Um método minimamente invasivo para a instilação intratraqueal de drogas em roedores neonatais para tratar doenças pulmonares

Resumo

Essa técnica de incutir drogas diretamente na traqueia de roedores neonatais é importante no estudo do impacto de medicamentos ou biológicos administrados localmente em doenças pulmonares neonatais. Além disso, este método também pode ser usado para induzir lesões pulmonares em modelos animais.

Resumo

O tratamento de roedores neonatais com drogas incutidas diretamente na traqueia poderia servir como uma ferramenta valiosa para estudar o impacto de uma droga administrada localmente. Isso tem impacto translacional direto porque surfactante e drogas são administradas localmente nos pulmões. Embora a literatura tenha muitas publicações descrevendo a intubação transoral minimamente invasiva de camundongos e ratos adultos em experimentos terapêuticos, essa abordagem em filhotes de ratos neonatais é escassa. O pequeno tamanho da região orotraqueal/faringe nos filhotes dificulta a visualização de lúmen laríngeo (cordas vocais), contribuindo para a taxa de sucesso variável da entrega de medicamentos intratracheais. Demonstramos uma intubação oral eficaz do filhote de rato neonatal - uma técnica não traumática e minimamente invasiva, para que possa ser usada para administração serial de drogas. Usamos um otoscópio operacional com um sistema de iluminação e uma lente de ampliação para visualizar a abertura traqueal dos recém-nascidos de ratos. A droga é então incutido usando uma seringa de 1 mL conectada a uma ponta de pipeta. A precisão do método de entrega foi demonstrada usando a administração de corante azul Evans. Este método é fácil de ser treinado e pode servir como uma maneira eficaz de incutir drogas na traqueia. Este método também poderia ser usado para a administração de inóculos ou agentes para simular condições da doença em animais e, também, para estratégias de tratamento de base celular para várias doenças pulmonares.

Introdução

Os recém-nascidos prematuramente têm pulmões mal desenvolvidos que requerem muitas terapias intervencionistas, como ventilação a longo prazo. Essas intervenções colocam os recém-nascidos sobreviventes em alto risco de sequelas^{subsequentes 1}. Modelos animais experimentais servem como importante ferramenta na simulação de diversas condições da doença, no estudo da patobiologia das doenças e na avaliação de intervenções terapêuticas. Embora uma ampla gama de modelos animais, desde ratos, ratos e coelhos até cordeiros e porcos pré-termo, são os mais usados.

A principal vantagem do uso de camundongos e ratos é o período de gestação relativamente curto e o custo reduzido. Eles também são prontamente disponíveis, fáceis de manter em ambientes livres de doenças, geneticamente homogêneos e têm relativamente menos preocupação ética ^2,3. Outra grande vantagem do modelo de roedor é que ao nascer o filhote neonatal está em estágio canalicular/inicial do desenvolvimento pulmonar que é morfologicamente equivalente ao pulmão de um bebê humano neonatal pré-período de 24 semanas que passa a desenvolver displasia broncopulmonar⁴. Além disso, à medida que seu desenvolvimento pulmonar avança rapidamente para a conclusão nas primeiras 4 semanas de vida, é viável estudar a maturação pulmonar pós-natal em um período razoável^{de tempo 4}. Apesar dessas vantagens, o pequeno tamanho dos camundongos e filhotes de ratos é uma fonte de preocupação para várias intervenções, o que obriga a maioria dos pesquisadores a usar animais adultos em vez de filhotes⁵. Os pulmões neonatais estão em estágio de desenvolvimento e a resposta de um recém-nascido a um agente incitante difere da de um adulto. Isso torna apropriado o uso de modelos neonatais de animais para estudar as condições da doença neonatal humana.

Existem diferentes métodos para administrar drogas/ agentes biológicos para o pulmão. Isso inclui intranasal ^6,7 ou intratraqueal ^8,9,10 de instilação, bem como inalação de aerossol^11,12. Cada abordagem tem seus próprios desafios técnicos, vantagens, bem como limitações¹³. A via intratraqueal de administração de agentes terapêuticos é preferível estudar o impacto terapêutico direto no órgão contornando os efeitos sistêmicos. Essa rota também pode ser usada para estudar a patologia pulmonar causada por agentes incitantes. Existem técnicas invasivas e minimamente invasivas para fazer isso e é fácil de executar em adultos. No entanto, nos filhotes, devido ao pequeno tamanho do animal, há desafios técnicos associados ao processo de intubação. O presente estudo apresenta um método simples, consistente, não cirúrgico de instilação intratraqueal (ITI) em filhotes de ratos que poderiam ser utilizados para estudar a eficácia de várias intervenções terapêuticas neonatais, bem como para gerar modelos animais simulando doenças respiratórias neonatais.

Protocolo

Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (protocolo nº 2020-0035) na Case Western Reserve University. Todos os animais foram tratados de acordo com as diretrizes do NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório.

1. Animais

1. Comercialmente obter ratos sprague dawley grávidas.
2. Mantenha os animais em uma instalação veterinária aprovada com ciclo claro-escuro de 14h/10 h e umidade relativa de 45-60%.

2. Preparação do composto de teste

1. Use corante azul Evans como composto de teste para avaliar a eficácia do procedimento de instilação intratraqueal.
2. Prepare uma solução de 0,25% (w/v) do corante em soro fisiológico tamponado com fosfato (pH 7.2) e esterilize o filtro usando um filtro de seringa de 0,45 μm.

