Un metodo minimamente invasivo per l'instillazione intratracheale di farmaci nei roditori neonatali per il trattamento delle malattie polmonari

Riepilogo

Questa tecnica di instillare farmaci direttamente nella trachea dei roditori neonatali è importante per studiare l'impatto di farmaci o biologici somministrati localmente sulle malattie polmonari neonatali. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato anche per indurre lesioni polmonari in modelli animali.

Abstract

Il trattamento del roditore neonatale con farmaci instillati direttamente nella trachea potrebbe servire come strumento prezioso per studiare l'impatto di un farmaco somministrato localmente. Questo ha un impatto traslazionale diretto perché tensioattivi e farmaci vengono somministrati localmente nei polmoni. Sebbene la letteratura abbia molte pubblicazioni che descrivono l'intubazione transorale minimamente invasiva di topi e ratti adulti in esperimenti terapeutici, questo approccio nei cuccioli di ratto neonatale è carente. Le piccole dimensioni della regione orotracheale / faringe nei cuccioli rendono difficile la visualizzazione del lume laringeo (corde vocali), contribuendo al tasso di successo variabile della somministrazione intratracheale del farmaco. Con la presente dimostriamo un'efficace intubazione orale del cucciolo di ratto neonatale - una tecnica non traumatica e minimamente invasiva, in modo che possa essere utilizzata per la somministrazione seriale di farmaci. Abbiamo usato un otoscopio operativo con un sistema di illuminazione e una lente d'ingrandimento per visualizzare l'apertura tracheale dei neonati di ratto. Il farmaco viene quindi instillato utilizzando una siringa da 1 mL collegata a una punta della pipetta. L'accuratezza del metodo di consegna è stata dimostrata utilizzando la somministrazione di colorante blu Evans. Questo metodo è facile da addestrare e potrebbe servire come un modo efficace per instillare farmaci nella trachea. Questo metodo potrebbe anche essere utilizzato per la somministrazione di inoculo o agenti per simulare le condizioni di malattia negli animali e, inoltre, per strategie di trattamento basate su cellule per varie malattie polmonari.

Introduzione

I neonati nati prematuramente hanno polmoni poco sviluppati che richiedono molte terapie interventistiche come la ventilazione a lungo termine. Questi interventi pongono i neonati sopravvissuti ad alto rischio di sequele^{successive 1}. I modelli animali sperimentali servono come strumento importante per simulare varie condizioni di malattia, studiare la patobiologia delle malattie e valutare gli interventi terapeutici. Anche se è disponibile una vasta gamma di modelli animali da topi, ratti e conigli ad agnelli e maiali pretermine, topi e ratti sono i più utilizzati.

Il vantaggio principale dell'utilizzo di topi e ratti è il periodo di gestazione relativamente breve e il costo ridotto. Sono anche facilmente reperibili, facili da mantenere in ambienti indenni da malattie, geneticamente omogenei e hanno relativamente meno preoccupazione etica ^2,3. Un altro grande vantaggio del modello di roditore è che alla nascita il cucciolo neonatale si trova in fase canalicolare tardiva / sacculare precoce dello sviluppo polmonare, che è morfologicamente equivalente al polmone di un neonato umano pretermine di 24 settimane che sviluppa la displasia broncopolmonare⁴. Inoltre, poiché il loro sviluppo polmonare progredisce rapidamente verso il completamento entro le prime 4 settimane di vita, è possibile studiare la maturazione polmonare post-natale in un lasso di tempo ragionevole⁴. Nonostante questi vantaggi, le piccole dimensioni dei topi e dei cuccioli di ratto sono fonte di preoccupazione per vari interventi, che costringono la maggior parte dei ricercatori a utilizzare animali adulti piuttosto che cuccioli⁵. I polmoni neonatali sono in una fase di sviluppo e la risposta di un neonato a un agente di incitamento differisce da quella di un adulto. Ciò rende appropriato l'uso di modelli animali neonatali per studiare le condizioni della malattia neonatale umana.

