שיטה זעיר פולשנית להחדרת תרופות תוך-רחמיות במכרסמים יילודים לטיפול במחלות ריאה

Summary

טכניקה זו של החדרת תרופות ישירות לקנה הנשימה של מכרסמים יילודים חשובה לחקר ההשפעה של תרופות או ביולוגים מקומיים על מחלות ריאה בילודים. בנוסף, שיטה זו יכולה לשמש גם לגרימת פגיעה בריאה במודלים של בעלי חיים.

Abstract

טיפול במכרסם יילודים עם תרופות המוחדרות ישירות לקנה הנשימה יכול לשמש ככלי רב ערך לחקר ההשפעה של תרופה מקומית. יש לכך השפעה תרגומית ישירה מכיוון שחומרים פעילי שטח ותרופות ניתנים באופן מקומי לריאות. אף על פי שבספרות יש פרסומים רבים המתארים אינטובציה טרנס-אוראלית זעיר פולשנית של עכברים וחולדות בוגרים בניסויים טיפוליים, גישה זו בגורי חולדות יילודים לוקה בחסר. הגודל הקטן של אזור/לוע האורוטרכאלי אצל הגורים מקשה על הדמיה של לומן הגרון (מיתרי הקול), מה שתורם לשיעור ההצלחה המשתנה של אספקת תרופות תוך-רחמיות. אנו מדגימים בזאת אינטובציה אוראלית יעילה של גור חולדות יילודים - טכניקה שאינה טראומטית ומזערית פולשנית, כך שניתן להשתמש בה למתן סדרתי של תרופות. השתמשנו באוטוסקופ הפעלה עם מערכת תאורה ועדשה מגדלת כדי לדמיין את פתח קנה הנשימה של יילודי החולדות. לאחר מכן מחדירים את התרופה באמצעות מזרק 1 מ"ל המחובר לקצה פיפטה. הדיוק של שיטת המסירה הודגם באמצעות ניהול הצבע הכחול של אוונס. קל להכשיר שיטה זו והיא יכולה לשמש כדרך יעילה להחדיר סמים לקנה הנשימה. שיטה זו יכולה לשמש גם למתן אינוקולום או סוכנים כדי לדמות תנאי מחלה בבעלי חיים, וגם, עבור אסטרטגיות טיפול מבוססות תאים למחלות ריאה שונות.

Introduction

לילודים שנולדו בטרם עת יש ריאות מפותחות בצורה גרועה הדורשות טיפולים התערבותיים רבים כגון הנשמה ארוכת טווח. התערבויות אלה ממקמות את היילודים ששרדו בסיכון גבוה להמשך^{הבא 1}. מודלים ניסיוניים של בעלי חיים משמשים ככלי חשוב בהדמיית מצבי מחלה שונים, בחקר הפתוביולוגיה של מחלות ובהערכת התערבויות טיפוליות. אף על פי שמגוון רחב של מודלים של בעלי חיים, מעכברים, חולדות וארנבות ועד כבשים וחזירים טרום-קדנציה זמינים, עכברים וחולדות הם הנפוצים ביותר.

היתרון העיקרי של שימוש בעכברים ובחולדות הוא תקופת ההיריון הקצרה יחסית והעלות המופחתת. הם גם זמינים בקלות, קלים לתחזוקה בסביבות נטולות מחלות, הומוגניים מבחינה גנטית ויש להם דאגה פחות אתית יחסית ^2,3. יתרון מרכזי נוסף של מודל המכרסם הוא שבלידה הגור היילודי נמצא בשלב קנליקולרי/מוקדם מוקדם של התפתחות הריאה, אשר שווה מבחינה מורפולוגית לריאה של תינוק אנושי פג בן 24 שבועות שממשיך לפתח דיספלסיה ברונכופולמונרית⁴. בנוסף, ככל שהתפתחות הריאות שלהם מתקדמת במהירות להשלמה במהלך 4 השבועות הראשונים לחיים, ניתן לחקור את ההבשלה שלאחר הלידה של הריאה במסגרת זמן סבירה⁴. למרות יתרונות אלה, גודלם הקטן של העכברים וגורי החולדות הוא מקור לדאגה להתערבויות שונות, מה שמאלץ את רוב החוקרים להשתמש בבעלי חיים בוגרים ולא בגורים⁵. ריאות יילודים נמצאות בשלב התפתחותי והתגובה של יילוד לסוכן מסית שונה מזו של מבוגר. זה עושה את זה מתאים להשתמש במודלים של בעלי חיים יילודים כדי לחקור מצבים של מחלות יילודים אנושיות.