3. Administração de anestesia

1. Anestesize filhotes de ratos usando anestesia gasosa (3% isoflurane em 100% oxigênio), usando um sistema de entrega modificado adaptado para pequenos recém-nascidos de ratos.
2. Verifique se há perda de reflexos da cauda e do pedal e respiração rasa para garantir a profundidade adequada da anestesia para a realização do procedimento.

4. Instilação intratraqueal (ITI)

1. Use filhotes de rato no pós-natal dia 5 (PN 5) para o ITI. O peso médio de um filhote de rato PN 5 é de 12 gramas.
2. Contenha o filhote de rato anestesiado em uma plataforma plana inclinada usando fita de rotulagem de laboratório. O filhote é contido em um ângulo de cerca de 45° na posição supina.
3. Abra a boca do recém-nascido e puxe suavemente a língua para um lado usando um fórceps sem cortes.
4. Use um pequeno espectlo otoscópio de 2 mm de diâmetro conectado ao otoscópio para segurar a língua suavemente e para uma visualização adequada da laringe.
5. Use o sistema iluminador da garganta, ou seja, o otoscópio operacional e a lente de ampliação para visualização adequada das cordas vocais (Figura 1).
6. Posicione os animais em um ângulo de 45° em um plano inclinado. São utilizadas as tampas das barras com fio das gaiolas do mouse (Figura 2).
   NOTA: Posicionar o animal em um ângulo de 45° proporciona melhor visualização da abertura traqueal sem a interferência das epiglotes.
7. Tome uma ponta de pipeta de ângulo longo que é usada para carregar géis de mancha ocidental. Corte a base da ponta da pipeta usando uma lâmina cirúrgica para que ela se encaixe bem na ponta da seringa de 1 cc.
8. Use a seringa estéril de 1 mL encaixada em uma ponta de pipeta de ângulo longo para fornecer 30-50 μL da substância no pulmão. Inverta a seringa e aspire quase 0,9 cc de ar na seringa de 1 mL conectada à ponta da pipeta seguida do corante ou da substância a ser entregue. Isso permite que o ar atrás do corante seja empurrado para dentro da traqueia depois que o corante é administrado como mostrado na Figura 3. A administração intratraqueal é alcançada visualizando o lúmen laríngeo (cordas vocais) e inserindo a ponta pipeta instalada em uma seringa no lúmen traqueal.
9. Use o espéculo do otoscópio para segurar a língua e expor as cordas vocais. Espélum serve o papel da lâmina de um laringoscópio. Dobre a ponta da pipeta em um ângulo de 30° para facilitar a fácil introdução do agente através do espéculo em forma de cone na abertura traqueal.
10. Introduza a ponta da pipeta na abertura traqueal ao ponto de cerca de 2 mm além das cordas vocais. Empurre o pistão da seringa para administrar o corante ou a droga através do espéculo do otoscópio operacional, como mostrado na Figura 3. A introdução do ar no pulmão logo após a administração do agente impede que a substância volte para a cavidade laríngea.
11. Depois de administrar o filhote com o corante ou soro fisiológico normal, coloque os filhotes em uma almofada de aquecimento de fluido circulante integrado (38°C) até que seus movimentos respiratórios estejam regulares. Após a completa recuperação da anestesia, reúna os filhotes com a represa.

5. Caracterização da entrega de ITI

1. Após o ITI, eutanize os filhotes de rato dando anestesia excessiva (Cetamina 100 mg/kg e Xylazine 10 mg/kg) / tiopentona seguida de exsanguinação em um momento apropriado pós-administração. A eutanásia foi realizada como parte do experimento para coletar tecido pulmonar para demonstrar a eficácia.
2. Fixar o filhote de rato eutanizado em uma placa de dissecção e limpar o peito e abdômen com 70% de álcool etílico.
3. Para avaliar a distribuição do corante em todo o pulmão, remova os pulmões do animal usando técnica estéril e exiba os pulmões conforme apropriado para a imagem (Figura 4A,B).

Resultados

A instilação do azul Evans revelou distribuição multifocal do corante envolvendo todos os lóbulos pulmonares (Figura 4A,B). Nosso resultado, como mostrado na Figura 4, demonstra eficácia de distribuição para todos os lóbulos. A foto é tirada imediatamente após iti do corante na traqueia. 100% de eficácia foi alcançado na instilação do corante na traqueia seguido por sua disseminação em todos os lóbulos de ambos os lados. Espera...

Discussão

A instilação intratracheal é um excelente método que oferece diversas vantagens sobre os métodos existentes para intervenções de doenças respiratórias, bem como o desenvolvimento de modelos de doenças. É um método rápido e com experiência, pode ser realizado com uma velocidade média de 2-3 minutos por animal. As principais considerações para uma intubação bem sucedida são a sedação adequada do animal, é o posicionamento correto, especialmente a cabeça, bem como a profundidade precisa de colocaçã...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Evans Blue dye	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	314-13-6	Confirmation of drug administration into lungs
Ketamine Hydrochloride	Hospira. Inc, Lake Forest, IL, USA	Dispensed from Animal care facility	For sedation
Operating Otoscope	Welch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, USA	21770- 3.5V	For visualization of vocal cords
Otoscope Rechargeable Handle	Welch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, USA	71050-C
Pipette tip (Gel loading)	Fisherbrand	02-707-139	Administering the drug
Platform for restraining (inclined plane)	Animal care facility	Dispensed from Animal care facility	Wired roof of mice cage can be used
3M Micropore Surgical White Paper (sticking tape)	3M, St. Paul, MN, USA	1530-2
Luer Lock SyringeSyringes (1 ml)	BD Franklin Lakes, NJ , USA	NBD2515	Administering the drug
Xylazine	Hospira. Inc, Lake Forest, IL, USA		For sedation