Esistono diversi metodi per somministrare farmaci / agenti biologici al polmone. Ciò include l'instillazione intranasale ^6,7 o intratracheale ^8,9,10 e l'inalazione di aerosol ^11,12. Ogni approccio ha le sue sfide tecniche, i suoi vantaggi e i suoi limiti¹³. La via intratracheale di somministrazione degli agenti terapeutici è preferita per studiare l'impatto terapeutico diretto nell'organo bypassando gli effetti sistemici. Questa via potrebbe anche essere utilizzata per studiare la patologia polmonare causata da agenti incitanti. Ci sono sia tecniche invasive che minimamente invasive per farlo ed è facile da eseguire negli adulti. Tuttavia, nei cuccioli, a causa delle piccole dimensioni dell'animale, ci sono sfide tecniche associate al processo di intubazione. Il presente studio presenta un metodo di instillazione intratracheale (ITI) semplice, coerente e non chirurgico nei cuccioli di ratto che potrebbe essere utilizzato per studiare l'efficacia di vari interventi terapeutici neonatali e per generare modelli animali che simulano le malattie respiratorie neonatali.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (protocollo # 2020-0035) presso la Case Western Reserve University. Tutti gli animali sono stati trattati in conformità con le linee guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio.

1. Animali

1. Ottenere commercialmente ratti Sprague Dawley gravidi.
2. Mantenere gli animali in una struttura veterinaria riconosciuta con ciclo luce-buio di 14 ore / 10 ore e umidità relativa del 45-60%.

2. Preparazione del composto in esame

1. Utilizzare il colorante blu Evans come composto di prova per valutare l'efficacia della procedura di instillazione intratracheale.
2. Preparare una soluzione allo 0,25% (p/v) del colorante in soluzione salina tamponata con fosfato (pH 7,2) e sterilizzare con filtro a siringa da 0,45 μm.

3. Somministrazione dell'anestesia

1. Anestetizzare i cuccioli di ratto utilizzando l'anestesia gassosa (3% di isoflurano in ossigeno al 100%), utilizzando un sistema di somministrazione modificato adattato per i neonati di ratti di piccole dimensioni.
2. Controllare la perdita dei riflessi della coda e del pedale e la respirazione superficiale per garantire la corretta profondità dell'anestesia per l'esecuzione della procedura.

4. Instillazione intratracheale (ITI)

1. Utilizzare cuccioli di ratto al giorno 5 post-natale (PN 5) per l'ITI. Il peso medio di un cucciolo di ratto PN 5 è di 12 grammi.
2. Trattenere il cucciolo di ratto anestetizzato su una piattaforma piatta inclinata usando del nastro adesivo da laboratorio. Il cucciolo è trattenuto con un angolo di circa 45° in posizione supina.
3. Aprire la bocca del neonato e tirare delicatamente la lingua da un lato usando una pinza smussata.
4. Utilizzare un piccolo speculum otoscopio di 2 mm di diametro collegato all'otoscopio per tenere delicatamente la lingua e per una corretta visualizzazione della laringe.
5. Utilizzare il sistema di illuminazione della gola, cioè l'otoscopio operativo e la lente d'ingrandimento per una corretta visualizzazione delle corde vocali (Figura 1).
6. Posizionare gli animali con un angolo di 45° su un piano inclinato. Vengono utilizzati i coperchi a barra cablata delle gabbie per topi (Figura 2).
   NOTA: Il posizionamento dell'animale con un angolo di 45° fornisce una migliore visualizzazione dell'apertura tracheale senza l'interferenza dell'epiglottide.
7. Prendi una punta di pipetta ad angolo lungo che viene utilizzata per caricare gel western blot. Tagliare la base della punta della pipetta usando una lama chirurgica in modo che si adatti bene alla punta della siringa da 1 cc.
8. Utilizzare la siringa sterile da 1 mL montata su una punta della pipetta ad angolo lungo per erogare 30-50 μL della sostanza nel polmone. Capovolgere la siringa e aspirare quasi 0,9 cc di aria nella siringa da 1 mL collegata alla punta della pipetta seguita dal colorante o dalla sostanza da somministrare. Ciò consente di spingere l'aria dietro il colorante nella trachea dopo la somministrazione del colorante, come mostrato nella Figura 3. La somministrazione intratracheale si ottiene visualizzando il lume laringeo (corde vocali) e inserendo la punta della pipetta montata su una siringa nel lume tracheale.
9. Usa lo speculum dell'otoscopio per tenere la lingua ed esporre le corde vocali. Speculum svolge il ruolo della lama di un laringoscopio. Piegare la punta della pipetta ad un angolo di 30° per facilitare la facile introduzione dell'agente attraverso lo speculum a forma di cono nell'apertura tracheale.
10. Introdurre la punta della pipetta nell'apertura tracheale fino al punto di circa 2 mm oltre le corde vocali. Spingere il pistone della siringa per somministrare il colorante o il farmaco attraverso lo speculum dell'otoscopio operativo, come mostrato nella Figura 3. L'introduzione di aria nel polmone subito dopo la somministrazione dell'agente impedisce alla sostanza di tornare nella cavità laringea.
11. Dopo aver somministrato al cucciolo il colorante o la normale soluzione salina, posizionare i cuccioli su una piastra riscaldante a fluido circolante integrata (38 ° C) fino a quando i loro movimenti respiratori sono regolari. Dopo il completo recupero dall'anestesia, riunire i cuccioli con la diga.

5. Caratterizzazione dell'erogazione itI

1. Dopo ITI, eutanasia dei cuccioli di ratto somministrando un'anestesia eccessiva (ketamina 100 mg / kg e xilazina 10 mg / kg) / tiopentone seguita da dissanguamento in un momento appropriato dopo la somministrazione. L'eutanasia è stata eseguita come parte dell'esperimento per raccogliere il tessuto polmonare per dimostrare l'efficacia.
2. Fissare il cucciolo di ratto eutanasizzato su un pannello di dissezione e pulire il torace e l'addome con alcol etilico al 70%.
3. Per valutare la distribuzione del colorante in tutto il polmone, rimuovere i polmoni dall'animale utilizzando una tecnica sterile e visualizzare i polmoni come appropriato per l'imaging (Figura 4A, B).

Risultati

L'instillazione del blu di Evans ha rivelato una distribuzione multifocale del colorante che coinvolge tutti i lobi polmonari (Figura 4A,B). Il nostro risultato, come mostrato nella Figura 4, dimostra l'efficacia della distribuzione a tutti i lobi. La foto viene scattata immediatamente dopo l'ITI del colorante nella trachea. L'efficacia al 100% è stata raggiunta instillando il colorante nella trachea seguita dalla sua diffusione in tutti i lobi...

Discussione

L'instillazione intratracheale è un metodo eccellente che offre diversi vantaggi rispetto ai metodi esistenti per gli interventi sulle malattie respiratorie e lo sviluppo di modelli di malattia. È un metodo rapido e con esperienza, può essere eseguito con una velocità media di 2-3 minuti per animale. Le considerazioni chiave per un'intubazione di successo sono la corretta sedazione dell'animale, il suo corretto posizionamento, in particolare la testa, così come l'accurata profondità di posizionamento / dimensione d...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Evans Blue dye	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	314-13-6	Confirmation of drug administration into lungs
Ketamine Hydrochloride	Hospira. Inc, Lake Forest, IL, USA	Dispensed from Animal care facility	For sedation
Operating Otoscope	Welch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, USA	21770- 3.5V	For visualization of vocal cords
Otoscope Rechargeable Handle	Welch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, USA	71050-C
Pipette tip (Gel loading)	Fisherbrand	02-707-139	Administering the drug
Platform for restraining (inclined plane)	Animal care facility	Dispensed from Animal care facility	Wired roof of mice cage can be used
3M Micropore Surgical White Paper (sticking tape)	3M, St. Paul, MN, USA	1530-2
Luer Lock SyringeSyringes (1 ml)	BD Franklin Lakes, NJ , USA	NBD2515	Administering the drug
Xylazine	Hospira. Inc, Lake Forest, IL, USA		For sedation