ישנן שיטות שונות למתן תרופות/ חומרים ביולוגיים לריאה. זה כולל^{החדרה תוך-ורידית 6,7} או תוך-תאית ^8,9,10 וכן שאיפת ^{אירוסול 11,12}. לכל גישה יש אתגרים טכניים משלה, יתרונות, כמו גם מגבלות¹³. מסלול תוך-נפשי של מתן חומרים טיפוליים עדיף לחקור את ההשפעה הטיפולית הישירה באיבר העוקף את ההשפעות המערכתיות. מסלול זה יכול לשמש גם לחקר הפתולוגיה של הריאות הנגרמת על ידי גורמים מסיתים. ישנן גם טכניקות פולשניות וגם זעיר פולשניות לעשות זאת והוא קל לביצוע במבוגרים. עם זאת, בגורים, בגלל גודלה הקטן של החיה, ישנם אתגרים טכניים הקשורים לתהליך האינטובציה. המחקר הנוכחי מציג שיטת החדרה תוך-רחמית פשוטה, עקבית ולא כירורגית (ITI) בגורי חולדות, שניתן להשתמש בה כדי לחקור את היעילות של התערבויות טיפוליות יילודיות שונות, כמו גם כדי ליצור מודלים של בעלי חיים המדמים מחלות נשימה בילודים.

Protocol

כל הניסויים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (פרוטוקול # 2020-0035) באוניברסיטת קייס ווסטרן ריזרב. כל בעלי החיים טופלו בהתאם להנחיות ה-NIH לטיפול בחיות מעבדה ולשימוש בהן.

1. בעלי חיים

1. להשיג באופן מסחרי חולדות ספראג דאולי בהריון.
2. יש לשמור על בעלי חיים במתקן וטרינרי מאושר עם מחזור אור-חושך של 14 שעות ו-45-60% לחות יחסית.

2. הכנת מתחם בדיקה

1. השתמש בצבע הכחול של אוונס כתרכובת הבדיקה כדי להעריך את היעילות של הליך ההחדרה התוך-צ'יאלי.
2. מכינים תמיסה של 0.25% (w/v) של הצבע במי מלח עם חציצת פוספט (pH 7.2) ומסננים עיקור באמצעות מסנן מזרק של 0.45 מיקרומטר.

3. ניהול הרדמה

1. מרדימים גורי חולדות באמצעות הרדמה בגז (3% איזופלורן ב-100% חמצן), באמצעות מערכת אספקה מותאמת המותאמת לילודים קטנים של חולדות.
2. בדוק את אובדן רפלקסי הזנב והדוושה והנשימה הרדודה כדי להבטיח את עומק ההרדמה הנכון לביצוע ההליך.

4. החדרה תוך-מוחית (ITI)

1. השתמשו בגורי חולדות ביום 5 שלאחר הלידה (PN 5) עבור ה-ITI. המשקל הממוצע של גור חולדה PN 5 הוא 12 גרם.
2. לרסן את גור החולדה המרדים על פלטפורמה שטוחה משופעת באמצעות סרט תיוג מעבדה. הגור מרוסן בזווית של כ-45° בתנוחת השכיבה.
3. פתחו את פיו של היילוד, ומשכו בעדינות את הלשון לצד אחד באמצעות מלקחיים קהים.
4. השתמש בספקולום אוטוסקופ קטן בקוטר 2 מ"מ המחובר לאוטוסקופ כדי להחזיק את הלשון בעדינות ולהדמיה נכונה של הגרון.
5. השתמשו במערכת תאורת הגרון, כלומר באוטוסקופ ההפעלה, ובעדשה המגדלת להדמיה נכונה של מיתרי הקול (איור 1).
6. מקם את החיות בזווית של 45° במישור משופע. נעשה שימוש במכסים הקוויים של כלובי העכברים (איור 2).
   הערה: מיקום החיה בזווית של 45° מספק הדמיה טובה יותר של פתח קנה הנשימה ללא הפרעה של האפיגלוטיס.
7. קחו לעצמכם קצה פיפטה ארוך זווית המשמש להעמסת ג'לים מערביים. חותכים את הבסיס של קצה הפיפטה באמצעות להב כירורגי כך שהוא מתאים היטב לקצה של מזרק 1 סמ"ק.
8. השתמשו במזרק הסטרילי 1 מ"ל המותאם לקצה פיפטה בעל זווית ארוכה כדי להעביר 30-50 μL של החומר לריאה. הפכו את המזרק ושאפו כמעט 0.9 סמ"ק אוויר לתוך המזרק 1 מ"ל המחובר לקצה הפיפטה ואחריו הצבע או החומר שיש להעביר. זה מאפשר לאוויר שמאחורי הצבע להידחף לקנה הנשימה לאחר מתן הצבע כפי שמוצג באיור 3. הניהול התוך-מוחי מושג על ידי הדמיית לומן הגרון (מיתרי הקול) והחדרת קצה הפיפטה המותאם למזרק לתוך לומן קנה הנשימה.
9. השתמש בספקולום של האוטוסקופ כדי להחזיק את הלשון ולחשוף את מיתרי הקול. ספקולום משרת את תפקיד הלהב של לרינגוסקופ. כופפו את קצה הפיפטה לזווית של 30° כדי לאפשר החדרה קלה של הסוכן דרך הספקולום בצורת חרוט לתוך פתח קנה הנשימה.
10. הכניסו את קצה הפיפטה לפתח קנה הנשימה עד כדי כ-2 מ"מ מעבר למיתרי הקול. דחפו את הבוכנה של המזרק כדי לתת את הצבע או את התרופה דרך הספקולום של אוטוסקופ ההפעלה כפי שמוצג באיור 3. הכנסת אוויר לריאה זמן קצר לאחר מתן הסוכן מונעת מהחומר לחזור לחלל הגרון.
11. לאחר מתן הגור עם הצבע או מי מלח רגילים, הניחו את הגורים על כרית חימום נוזלית משולבת במחזור הדם (38 מעלות צלזיוס) עד שתנועות הנשימה שלהם סדירות. לאחר התאוששות מלאה מהרדמה, לאחד מחדש את הגורים עם הסכר.

5. אפיון מסירת ITI

1. לאחר ITI, הרדים את גורי החולדה על ידי מתן הרדמה מוגזמת (קטמין 100 מ"ג/ק"ג וקסילזין 10 מ"ג/ק"ג) / תיאופנטון ולאחר מכן אקסנגוויציה בזמן המתאים לאחר מתן. המתת חסד בוצעה כחלק מהניסוי לאיסוף רקמת ריאה כדי להדגים את היעילות.
2. מאבטחים את גור החולדה המתים על לוח דיסקציה ומנגבים את החזה והבטן ב-70% אלכוהול אתילי.
3. להערכת התפלגות הצבע לאורך הריאה, הסירו את הריאות מבעל החיים בטכניקה סטרילית והציגו את הריאות כמתאימות להדמיה (איור 4A,B).

תוצאות

ההחדרה של כחול אוונס חשפה התפלגות מולטיפוקלית של הצבע המערב את כל האונות הריאתיות (איור 4A,B). התוצאה שלנו כפי שמוצגת באיור 4 מדגימה את יעילות ההתפלגות לכל האונות. התמונה צולמה מיד לאחר ITI של הצבע לתוך קנה הנשימה. יעילות של 100% הושגה בהחדרת הצבע לקנה הנ?...

Discussion

החדרה תוך-רחמית היא שיטה מצוינת המציעה מספר יתרונות על פני השיטות הקיימות להתערבויות במחלות בדרכי הנשימה, כמו גם לפיתוח מודל המחלה. זוהי שיטה מהירה ועם ניסיון, ניתן לבצע במהירות ממוצעת של 2-3 דקות לכל חיה. השיקולים המרכזיים לאינטובציה מוצלחת הם הרגעה נכונה של החיה, זהו מיקום נכון, במיוחד הרא...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Evans Blue dye	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	314-13-6	Confirmation of drug administration into lungs
Ketamine Hydrochloride	Hospira. Inc, Lake Forest, IL, USA	Dispensed from Animal care facility	For sedation
Operating Otoscope	Welch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, USA	21770- 3.5V	For visualization of vocal cords
Otoscope Rechargeable Handle	Welch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, USA	71050-C
Pipette tip (Gel loading)	Fisherbrand	02-707-139	Administering the drug
Platform for restraining (inclined plane)	Animal care facility	Dispensed from Animal care facility	Wired roof of mice cage can be used
3M Micropore Surgical White Paper (sticking tape)	3M, St. Paul, MN, USA	1530-2
Luer Lock SyringeSyringes (1 ml)	BD Franklin Lakes, NJ , USA	NBD2515	Administering the drug
Xylazine	Hospira. Inc, Lake Forest, IL, USA		For sedation