JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

İlaçların doğrudan yenidoğan kemirgenlerinin trakeasına damlatılması tekniği, lokal olarak uygulanan ilaçların veya biyolojiklerin yenidoğan akciğer hastalıkları üzerindeki etkisini incelemede önemlidir. Ek olarak, bu yöntem hayvan modellerinde akciğer hasarını indüklemek için de kullanılabilir.

Özet

Yenidoğan kemirgeninin doğrudan trakeaya aşılanan ilaçlarla tedavisi, lokal olarak uygulanan bir ilacın etkisini incelemek için değerli bir araç olarak hizmet edebilir. Bunun doğrudan translasyonel etkisi vardır, çünkü yüzey aktif madde ve ilaçlar lokal olarak akciğerlere uygulanır. Literatürde terapötik deneylerde yetişkin fare ve sıçanların minimal invaziv transoral entübasyonunu tanımlayan birçok yayın olmasına rağmen, yenidoğan sıçan yavrularında bu yaklaşım eksiktir. Yavrularda orotrakeal bölgenin/farenksin küçük boyutu, laringeal lümenin (ses telleri) görüntülenmesini zorlaştırarak intratrakeal ilaç dağıtımının değişken başarı oranına katkıda bulunur. Bu vesileyle, yenidoğan sıçan yavrusunun etkili oral entübasyonunu gösteriyoruz - travmatik olmayan ve minimal invaziv bir tekniktir, böylece ilaçların seri uygulanması için kullanılabilir. Sıçan yenidoğanlarının trakeal açıklığını görselleştirmek için aydınlatma sistemine sahip bir otoskop ve büyüteç lens kullandık. İlaç daha sonra bir pipet ucuna bağlı 1 mL'lik bir şırınga kullanılarak aşılanır. Teslimat yönteminin doğruluğu Evans mavi boya uygulaması kullanılarak gösterilmiştir. Bu yöntemin eğitilmesi kolaydır ve trakeaya ilaç aşılamanın etkili bir yolu olarak hizmet edebilir. Bu yöntem aynı zamanda hayvanlarda hastalık koşullarını simüle etmek için inokülum veya ajanların uygulanması ve ayrıca çeşitli akciğer hastalıkları için hücre bazlı tedavi stratejileri için de kullanılabilir.

Giriş

Prematüre doğan yenidoğanlar, uzun süreli ventilasyon gibi birçok girişimsel tedavi gerektiren zayıf gelişmiş akciğerlere sahiptir. Bu müdahaleler, hayatta kalan yenidoğanları sonraki sekeller 1 için yüksek bir risk altınasokar. Deneysel hayvan modelleri, çeşitli hastalık durumlarını simüle etmede, hastalıkların patobiyolojisini incelemede ve terapötik müdahaleleri değerlendirmede önemli bir araç olarak hizmet eder. Farelerden, sıçanlardan ve tavşanlardan erken dönem kuzu ve domuzlara kadar çok çeşitli hayvan modelleri mevcut olsa da, fareler ve sıçanlar en çok kullanılanlardır.

Fareleri ve sıçanları kullanmanın birincil avantajı, nispeten kısa gebelik süresi ve düşük maliyettir. Ayrıca kolayca temin edilebilirler, hastalıksız ortamlarda bakımı kolaydır, genetik olarak homojendirler ve nispeten daha az etik kaygıya sahiptirler 2,3. Kemirgen modelinin bir diğer önemli avantajı, doğumda yenidoğan yavrusunun akciğer gelişiminin geç kanaliküler / erken sakküler aşamasında olmasıdır ve morfolojik olarak bronkopulmoner displazi geliştirmeye devam eden 24 haftalık erken doğum yapan bir yenidoğan insan bebeğinin akciğerine eşdeğerdir4. Ek olarak, akciğer gelişimleri yaşamın ilk 4 haftasında hızla tamamlandıkça, doğum sonrası akciğer olgunlaşmasını makul bir zaman diliminde incelemek mümkündür4. Bu avantajlara rağmen, farelerin ve sıçan yavrularının küçük boyutları, çoğu araştırmacıyı yavrular yerine yetişkin hayvanları kullanmaya zorlayan çeşitli müdahaleler için bir endişe kaynağıdır5. Yenidoğan akciğerleri gelişim aşamasındadır ve bir yenidoğanın kışkırtıcı bir ajana tepkisi bir yetişkininkinden farklıdır. Bu, insan yenidoğan hastalığı koşullarını incelemek için yenidoğan hayvan modellerinin kullanılmasını uygun kılar.

