JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هذه التقنية لغرس الأدوية مباشرة في القصبة الهوائية للقوارض حديثي الولادة مهمة في دراسة تأثير الأدوية أو البيولوجيا التي تدار محليا على أمراض الرئة حديثي الولادة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة للحث على إصابة الرئة في النماذج الحيوانية.

Abstract

يمكن أن يكون علاج القوارض حديثي الولادة بالعقاقير التي يتم غرسها مباشرة في القصبة الهوائية بمثابة أداة قيمة لدراسة تأثير الدواء الذي يتم إعطاؤه محليا. هذا له تأثير انتقالي مباشر لأن الفاعل بالسطح والأدوية تدار محليا في الرئتين. على الرغم من أن الأدبيات تحتوي على العديد من المنشورات التي تصف التنبيب عبر الفم بأقل قدر من التدخل الجراحي للفئران والجرذان البالغة في التجارب العلاجية ، إلا أن هذا النهج في الجراء الفئران حديثي الولادة غير موجود. إن صغر حجم منطقة القصبة الهوائية / البلعوم في الجراء يجعل تصور تجويف الحنجرة (الحبال الصوتية) صعبا ، مما يساهم في معدل النجاح المتغير لتوصيل الدواء داخل القصبة الهوائية. نظهر هنا التنبيب الفموي الفعال لجرو الفئران حديثي الولادة - وهي تقنية غير مؤلمة وطفيفة التوغل ، بحيث يمكن استخدامها للإدارة التسلسلية للأدوية. استخدمنا منظار الأذن التشغيلي مع نظام إضاءة وعدسة مكبرة لتصور فتحة القصبة الهوائية لحديثي الولادة من الفئران. ثم يتم غرس الدواء باستخدام حقنة 1 مل متصلة بطرف ماصة. تم إثبات دقة طريقة التسليم باستخدام إدارة الصبغة الزرقاء إيفانز. من السهل التدريب على هذه الطريقة ويمكن أن تكون بمثابة وسيلة فعالة لغرس المخدرات في القصبة الهوائية. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لإعطاء اللقاح أو العوامل لمحاكاة الظروف المرضية في الحيوانات ، وكذلك لاستراتيجيات العلاج القائمة على الخلايا لمختلف أمراض الرئة.

Introduction

حديثي الولادة المولودين قبل الأوان لديهم رئتان ضعيفتان النمو تتطلبان العديد من العلاجات التداخلية مثل التهوية طويلة الأجل. هذه التدخلات تضع المواليد الجدد الباقين على قيد الحياة في خطر كبير من العواقب اللاحقة1. تعمل النماذج الحيوانية التجريبية كأداة مهمة في محاكاة الظروف المرضية المختلفة ، ودراسة البيولوجيا المرضية للأمراض ، وتقييم التدخلات العلاجية. على الرغم من توفر مجموعة واسعة من النماذج الحيوانية من الفئران والجرذان والأرانب إلى الحملان والخنازير قبل الأوان ، إلا أن الفئران والجرذان هي الأكثر استخداما.

الميزة الأساسية لاستخدام الفئران والجرذان هي فترة الحمل القصيرة نسبيا والتكلفة المنخفضة. كما أنها متاحة بسهولة ، وسهلة الصيانة في بيئات خالية من الأمراض ، ومتجانسة وراثيا ولها اهتمام أخلاقي أقل نسبيا 2,3. ميزة رئيسية أخرى لنموذج القوارض هي أنه عند الولادة يكون الجرو الوليد في مرحلة متأخرة من تطور الرئة الكناليكية / العجزية المبكرة التي تعادل مورفولوجيا رئة طفل بشري حديث الولادة قبل الأوان لمدة 24 أسبوعا يستمر في تطوير خلل التنسج القصبي الرئوي4. بالإضافة إلى ذلك ، مع تقدم نمو الرئة بسرعة إلى الانتهاء خلال الأسابيع الأربعة الأولى من الحياة ، من الممكن دراسة نضج الرئة بعد الولادة في إطار زمني معقول4. على الرغم من هذه المزايا ، فإن صغر حجم الفئران والجراء الفئران هو مصدر قلق لمختلف التدخلات ، مما يجبر معظم الباحثين على استخدام الحيوانات البالغة بدلا من الجراء5. الرئتين حديثي الولادة في مرحلة النمو وتختلف استجابة الوليد لعامل تحريض عن استجابة الشخص البالغ. وهذا يجعل من المناسب استخدام النماذج الحيوانية لحديثي الولادة لدراسة حالات أمراض الأطفال حديثي الولادة البشرية.

