acesso à cavidade abdominal. Posicione uma retração abdominal de Rochard para exposição de órgãos.
   2. Expor e mobilizar o pâncreas através da manobra de Kocher, abertura do ligamento gastrocólico, incisão do tecido retroperitoneal ao longo da borda superior e inferior do pâncreas criando um plano de dissecção entre o colo pancreático e a veia mesentérica superior localizada posteriormente.
   3. Uma vez que o pâncreas é mobilizado e exposto, prossiga para a retirada do suco pancreático antes da secção do pescoço pancreático.
6. Identificação e localização do ducto pancreático
   1. Estime a localização do ducto pancreático usando a medição feita na imagem e, em seguida, palpar a superfície anterior do pâncreas para identificar sua localização precisa.
7. Coleção de suco pancreático
   1. Segure a cabeça pancreática e o duodeno por baixo e eleve-o com a mão esquerda, marcando a localização do ducto pancreático com o primeiro dígito.
   2. Segure com a mão direita da seringa de 3 ml com a agulha de 25 G montada.
   3. Use a mão direita para inserir a agulha no pâncreas apenas distal ao polegar esquerdo. Decidir a profundidade de penetração e o grau de inclinação da agulha com base em medidas pré-operatórias e na percepção de ter penetrado na parede do duto.
   4. Retire o suco com a seringa. Se não for possível recuperar o suco, realoque a agulha nas quatro direções tentando canular o ducto pancreático.
   5. Uma vez que o suco pancreático é recuperado, mova-o para fora do campo estéril e transfira-o para o tubo de ensaio a vácuo K2EDTA de 3 mL. Manter a 4 °C até que a amostra seja transferida para o laboratório e proceder a um processamento adicional o mais cedo possível.
      NOTA: O volume de suco pancreático que pode ser recuperado com este procedimento varia muito, variando aproximadamente de 0,2 mL a 3 mL em nossa experiência. A quantidade de suco recuperada é altamente dependente do paciente: a dimensão do ducto de Wirsung e o estado funcional do pâncreas (funcionamento versus glândula atrófica). Em nossa experiência, não há nenhum expediente que possa ser usado para aumentar a quantidade de suco pancreático recuperado.

2. Processamento de suco pancreático

1. Centrifugar o sumo pancreático a 400 x g durante 10 minutos a 4 °C para remover quaisquer células ou detritos.
   NOTA: O suco pancreático deve ser de cor clara e transparente antes da centrifugação. A contaminação do sangue durante a cirurgia às vezes pode ocorrer, fazendo com que a amostra pareça mais escura e de cor mais vermelha. Considere excluir essas amostras de análises posteriores.
2. Recuperar o sobrenadante, alíquota e conservar a -80 °C até novas análises.

3. Indução de tumores subcutâneos

NOTA: As linhagens celulares murinas Panc02 e DT6606 foram obtidas do Prof. Lorenzo Piemonti (San Raffaele Diabetes Institute, Milão, Itália) e do Prof. Francesco Novelli (Center for Experimental Research and Medical Studies, Torino, Itália), respectivamente, conforme descrito anteriormente¹².

1. Crescimento de células tumorais
   1. Cultura de células Panc02 e DT6606 em meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 contendo 10% de soro fetal bovino (FBS), 2mM L-Glutamina e 1% de antibiótico penicilina-estreptomicina.
   2. Descongele as células congeladas 1-2 semanas antes da injeção do tumor, de acordo com a taxa de crescimento da linhagem celular.
   3. Cultivar células a 37 °C com 5% de CO₂ e 95% de umidade em condições estéreis.
   4. Descole as células com solução de tripsina/EDTA a 0,025% por 5 min a 37 °C quando atingirem 80% de confluência e eliminarem a tripsina por centrifugação.
      NOTA: DT6606 são células primárias, não imortalizadas, derivadas do rato LSL-KrasG12D-Pdx1-Cre, e não devem ser passadas mais de 3 vezes antes da injeção in vivo para manter as suas características originais. Recomenda-se descongelar as células DT6606 7-10 dias antes da injeção.
2. Injeção de células tumorais in vivo
   1. Tripsinize as células (ver passo 3.1.4) e lave-as uma vez com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Elimine o PBS por centrifugação e ressuspenda as células no PBS fresco antes de contar.
   2. Conte as células e ressuscite-as em PBS a uma concentração de 0,5-1 x 10⁷ células/mL para ter uma concentração final de 0,5-1 x 10⁶ células/100 μL para injetar em cada rato. Prepare as células em excesso. Manter as células a 4 °C ou sobre gelo até ao final do procedimento.
   3. Agrupar os animais (camundongos C57BL/6J fêmeas de 8 semanas de idade) em diferentes gaiolas de acordo com diferentes linhagens celulares ou tratamentos.
   4. Restrinja os animais manualmente e anestesia-os utilizando uma mistura de cetamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) ou de acordo com procedimentos aprovados localmente.
   5. Raspe o local da injeção, geralmente um flanco acima de uma perna, com um barbeador elétrico e limpe cuidadosamente o local da injeção com álcool.
   6. Pipetar para cima e para baixo a suspensão celular com uma seringa de 1 ml, removendo quaisquer bolhas de ar movendo o êmbolo para cima e para baixo. Ligue uma agulha de 25 G à seringa e empurre o êmbolo para cima até que a suspensão celular atinja a abertura da agulha.
   7. Aperte a pele do flanco com pinças de ponta plana e insira cuidadosamente a agulha na base da dobra cutânea entre a pinça sem perfurar a cavidade peritoneal ou a musculatura. Para verificar a posição correta da agulha, tente mover suavemente a ponta da agulha lateralmente sob a pele. A agulha deve mover-se livremente.
   8. Injete lentamente 100 μL de suspensão celular (contendo 0,5-1 x 10⁶ células), prenda suavemente o local da injeção por alguns segundos e retire lentamente a agulha sem qualquer movimento lateral.
   9. Devolva o rato de volta à sua gaiola e monitorize a recuperação da anestesia.
   10. Verifique o crescimento do tumor usando um paquímetro por 3-4 semanas. Eutanasiar os animais quando os tumores atingem aproximadamente 0,5-1 cm³ usando CO₂ ou de acordo com procedimentos aprovados localmente.

4. Isolamento do líquido intersticial tumoral (TIF)

1. Excisão de tumores subcutâneos
   1. Bloqueie os membros dos animais com fita adesiva de papel e limpe a pele com álcool. Corte a pele aberta no abdômen para separá-la do peritônio e vá até os membros. Excise o tumor crescido sob a pele do flanco com a ajuda de tesouras, grampos e, eventualmente, um bisturi.
   2. Pese o tumor e mantenha-o em um tubo limpo no gelo até seguir o isolamento do TIF.
2. Isolamento de TIF por centrifugação
   1. Corte o tumor ao meio, lave as duas partes rapidamente em PBS e apague-as suavemente em papel de filtro para remover o excesso de PBS. Realize essas etapas o mais rápido possível para evitar a evaporação do tumor.
   2. Transfira imediatamente o tumor para um filtro de células de nylon de 20 μm afixado sobre um tubo cônico de 50 mL.
   3. Centrifugar o tubo a 400 x g durante 10 min a 4 °C.
      NOTA: Esta centrifugação de baixa velocidade preserva a integridade celular evitando a contaminação do TIF pelo compartimento intracelular. O vazamento de conteúdo intracelular pode ser testado em aplicações a jusante, por exemplo, avaliando a presença de proteínas de limpeza intracelular, como proteínas ribossomais²⁵.
   4. Recuperar o TIF do fundo do tubo, eventualmente alíquotá-lo e congelá-lo imediatamente em gelo seco e armazenar a -80 °C até uma análise mais aprofundada.
      Opcional: Com base na análise proteômica a jusante a ser realizada, diluir a amostra em PBS com um coquetel inibidor de protease para evitar a degradação de moléculas específicas.
      NOTA: Dependendo da composição do tumor, em alguns casos tumores muito pequenos não produzem nenhum fluido.
3. Isolamento do TIF por eluição
   1. Corte o tumor em pedaços pequenos (≈1-3 mm³) com uma tesoura ou um bisturi e enxágue cuidadosamente com PBS frio.
      NOTA: Nesta etapa, é muito importante trabalhar rápido e executar o mínimo de manipulação para evitar danos celulares.
   2. Transfira os pedaços do tumor para um tubo de 1,5 mL e adicione 500 μL de PBS com um coquetel inibidor de protease para evitar a degradação dos analitos. Incubar durante 1 hora a 37 °C e 5% de CO₂.
   3. Recupere o sobrenadante e transfira-o para um novo tubo de 1,5 mL. Centrifugar a 1 000 x g durante 5 minutos a 4 °C para remover quaisquer células da amostra.
   4. Transferir o sobrenadante para um novo tubo e centrifugar novamente a 2.000 x g durante 8 min a 4 °C.
   5. Transferir o sobrenadante para um novo tubo e centrifugar novamente a 20.000 x g durante 30 minutos a 4 °C para remover quaisquer detritos. Recupere o sobrenadante. Aliquotar e congelar imediatamente a amostra de TIF em gelo seco e conservar a -80 °C até nova análise.

Resultados

Seguimos o procedimento descrito acima para obtenção de suco pancreático de pacientes com PCAC (n=31) e outras aflições pancreáticas benignas (não PDAC, n=9), incluindo pancreatite (n=2), tumores papilar-ampola (n=4), tumores neuroendócrinos (n=2), neoplasia mucinosa papilar intraductal (NMPI; n=1)¹². As amostras de suco pancreático foram então submetidas à análise metabolômica por ressonância magnética nuclear (¹H-NMR)¹². Ao filtrar o...

Discussão

Neste estudo, descrevemos a técnica de coleta intraoperatória de suco pancreático, uma biópsia de fluidos em grande parte inexplorada. Recentemente, mostramos que o suco pancreático pode ser explorado como fonte de marcadores metabólicos da doença¹². A análise metabolômica em outras biópsias líquidas, como sangue ^5,6,7, urina⁸ e saliva^9, mostrou r...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	BD Biosciences	309659
1.5 mL Eppendorf tube	Greiner BioOne	GR616201
20 µm nylon cell strainer	pluriSelect	43-50020-03
25G needle	BD Biosciences	305122
3 mL K2EDTA vacutainer	BD Biosciences	366473
3 mL syringe	BD Biosciences	309656
50 mL Falcon tube	Corning	352098
Clamps	Medicon	06.20.12
Disposable scalpel	Medicom	9000-10
Fetal bovine serum	Microtech	MG10432
Flat-tipped forceps	Medicon	06.00.10
Penicillin-Streptomycin	Lonza	ECB3001D
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Protease inhibitor cocktail	Roche	34044100
RPMI medium	Euroclone	ECB9006L
Scissors	Medicon	02.04.09
Trypsin/EDTA 1x	Lonza	BE17-161F
Ultraglutamine 100x	Lonza	BE17-605E/U1