Akciğere ilaç/biyolojik ajan uygulamak için farklı yöntemler vardır. Buna intranazal 6,7 veya intratrakeal 8,9,10 damlatma ve aerosol inhalasyonu 11,12 dahildir. Her yaklaşımın kendi teknik zorlukları, avantajları ve sınırlamaları vardır13. Sistemik etkileri atlayarak organdaki doğrudan terapötik etkiyi incelemek için terapötik ajanların intratrakeal uygulama yolu tercih edilir. Bu yol, provoke edici ajanların neden olduğu akciğer patolojisini incelemek için de kullanılabilir. Bunu yapmak için hem invaziv hem de minimal invaziv teknikler vardır ve yetişkinlerde uygulanması kolaydır. Bununla birlikte, yavrularda, hayvanın küçük boyutu nedeniyle, entübasyon işlemi ile ilgili teknik zorluklar vardır. Bu çalışma, sıçan yavrularında, çeşitli yenidoğan terapötik müdahalelerinin etkinliğini incelemek ve yenidoğan solunum yolu hastalıklarını simüle eden hayvan modelleri oluşturmak için kullanılabilecek basit, tutarlı, cerrahi olmayan bir intratrakeal instilasyon (ITI) yöntemi sunmaktadır.

Protokol

Tüm deneyler, Case Western Reserve Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (protokol # 2020-0035) tarafından onaylanmıştır. Tüm hayvanlar, laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için NIH kılavuzlarına uygun olarak tedavi edildi.

1. Hayvanlar

  1. Ticari olarak hamile Sprague Dawley sıçanları elde edin.
  2. Hayvanları 14 saat / 10 saat açık-karanlık döngüsü ve% 45-60 bağıl nem ile onaylanmış bir veterinerlik tesisinde tutun.

2. Test bileşiğinin hazırlanması

  1. İntratrakeal damlatma prosedürünün etkinliğini değerlendirmek için test bileşiği olarak Evans mavi boyasını kullanın.
  2. Fosfat tamponlu salin (pH 7.2) içinde boyanın% 0.25'lik (w / v) bir çözeltisini hazırlayın ve 0.45 μm'lik bir şırınga filtresi kullanarak sterilize edin.

3. Anestezi uygulaması

  1. Küçük sıçan yenidoğanları için uyarlanmış modifiye edilmiş bir dağıtım sistemi kullanarak, gaz anestezisi (% 100 oksijende% 3 izofluran) kullanarak sıçan yavrularını anestezi altına alın.
  2. Prosedürü gerçekleştirmek için uygun anestezi derinliğini sağlamak için kuyruk ve pedal reflekslerinin ve sığ nefes almanın kaybını kontrol edin.

4. İntratrakeal instilasyon (ITI)