هناك طرق مختلفة لإدارة الأدوية / العوامل البيولوجية إلى الرئة. وهذا يشمل تقطير داخل الأنف 6,7 أوداخل القصبة الهوائية 8,9,10 وكذلك استنشاق الهباء الجوي11,12. لكل نهج تحدياته التقنية الخاصة به ومزاياه ، بالإضافة إلى القيود13. يفضل الطريق داخل القصبة الهوائية لإدارة العوامل العلاجية لدراسة التأثير العلاجي المباشر في العضو متجاوزا الآثار الجهازية. يمكن أيضا استخدام هذا الطريق لدراسة أمراض الرئة الناجمة عن العوامل التحريضية. هناك تقنيات غازية وطفيفة التوغل للقيام بذلك ومن السهل القيام بها لدى البالغين. ومع ذلك ، في الجراء ، بسبب صغر حجم الحيوان ، هناك تحديات تقنية مرتبطة بعملية التنبيب. تقدم الدراسة الحالية طريقة بسيطة ومتسقة وغير جراحية للتقطير داخل القصبة الهوائية (ITI) في جراء الفئران التي يمكن استخدامها لدراسة فعالية مختلف التدخلات العلاجية لحديثي الولادة وكذلك لإنشاء نماذج حيوانية تحاكي أمراض الجهاز التنفسي لحديثي الولادة.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (البروتوكول رقم 2020-0035) في جامعة كيس ويسترن ريزيرف. عوملت جميع الحيوانات وفقا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر.

1. الحيوانات

  1. تجاريا الحصول على الفئران Sprague Dawley الحوامل.
  2. الحفاظ على الحيوانات في منشأة بيطرية معتمدة مع دورة ضوء وظلمة 14 ساعة / 10 ساعات ورطوبة نسبية 45-60٪.

2. تحضير مركب الاختبار

  1. استخدم صبغة إيفانز الزرقاء كمركب اختبار لتقييم فعالية إجراء التقطير داخل القصبة الهوائية.
  2. قم بإعداد محلول 0.25٪ (ث / v) من الصبغة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (الرقم الهيدروجيني 7.2) وقم بتعقيم المرشح باستخدام مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر.

3. إدارة التخدير

  1. تخدير الجراء الفئران باستخدام التخدير بالغاز (3٪ أيسوفلوران في الأكسجين 100٪)، وذلك باستخدام نظام توصيل معدل يتكيف مع حديثي الولادة من الفئران الصغيرة.
  2. تحقق من فقدان ردود الفعل على الذيل والدواسة والتنفس الضحل لضمان العمق المناسب للتخدير لتنفيذ الإجراء.

4. التقطير داخل القصبة الهوائية (ITI)

  1. استخدمي الجراء الفئران في يوم ما بعد الولادة 5 (PN 5) ل ITI. متوسط وزن جرو الفئران PN 5 هو 12 غراما.
  2. كبح جماح جرو الفئران المخدر على منصة مسطحة مائلة باستخدام شريط وضع العلامات المختبرية. يتم تقييد الجرو بزاوية حوالي 45 درجة في وضع الاستلقاء.
  3. افتح فم المولود الجديد ، واسحب اللسان برفق إلى جانب واحد باستخدام ملقط حاد.
  4. استخدم منظارا صغيرا لمنظار الأذن قطره 2 مم متصلا بمنظار الأذن لتثبيت اللسان بلطف وللتصور السليم للحنجرة.
  5. استخدم نظام إضاءة الحلق ، أي منظار الأذن التشغيلي ، والعدسة المكبرة للحصول على تصور مناسب للحبال الصوتية (الشكل 1).
  6. ضع الحيوانات بزاوية 45 درجة في مستوى مائل. يتم استخدام أغطية الشريط السلكية لأقفاص الماوس (الشكل 2).
    ملاحظة: يوفر وضع الحيوان بزاوية 45 درجة تصورا أفضل لفتح القصبة الهوائية دون تدخل لسان المزمار.
  7. خذ طرف ماصة طويل الزاوية يستخدم لتحميل المواد الهلامية الغربية اللطخة. قطع قاعدة طرف ماصة باستخدام شفرة جراحية بحيث تتناسب بشكل جيد مع طرف حقنة 1 سم مكعب.
  8. استخدم حقنة 1 مل المعقمة المثبتة في طرف ماصة طويل الزاوية لتوصيل 30-50 ميكرولتر من المادة إلى الرئة. قم بعكس المحقنة وقم بشفط ما يقرب من 0.9 سم مكعب من الهواء في حقنة 1 مل متصلة بطرف الماصة متبوعة بالصبغة أو المادة المراد تسليمها. يسمح هذا بدفع الهواء خلف الصبغة إلى القصبة الهوائية بعد إعطاء الصبغة كما هو موضح في الشكل 3. يتم تحقيق الإدارة داخل القصبة الهوائية عن طريق تصور تجويف الحنجرة (الحبال الصوتية) وإدخال طرف الماصة المركب على حقنة في تجويف القصبة الهوائية.
  9. استخدم منظار الأذن لعقد اللسان وكشف الحبال الصوتية. المنظار يخدم دور شفرة منظار الحنجرة. ثني طرف الماصة إلى زاوية 30 درجة لتسهيل إدخال العامل بسهولة من خلال المنظار المخروطي الشكل في فتحة القصبة الهوائية.
  10. أدخل طرف الماصة في فتحة القصبة الهوائية إلى نقطة حوالي 2 مم خارج الحبال الصوتية. ادفع مكبس المحقنة لإدارة الصبغة أو الدواء من خلال منظار منظار الأذن العامل كما هو موضح في الشكل 3. إدخال الهواء إلى الرئة بعد فترة وجيزة من إعطاء العامل يمنع المادة من العودة إلى تجويف الحنجرة.
  11. بعد إعطاء الجرو بالصبغة أو المالحة العادية ، ضع الجراء على وسادة تسخين سائلة متداولة مدمجة (38 درجة مئوية) حتى تصبح حركاتهم التنفسية منتظمة. بعد الشفاء التام من التخدير ، قم بإعادة توحيد الجراء مع السد.

5. توصيف تسليم ITI

  1. بعد ITI ، القتل الرحيم لجراء الفئران عن طريق إعطاء التخدير المفرط (الكيتامين 100 ملغ / كغ والزيلازين 10 ملغ / كغ) / ثيوبينتون تليها الاستئصال في وقت مناسب بعد الإدارة. تم إجراء القتل الرحيم كجزء من التجربة لجمع أنسجة الرئة لإثبات الفعالية.
  2. تأمين جرو الفئران القتل الرحيم على لوحة تشريح ومسح الصدر والبطن مع 70 ٪ من الكحول الإيثيلي.
  3. لتقييم توزيع الصبغة في جميع أنحاء الرئة ، قم بإزالة الرئتين من الحيوان باستخدام تقنية معقمة وعرض الرئتين حسب الاقتضاء للتصوير (الشكل 4A ، B).

النتائج

كشف تقطير إيفانز الأزرق عن توزيع متعدد البؤر للصبغة يشمل جميع الفصوص الرئوية (الشكل 4A ، B). توضح نتيجتنا كما هو موضح في الشكل 4 فعالية التوزيع على جميع الفصوص. يتم التقاط الصورة مباشرة بعد ITI للصبغة في القصبة الهوائية. تم تحقيق فعالية 100٪ في غرس الصبغة...

Discussion

التقطير داخل القصبة الهوائية هو طريقة ممتازة توفر العديد من المزايا على الطرق الحالية للتدخلات في أمراض الجهاز التنفسي وكذلك تطوير نموذج المرض. إنها طريقة سريعة وذات خبرة ، يمكن تنفيذها بمتوسط سرعة 2-3 دقائق لكل. الاعتبارات الرئيسية للتنبيب الناجح هي التخدير السليم للحيوان ، وهو تحديد الم...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل جزئيا بواسطة R01HD090887-01A1 من NICHD إلى AH. يعترف المؤلفون أيضا بالتسهيلات التي يقدمها مختبر الدكتور بيتر ماك فارلين مثل نظام التخدير بالاستنشاق / وسادة التدفئة. وتحظى السيدة كاثرين ماير بالتقدير للمساعدة القيمة التي قدمتها في إنشاء النظام. ولم تقم هيئة التمويل بأي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها وتفسيرها أو في كتابة المخطوطة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Evans Blue dyeSigma-Aldrich, St Louis, MO, USA314-13-6Confirmation of drug administration into lungs
Ketamine HydrochlorideHospira. Inc, Lake Forest, IL, USADispensed from Animal care facilityFor sedation
Operating OtoscopeWelch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, USA21770- 3.5VFor visualization of vocal cords
Otoscope Rechargeable HandleWelch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, USA71050-C
Pipette tip (Gel loading)Fisherbrand02-707-139Administering the drug
Platform for restraining (inclined plane)Animal care facilityDispensed from Animal care facilityWired roof of mice cage can be used
3M Micropore Surgical White Paper (sticking tape)3M, St. Paul, MN, USA1530-2
Luer Lock SyringeSyringes (1 ml)BD Franklin Lakes, NJ , USANBD2515Administering the drug
XylazineHospira. Inc, Lake Forest, IL, USAFor sedation

References

  1. Pulmonary Cell Biology Lab: Neonatal Lung Disease. Mayo Clinic Available from: https://www.mayo.edu/research/labs/pulmonary-cell-biology/projects/neonatal=lung-disease (2020)
  2. Martínez-Burnes, J., López, A., Lemke, K., Dobbin, G. Transoral intratracheal inoculation method for use with neonatal rats. Comparative Medicine. 51 (2), 134-137 (2001).
  3. Pinkerton, K. E., Crapo, J. D., Witschi, H., Brain, J. D. Morphometry of the alveolar region of the lung. Toxicology of Inhaled Materials Handbook of Experimental Pharmacology. 95, 259-285 (1985).
  4. Nardiello, C., Mižíková, I., Morty, R. E. Looking ahead: where to next for animal models of bronchopulmonary dysplasia. Cell and Tissue Research. 367 (3), 457-468 (2017).
  5. Sugimoto, M., Ando, M., Senba, H., Tokuomi, H. Lung defenses in neonates: Effects of bronchial lavage fluids from adult and neonatal rabbits on superoxide production by their alveolar macrophages. Journal of the Reticuloendothelial Society. 27 (6), 595-606 (1980).
  6. Grayson, M. H., et al. Controls for lung dendritic cell maturation and migration during respiratory viral infection. Journal of Immunology. 179 (3), 1438-1448 (2007).
  7. Moreira, A., et al. Intranasal delivery of human umbilical cord Wharton's jelly mesenchymal stromal cells restores lung alveolarization and vascularization in experimental bronchopulmonary dysplasia. Stem Cells Translational Medicine. 9 (2), 221-234 (2020).
  8. Bar-Haim, E., et al. Interrelationship between dendritic cell trafficking and Francisella tularensis dissemination following airway infection. PLoS Pathogens. 4 (11), 1000211 (2008).
  9. Linderholm, A. L., Franzi, L. M., Bein, K. J., Pinkerton, K. E., Last, J. A. A quantitative comparison of intranasal and intratracheal administration of coarse PM in the mouse. Integrative Pharmacology, Toxicology and Genotoxicology. 1 (1), 5-10 (2015).
  10. Guerra, K., et al. Intra-tracheal administration of a naked plasmid expressing stromal derived factor-1 improves lung structure in rodents with experimental bronchopulmonary dysplasia. Respiratory Research. 20 (1), 255 (2019).
  11. Thomas, R., et al. Influence of particle size on the pathology and efficacy of vaccination in a murine model of inhalational anthrax. Journal of Medical Microbiology. 59, 1415-1427 (2010).
  12. Sakurai, R., et al. A combination of the aerosolized PPAR-γ agonist pioglitazone and a synthetic surfactant protein B peptide mimic prevents hyperoxia-induced neonatal lung injury in rats. Neonatology. 113 (4), 296-304 (2018).
  13. Rayamajhi, M., et al. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (51), e2702 (2011).
  14. Brain, J. D., Knudson, D. E., Sorokin, S. P., Davis, M. A. Pulmonary distribution of particles given by intratracheal instillation or by aerosol inhalation. Environmental Research. 11 (1), 13-33 (1976).
  15. Pritchard, J. N., et al. The distribution of dust in the rat lung following administration by inhalation and by single intratracheal instillation. Environmental Research. 36 (2), 268-297 (1985).
  16. Ruzinski, J. T., Skerrett, S. J., Chi, E. Y., Martin, T. R. Deposition of particles in the lungs of infant and adult rats after direct intratracheal administration. Laboratory Animal Science. 45 (2), 205-210 (1995).
  17. Sun, B., Curstedt, T., Song, G. W., Robertson, B. Surfactant improves lung function and morphology in newborn rabbits with meconium aspiration. Biology of the Neonate. 63 (2), 96-104 (1993).
  18. Nicholson, J. W., Kinkead, E. R. A simple device for intratracheal injections in rats. Laboratory Animal Science. 32 (5), 509-510 (1982).
  19. Carlon, M., et al. Efficient gene transfer into the mouse lung by fetal intratracheal injection of rAAV2/6.2. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18 (12), 2130-2138 (2010).
  20. Chen, C. -. M., Chen, Y. -. J., Huang, Z. -. H. Intratracheal Instillation of Stem Cells in Term Neonatal Rats. Journal of Visualized Experiments. (159), e61117 (2020).
  21. Reynolds, R. D. Preventing maternal cannibalism in rats. Science. 213 (4512), 1146 (1981).
  22. Park, C. M., Clegg, K. E., Harvey-Clark, C. J., Hollenberg, M. J. Improved techniques for successful neonatal rat surgery. Laboratory Animal Science. 42 (5), 508-513 (1992).
  23. Cleary, G. M., et al. Exudative lung injury is associated with decreased levels of surfactant proteins in a rat model of meconium aspiration. Pediatrics. 100 (6), 998-1003 (1997).
  24. Das, S., MacDonald, K., Chang, H. -. Y. S., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318 (2013).
  25. Oka, Y., et al. A reliable method for intratracheal instillation of materials to the entire lung in rats. Journal of Toxicologic Pathology. 19 (2), 107-109 (2006).
  26. Watanabe, A., Hashimoto, Y., Ochiai, E., Sato, A., Kamei, K. A simple method for confirming correct endotracheal intubation in mice. Laboratory Animals. 43 (4), 399-401 (2009).
  27. Kim, J. -. S., et al. An automatic video instillator for intratracheal instillation in the rat. Laboratory Animals. 44 (1), 20-24 (2010).
  28. Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. Journal of Visualized Experiments. (93), e52261 (2014).
  29. Ordodi, V. L., Mic, F. A., Mic, A. A., Sandesc, D., Paunescu, V. A simple device for intubation of rats. Lab Animal. 34 (8), 37-39 (2005).
  30. Cleary, G. M., Wiswell, T. E. Meconium-stained amniotic fluid and the meconium aspiration syndrome. An update. Pediatric Clinics of North America. 45 (3), 511-529 (1998).
  31. Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An improved method for rapid intubation of the trachea in mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
  32. Litvin, D. G., Dick, T. E., Smith, C. B., Jacono, F. J. Lung-injury depresses glutamatergic synaptic transmission in the nucleus tractus solitarii via discrete age-dependent mechanisms in neonatal rats. Brain, Behavior, and Immunity. 70, 398-422 (2018).
  33. Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Laboratory Animals. 41 (1), 128-135 (2007).
  34. Kim, Y. E., et al. Intratracheal transplantation of mesenchymal stem cells simultaneously attenuates both lung and brain injuries in hyperoxic newborn rats. Pediatric Research. 80 (3), 415-424 (2016).
  35. Chang, Y. S., et al. Intratracheal transplantation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells dose-dependently attenuate hyperoxia-induced lung injury in neonatal rats. Cell Transplantation. 20 (11-12), 1843-1854 (2011).
  36. Chang, Y. S., et al. Timing of umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells transplantation determines therapeutic efficacy in the neonatal hyperoxic lung injury. PloS One. 8 (1), 52419 (2013).
  37. Mowat, V., Alexander, D. J., Pilling, A. M. A comparison of rodent and nonrodent laryngeal and tracheal bifurcation sensitivities in inhalation toxicity studies and their relevance for human exposure. Toxicologic Pathology. 45 (1), 216-222 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

174

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved