肺疾患を治療するための新生児げっ歯類における薬物の気管内点滴のための低侵襲方法

要約

新生児げっ歯類の気管に直接薬物を点滴するこの技術は、局所投与された薬物または生物学的製剤が新生児肺疾患に及ぼす影響を研究する上で重要である。さらに、この方法は、動物モデルにおける肺損傷を誘発するためにも使用され得る。

要約

気管に直接点滴された薬物による新生児げっ歯類の治療は、局所投与された薬物の影響を研究するための貴重なツールとして役立つ可能性がある。界面活性剤と薬物は肺に局所的に投与されるため、これは直接的な翻訳に影響を与えます。文献には、治療実験における成体マウスおよびラットの低侵襲経口腔挿管を記載した多くの出版物があるが、新生児ラットの仔におけるこのアプローチは欠けている。仔犬の口腔気管領域・咽頭の大きさが小さいため、喉頭内腔(声帯)の可視化が難しくなり、気管内薬物送達の成功率の変動に寄与しています。我々はここに、新生児ラット仔の効果的な経口挿管を実証する - 非外傷性および低侵襲性である技術であり、薬物の連続投与に使用することができる。照明システムと拡大レンズを備えた手術用耳鏡を使用して、ラット新生児の気管開口部を視覚化しました。次いで、薬物をピペットチップに接続された1mLシリンジを用いて点滴する。送達方法の精度を、エバンスブルー染料投与を用いて実証した。この方法は訓練を受けやすく、気管に薬物を注入する効果的な方法として役立つ可能性があります。この方法はまた、動物における疾患状態をシミュレートするための接種剤または薬剤の投与、および、また、様々な肺疾患に対する細胞ベースの治療戦略にも使用され得る。

概要

早産で生まれた新生児は、肺の発達が悪く、長期換気などの多くの介入療法が必要です。これらの介入は、生存している新生児をその後の後遺症1のリスクが高い^{状態に置く}。実験動物モデルは、さまざまな疾患状態をシミュレートし、疾患の病態生物学を研究し、治療介入を評価する上で重要なツールとして役立つ。マウス、ラット、ウサギから早産の子羊やブタまで、幅広い動物モデルが利用可能ですが、マウスとラットが最も使用されています。

マウスおよびラットを使用する主な利点は、妊娠期間が比較的短く、コストが削減されることです。それらはまた、容易に入手でき、無病な環境で維持しやすく、遺伝的に均質であり、倫理的懸念が比較的少ない^2,3。げっ歯類モデルのもう一つの大きな利点は、出生時に新生児の子犬が肺発達の後期小管状/早期嚢状段階にあり、形態学的に24週間の早産新生児ヒト乳児の肺と同等であり、気管支肺異形成を発症する⁴。さらに、彼らの肺の発達は生後4週間以内に完了まで急速に進行するので、合理的な時間枠で出生後の肺成熟を研究することは実行可能である⁴。これらの利点にもかかわらず、マウスおよびラットの仔のサイズが小さいことは、様々な介入の懸念の源であり、ほとんどの研究者は仔犬ではなく成体動物を使用することを余儀なくされる⁵。新生児肺は発達段階にあり、扇動剤に対する新生児の反応は成人の反応とは異なる。これにより、ヒトの新生児疾患状態を研究するために新生児動物モデルを使用することが適切である。

肺に薬物/生物学的薬剤を投与するには、さまざまな方法があります。これには、鼻腔内⁶、⁷または気管内⁸、⁹、¹⁰点眼ならびにエアロゾル吸入^11、12が含まれる。各アプローチには、独自の技術的課題、利点、および制限事項^{があります 13}.治療剤の気管内投与経路は、全身作用を迂回する器官における直接的な治療的影響を研究するのに好ましい。この経路は、扇動剤によって引き起こされる肺病理を研究するためにも使用することができる。これを行うには、侵襲的および低侵襲的な技術の両方があり、成人で実行するのは簡単です。しかし、子犬では、動物のサイズが小さいため、挿管プロセスに関連する技術的な課題があります。今回の研究は、ラット仔における単純で一貫性のある非外科的気管内点滴(ITI)法を提示しており、これは様々な新生児治療介入の有効性を研究し、新生児呼吸器疾患をシミュレートする動物モデルを生成するために使用することができる。

プロトコル

すべての実験は、ケースウェスタンリザーブ大学の施設動物ケアおよび使用委員会(プロトコル#2020-0035)によって承認されました。全ての動物を、実験動物のケアおよび使用に関するNIHガイドラインに従って処置した。

1. 動物

1. 妊娠中のスプレイグ・ドーリーラットを商業的に入手する。
2. 14時間/ 10時間の明暗サイクルと45〜60%の相対湿度で承認された獣医施設で動物を飼育してください。

2. 試験化合物の調製

1. 試験化合物としてエバンスブルー染料を使用して、気管内点眼手順の有効性を評価します。
2. リン酸緩衝生理食塩水(pH 7.2)中の色素の0.25%(w/v)溶液を調製し、0.45μmシリンジフィルターを使用してフィルター滅菌する。

3. 麻酔の投与

1. ガス麻酔(100%酸素中の3%イソフルラン)を用いてラットの仔を麻酔し、小型ラット新生児に適合した改変送達システムを使用する。
2. 尾とペダルの反射と浅い呼吸が失われていないか確認し、手順を実行するための麻酔の適切な深さを確認してください。

4. 気管内点滴(ITI)

1. 出生後5日目(PN 5)にラットの子犬をITIに使用してください。PN 5ラットの子犬の平均体重は12グラムです。
2. 麻酔をかけたラットの子犬を、実験室のラベリングテープを使用して傾斜した平らなプラットフォーム上で拘束する。子犬は仰臥位で約45°の角度で拘束されます。
3. 新生児の口を開き、鈍い鉗子を使って舌を片側にそっと引き抜きます。
4. 耳鏡に接続された直径2mmの小さな耳鏡鏡を使用して、舌を優しく保持し、喉頭を適切に視覚化します。
5. 喉の照明システム、すなわち手術用耳鏡、および拡大レンズを使用して、声帯を適切に視覚化します(図1)。
6. 動物を傾斜面で45°の角度で配置します。マウスケージの有線棒蓋を使用しています(図2)。
   注:動物を45°の角度で配置すると、喉頭蓋の干渉なしに気管開口部をよりよく視覚化できます。
7. ウェスタンブロットゲルの装填に使用される長い角度のピペットチップを取ります。手術用ブレードを使用してピペットチップのベースを、1ccシリンジの先端によく収まるように切断します。
8. 長角度のピペットチップに取り付けた滅菌 1 mL シリンジを使用して、30 ~ 50 μL の物質を肺に送ります。シリンジを反転させ、ピペットチップに接続された1 mLシリンジに約0.9 ccの空気を吸引し、その後に送達される染料または物質を吸引します。これにより、 図3に示すように、色素が投与された後、色素の背後にある空気を気管内に押し込むことができる。気管内投与は、喉頭管腔(声帯)を可視化し、シリンジに嵌め込んだピペットチップを気管内腔に挿入することによって達成される。
9. 耳鏡の鏡を使って舌を持ち、声帯を露出させます。スペキュラムは喉頭鏡の刃の役割を果たします。ピペットチップを30°の角度に曲げて、円錐形の鏡面から気管開口部への薬剤の導入を容易にします。
10. ピペットチップを気管開口部に声帯を越えて約2mmのところまで導入する。シリンジのピストンを押して、 図3に示すように、手術用耳鏡の鏡を通して色素または薬物を投与する。薬剤の投与直後に肺に空気を導入すると、物質が喉頭腔に戻るのを防ぐ。
11. 色素または通常の生理食塩水で子犬を投与した後、子犬の呼吸運動が規則的になるまで、統合された循環液加熱パッド(38°C)の上に置きます。麻酔から完全に回復した後、子犬をダムと再会させる。

5. ITI配信の特性評価

1. ITIの後、ラットの仔を安楽死させ、過剰な麻酔(ケタミン100mg / kgおよびキシラジン10mg / kg)/チオペントンを与え、続いて投与後の適切な時期に放血する。安楽死は、有効性を実証するために肺組織を採取する実験の一部として行った。
2. 安楽死させたラットの子犬を解剖ボードに固定し、胸部と腹部を70%エチルアルコールで拭きます。
3. 肺全体にわたる色素の分布を評価するために、滅菌技術を用いて動物から肺を除去し、画像化のために適切に肺を表示する(図4A、B)。

結果

エバンスブルーの点眼は、すべての肺葉を含む色素の多焦点分布を明らかにした(図4A、B)。 図4 に示すような我々の結果は、すべてのローブへの分布の有効性を実証している。写真は、気管への染料のITIの直後に撮影されます。100%の有効性は、色素を気管に点滴し、続いて両側のすべての葉に広がることで達成された。色素は肺小葉?...

ディスカッション

気管内点滴は、呼吸器疾患介入および疾患モデル開発のための既存の方法よりもいくつかの利点を提供する優れた方法である。それは迅速な方法であり、経験があれば、動物1匹あたり2〜3分の平均速度で行うことができます。挿管を成功させるための重要な考慮事項は、動物の適切な鎮静、特に頭部の正しい位置決め、および中咽頭のスペキュラの正確な配置/サイズです。適切な鎮静は、オ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Evans Blue dye	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	314-13-6	Confirmation of drug administration into lungs
Ketamine Hydrochloride	Hospira. Inc, Lake Forest, IL, USA	Dispensed from Animal care facility	For sedation
Operating Otoscope	Welch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, USA	21770- 3.5V	For visualization of vocal cords
Otoscope Rechargeable Handle	Welch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, USA	71050-C
Pipette tip (Gel loading)	Fisherbrand	02-707-139	Administering the drug
Platform for restraining (inclined plane)	Animal care facility	Dispensed from Animal care facility	Wired roof of mice cage can be used
3M Micropore Surgical White Paper (sticking tape)	3M, St. Paul, MN, USA	1530-2
Luer Lock SyringeSyringes (1 ml)	BD Franklin Lakes, NJ , USA	NBD2515	Administering the drug
Xylazine	Hospira. Inc, Lake Forest, IL, USA		For sedation