  1. ITI için doğum sonrası 5. günde (PN 5) sıçan yavruları kullanın. PN 5 sıçan yavrusunun ortalama ağırlığı 12 gramdır.
  2. Anestezi uygulanan sıçan yavrusunu, laboratuvar etiketleme bandı kullanarak eğimli düz bir platformda tutun. Yavru, sırtüstü pozisyonda yaklaşık 45 ° 'lik bir açıyla tutulur.
  3. Yenidoğanın ağzını açın ve künt bir forseps kullanarak dili yavaşça bir tarafa çekin.
  4. Dili nazikçe tutmak ve gırtlağın uygun şekilde görselleştirilmesi için otoskopa bağlı 2 mm çapında küçük bir otoskop spekulumu kullanın.
  5. Ses tellerinin düzgün bir şekilde görselleştirilmesi için boğaz aydınlatıcı sistemini, yani ameliyat otoskobunu ve büyüteç lensini kullanın (Şekil 1).
  6. Hayvanları eğimli bir düzlemde 45°'lik bir açıyla konumlandırın. Fare kafeslerinin kablolu çubuk kapakları kullanılmıştır (Şekil 2).
    NOT: Hayvanın 45°'lik bir açıyla konumlandırılması, epiglottis müdahalesi olmadan trakea açıklığının daha iyi görüntülenmesini sağlar.
  7. Batı leke jellerini yüklemek için kullanılan uzun açılı bir pipet ucu alın. Pipet ucunun tabanını, 1 cc şırınganın ucuna iyice oturması için cerrahi bir bıçak kullanarak kesin.
  8. Maddenin 30-50 μL'sini akciğere vermek için uzun açılı pipet ucuna takılı steril 1 mL şırıngayı kullanın. Şırıngayı ters çevirin ve pipet ucuna bağlı 1 mL şırıngaya yaklaşık 0,9 cc hava aspire ve ardından boya veya verilecek maddeyi aspire edin. Bu, boyanın arkasındaki havanın, Şekil 3'te gösterildiği gibi boya uygulandıktan sonra trakeaya itilmesini sağlar. İntratrakeal uygulama, laringeal lümenin (ses telleri) görselleştirilmesi ve bir şırıngaya takılan pipet ucunun trakea lümenine yerleştirilmesiyle elde edilir.
  9. Dili tutmak ve ses tellerini açığa çıkarmak için otoskopun spekulumunu kullanın. Spekulum, laringoskopun bıçağının rolüne hizmet eder. Pipet ucunu 30°'lik bir açıyla bükerek maddenin koni şeklindeki spekulumdan trakea açıklığına kolayca girmesini kolaylaştırın.
  10. Pipet ucunu trakea açıklığına, ses tellerinin yaklaşık 2 mm ötesindeki noktaya getirin. Boyayı veya ilacı, Şekil 3'te gösterildiği gibi ameliyat otoskopunun spekulumundan uygulamak için şırınganın pistonunu itin. Ajanın uygulanmasından kısa bir süre sonra havanın akciğere girmesi, maddenin laringeal boşluğa geri gelmesini önler.
  11. Yavruyu boya veya normal salin ile uyguladıktan sonra, yavruları solunum hareketleri düzenli olana kadar entegre bir dolaşımdaki sıvı ısıtma yastığına (38 ° C) yerleştirin. Anesteziden tamamen kurtulduktan sonra, yavruları barajla yeniden birleştirin.

5. ITI teslimatının karakterizasyonu

  1. ITI sonrası, aşırı anestezi (Ketamin 100 mg / kg ve Xylazine 10 mg / kg) / tiyopenton ve ardından uygulama sonrası uygun bir zamanda ekssanguinasyon vererek sıçan yavrularını ötenazi yapın. Ötenazi, etkinliği göstermek için akciğer dokusunu toplamak için deneyin bir parçası olarak gerçekleştirildi.
  2. Ötanize sıçan yavrusunu bir diseksiyon tahtasına sabitleyin ve göğsü ve karnını% 70 etil alkolle silin.
  3. Boyanın akciğer boyunca dağılımını değerlendirmek için, steril teknik kullanarak akciğerleri hayvandan çıkarın ve akciğerleri görüntüleme için uygun şekilde görüntüleyin (Şekil 4A, B).

Sonuçlar

Evans mavisinin damlatılması, tüm pulmoner lobları tutan boyanın multifokal dağılımını ortaya çıkardı (Şekil 4A, B). Şekil 4'te gösterildiği gibi sonucumuz, tüm loblara dağılımın etkinliğini göstermektedir. Resim, trakeaya boyanın ITI'sından hemen sonra çekilir. Boyanın trakeaya damlatılmasında ve ardından her iki taraftaki tüm loblara yayılmasında% 100 etkinlik elde edildi. Boyanın akciğerin lobül içinde da...

Tartışmalar

İntratrakeal instilasyon, solunum yolu hastalığı girişimleri ve hastalık modeli geliştirme için mevcut yöntemlere göre çeşitli avantajlar sunan mükemmel bir yöntemdir. Hızlı bir yöntemdir ve tecrübe ile hayvan başına ortalama 2-3 dakikalık bir hızla gerçekleştirilebilir. Başarılı bir entübasyon için kilit hususlar, hayvanın uygun şekilde sedasyonu, doğru konumlandırılması, özellikle kafa ve ayrıca orofarenksteki spekulanın doğru yerleştirme derinliği / boyutudur. Uygun sedasyon, o...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen NICHD'den AH'ye R01HD090887-01A1 tarafından desteklenmiştir. Yazarlar ayrıca Dr. Peter Mc Farlane'in laboratuvarı tarafından sağlanan inhalasyon anestezisi / ısıtma yastığı sistemi gibi olanakları da kabul etmektedir. Bayan Catherine Mayer'in sistemin kurulmasındaki değerli yardımı takdir edilmektedir. Finansman kuruluşu tarafından çalışmanın tasarımında, verilerin toplanmasında, analizinde ve yorumlanmasında veya makalenin yazılmasında hiçbir rol oynamamıştır.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Evans Blue dyeSigma-Aldrich, St Louis, MO, USA314-13-6Confirmation of drug administration into lungs
Ketamine HydrochlorideHospira. Inc, Lake Forest, IL, USADispensed from Animal care facilityFor sedation
Operating OtoscopeWelch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, USA21770- 3.5VFor visualization of vocal cords
Otoscope Rechargeable HandleWelch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, USA71050-C
Pipette tip (Gel loading)Fisherbrand02-707-139Administering the drug
Platform for restraining (inclined plane)Animal care facilityDispensed from Animal care facilityWired roof of mice cage can be used
3M Micropore Surgical White Paper (sticking tape)3M, St. Paul, MN, USA1530-2
Luer Lock SyringeSyringes (1 ml)BD Franklin Lakes, NJ , USANBD2515Administering the drug
XylazineHospira. Inc, Lake Forest, IL, USAFor sedation

Referanslar

  1. Pulmonary Cell Biology Lab: Neonatal Lung Disease. Mayo Clinic Available from: https://www.mayo.edu/research/labs/pulmonary-cell-biology/projects/neonatal=lung-disease (2020)
  2. Martínez-Burnes, J., López, A., Lemke, K., Dobbin, G. Transoral intratracheal inoculation method for use with neonatal rats. Comparative Medicine. 51 (2), 134-137 (2001).
  3. Pinkerton, K. E., Crapo, J. D., Witschi, H., Brain, J. D. Morphometry of the alveolar region of the lung. Toxicology of Inhaled Materials Handbook of Experimental Pharmacology. 95, 259-285 (1985).
  4. Nardiello, C., Mižíková, I., Morty, R. E. Looking ahead: where to next for animal models of bronchopulmonary dysplasia. Cell and Tissue Research. 367 (3), 457-468 (2017).
  5. Sugimoto, M., Ando, M., Senba, H., Tokuomi, H. Lung defenses in neonates: Effects of bronchial lavage fluids from adult and neonatal rabbits on superoxide production by their alveolar macrophages. Journal of the Reticuloendothelial Society. 27 (6), 595-606 (1980).
  6. Grayson, M. H., et al. Controls for lung dendritic cell maturation and migration during respiratory viral infection. Journal of Immunology. 179 (3), 1438-1448 (2007).
  7. Moreira, A., et al. Intranasal delivery of human umbilical cord Wharton's jelly mesenchymal stromal cells restores lung alveolarization and vascularization in experimental bronchopulmonary dysplasia. Stem Cells Translational Medicine. 9 (2), 221-234 (2020).
  8. Bar-Haim, E., et al. Interrelationship between dendritic cell trafficking and Francisella tularensis dissemination following airway infection. PLoS Pathogens. 4 (11), 1000211 (2008).
  9. Linderholm, A. L., Franzi, L. M., Bein, K. J., Pinkerton, K. E., Last, J. A. A quantitative comparison of intranasal and intratracheal administration of coarse PM in the mouse. Integrative Pharmacology, Toxicology and Genotoxicology. 1 (1), 5-10 (2015).
  10. Guerra, K., et al. Intra-tracheal administration of a naked plasmid expressing stromal derived factor-1 improves lung structure in rodents with experimental bronchopulmonary dysplasia. Respiratory Research. 20 (1), 255 (2019).
  11. Thomas, R., et al. Influence of particle size on the pathology and efficacy of vaccination in a murine model of inhalational anthrax. Journal of Medical Microbiology. 59, 1415-1427 (2010).
  12. Sakurai, R., et al. A combination of the aerosolized PPAR-γ agonist pioglitazone and a synthetic surfactant protein B peptide mimic prevents hyperoxia-induced neonatal lung injury in rats. Neonatology. 113 (4), 296-304 (2018).
  13. Rayamajhi, M., et al. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (51), e2702 (2011).
  14. Brain, J. D., Knudson, D. E., Sorokin, S. P., Davis, M. A. Pulmonary distribution of particles given by intratracheal instillation or by aerosol inhalation. Environmental Research. 11 (1), 13-33 (1976).
  15. Pritchard, J. N., et al. The distribution of dust in the rat lung following administration by inhalation and by single intratracheal instillation. Environmental Research. 36 (2), 268-297 (1985).
  16. Ruzinski, J. T., Skerrett, S. J., Chi, E. Y., Martin, T. R. Deposition of particles in the lungs of infant and adult rats after direct intratracheal administration. Laboratory Animal Science. 45 (2), 205-210 (1995).
  17. Sun, B., Curstedt, T., Song, G. W., Robertson, B. Surfactant improves lung function and morphology in newborn rabbits with meconium aspiration. Biology of the Neonate. 63 (2), 96-104 (1993).
  18. Nicholson, J. W., Kinkead, E. R. A simple device for intratracheal injections in rats. Laboratory Animal Science. 32 (5), 509-510 (1982).
  19. Carlon, M., et al. Efficient gene transfer into the mouse lung by fetal intratracheal injection of rAAV2/6.2. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18 (12), 2130-2138 (2010).
  20. Chen, C. -. M., Chen, Y. -. J., Huang, Z. -. H. Intratracheal Instillation of Stem Cells in Term Neonatal Rats. Journal of Visualized Experiments. (159), e61117 (2020).
  21. Reynolds, R. D. Preventing maternal cannibalism in rats. Science. 213 (4512), 1146 (1981).
  22. Park, C. M., Clegg, K. E., Harvey-Clark, C. J., Hollenberg, M. J. Improved techniques for successful neonatal rat surgery. Laboratory Animal Science. 42 (5), 508-513 (1992).
  23. Cleary, G. M., et al. Exudative lung injury is associated with decreased levels of surfactant proteins in a rat model of meconium aspiration. Pediatrics. 100 (6), 998-1003 (1997).
  24. Das, S., MacDonald, K., Chang, H. -. Y. S., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318 (2013).
  25. Oka, Y., et al. A reliable method for intratracheal instillation of materials to the entire lung in rats. Journal of Toxicologic Pathology. 19 (2), 107-109 (2006).
  26. Watanabe, A., Hashimoto, Y., Ochiai, E., Sato, A., Kamei, K. A simple method for confirming correct endotracheal intubation in mice. Laboratory Animals. 43 (4), 399-401 (2009).
  27. Kim, J. -. S., et al. An automatic video instillator for intratracheal instillation in the rat. Laboratory Animals. 44 (1), 20-24 (2010).
  28. Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. Journal of Visualized Experiments. (93), e52261 (2014).
  29. Ordodi, V. L., Mic, F. A., Mic, A. A., Sandesc, D., Paunescu, V. A simple device for intubation of rats. Lab Animal. 34 (8), 37-39 (2005).
  30. Cleary, G. M., Wiswell, T. E. Meconium-stained amniotic fluid and the meconium aspiration syndrome. An update. Pediatric Clinics of North America. 45 (3), 511-529 (1998).
  31. Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An improved method for rapid intubation of the trachea in mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
  32. Litvin, D. G., Dick, T. E., Smith, C. B., Jacono, F. J. Lung-injury depresses glutamatergic synaptic transmission in the nucleus tractus solitarii via discrete age-dependent mechanisms in neonatal rats. Brain, Behavior, and Immunity. 70, 398-422 (2018).
  33. Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Laboratory Animals. 41 (1), 128-135 (2007).
  34. Kim, Y. E., et al. Intratracheal transplantation of mesenchymal stem cells simultaneously attenuates both lung and brain injuries in hyperoxic newborn rats. Pediatric Research. 80 (3), 415-424 (2016).
  35. Chang, Y. S., et al. Intratracheal transplantation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells dose-dependently attenuate hyperoxia-induced lung injury in neonatal rats. Cell Transplantation. 20 (11-12), 1843-1854 (2011).
  36. Chang, Y. S., et al. Timing of umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells transplantation determines therapeutic efficacy in the neonatal hyperoxic lung injury. PloS One. 8 (1), 52419 (2013).
  37. Mowat, V., Alexander, D. J., Pilling, A. M. A comparison of rodent and nonrodent laryngeal and tracheal bifurcation sensitivities in inhalation toxicity studies and their relevance for human exposure. Toxicologic Pathology. 45 (1), 216-222 (2017).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 174yenido anintratrakeal damlatmaent basyontransoralotoskop

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır