زرع داخل القلب من هيدروجيلات هيدروجيل القابلة للحقن MSC التحميل بعد احتشاء عضلة القلب في نموذج مورين

Summary

وقد برز العلاج القائم على الخلايا الجذعية كاستراتيجية فعالة لإصلاح أنسجة القلب المصابة بعد احتشاء عضلة القلب. نحن نقدم الأمثل في تطبيق vivo لزرع الخلايا الجذعية باستخدام هيدروجيلات الجيلاتين التي هي قادرة على أن تكون الأنزيمية عبر الارتباط.

Abstract

واحدة من القضايا الرئيسية التي تواجه العلاجات الحالية للخلايا الجذعية القلبية لمنع فشل القلب بعد الأنف هو انخفاض معدلات الاحتفاظ والبقاء على قيد الحياة من الخلايا المزروعة داخل عضلة القلب المصابة، والحد من فعاليتها العلاجية. في الآونة الأخيرة ، اكتسب استخدام المواد الحيوية السقالات الاهتمام لتحسين وتعظيم العلاج بالخلايا الجذعية. الهدف من هذا البروتوكول هو إدخال تقنية بسيطة ومباشرة لزرع الخلايا الجذعية النخاعية النخاعية المشتقة من نخاع العظم (MSCs) باستخدام هيدروكسيفينيل هيدروجيل (GH) هيدروجيل. الهيدروجيل مواتية كمنصة تسليم الخلايا لتطبيقات هندسة الأنسجة القلبية بسبب قدرتها على أن تكون مشتركة مرتبطة في الموقع وارتفاع التوافق الحيوي. نقدم طريقة بسيطة لاصطناق هيدروجيلات GH تحميل MSC (MSC / hydrogels) وتقييم بقائها وانتشارها في ثلاثي الأبعاد (3D) في الثقافة المختبرية. بالإضافة إلى ذلك ، نبرهن على تقنية لزراعة MSC / hydrogels داخل القلب في الفئران ، واصفين إجراءً جراحيًا للحث على احتشاء عضلة القلب (MI) عبر ربط الشريان التاجي السفلي (LAD) الخلفي وزرع MSC / hydrogels اللاحقة.

Introduction

وقد برز العلاج بالخلايا الجذعية القلبية كمقاربة محتملة لإصلاح عضلة القلب وتجديد^1,2. على الرغم من النتائج الإيجابية الأخيرة في النماذج الحيوانية والتجارب السريرية، فإن تطبيق العلاج القائم على الخلايا الجذعية لإصلاح عضلة القلب محدود بسبب انخفاض الاحتفاظ بالخلايا المحقونة وسوء بقائها على قيد الحياة في أنسجة القلب المُفرَّجة^3،4. ونتيجة لذلك، استخدام هندسة الأنسجة القائمة على الخلايا، بما في ذلك المواد الحيوية عن طريق الحقن⁵، بقع القلب⁶، والأوراق الخلوية⁷، وقد درست بشكل مكثف لتحسين الاحتفاظ بالخلايا والتكامل داخل عضلة القلب المضيف.

من بين مختلف النهج المحتملة لإصلاح أنسجة القلب الهندسة الحيوية، والهيدروجين القابلة للحقن جنبا إلى جنب مع أنواع الخلايا المناسبة، مثل الخلايا الجذعية mesenchymal (MSCs)، والخلايا الجذعية الجنينية (ESCs)، والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs)، هي خيار جذاب لتسليم الخلايا بفعالية في المناطق عضلة القلب^8،9. الجيلاتين، وهو بوليمر طبيعي معروف، يمكن استخدامه كمصفوفة قابلة للحقن بسبب قدرتها البيولوجية الكبيرة، والتحلل الحيوي الكبير، وانخفاض المناعة بالمقارنة مع مجموعة واسعة من المواد الحيوية المستخدمة في التطبيقات الطبية الحيوية. على الرغم من أن منصات حقن الجيلاتين القائمة لديها إمكانات كبيرة, لا تزال تطبيقها في الجسم الحي محدودة على أساس صلابة الميكانيكية المنخفضة وسهولة التحلل في البيئة الفسيولوجية.

للتغلب على هذه القيود، تم اقتراح تصميم رواية وبسيطة من الهيدروجيلات القائم على الجيلاتين تتكون من حمض البرروبيونيك هيدروكسي فينيل لتطبيقات في الجسم الحي. يمكن أن تكون الدعامات اليليباتية-هيدروكسيفينيل بروبيونيك (GH) مترافقات عبر مرتبطة في الموقع في وجود إنزيم، بيروكسيديز الفجل (HRP)، وتغليف في وقت لاحق مختلف الأدوية، الجزيئات الحيوية، أو الخلايا داخل الهيدروجيل، مما يشير إلى إمكانات كبيرة في تطبيقات هندسة الأنسجة^{10،11،13،14}. وبالإضافة إلى ذلك، قمنا مؤخرا بالتحقيق في الآثار العلاجية للHGH الهيدروجيل التي تحتوي على MSCs مغلفة وأظهرت استخدامها في إصلاح القلب الناجح وتجديد بعد MI في نموذج مورين¹⁵. في هذا البروتوكول، نحن وصف تقنية بسيطة للتغليف وفي المختبر ثلاثي الأبعاد (3D) انتشار MSCs داخل الهيدروجيلات GH. كما نقدم إجراءً جراحيًا مصممًا لتوليد نموذج murine MI عن طريق ربط الشريان التاجي وزراعة القلب داخل القلب من الهيدروجيل GH الذي يتم تحميله MSC في القلب المُهذب.

Protocol

وقد تم توفير جميع إجراءات البحث عن الحيوانات وفقا لقانون رعاية الحيوانات المختبرية، ودليل رعاية واستخدام المختبرات، والمبادئ التوجيهية والسياسات المتعلقة بتجارب القوارض التي قدمتها اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في كلية الطب التابعة للجامعة الكاثوليكية في كوريا.

1- إعداد الـ MSCs والجيلاتين الهيدروجيلات القابلة للحقن

1. ثقافة MSCs في طبق ثقافة 100 مم في 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂. عندما يصل نمو MSCs إلى 80٪ من الالتقاء، اغسل الطبق مرتين مع DPBS وأضف 1 مل من التربسين البديل عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
   ملاحظة: تم عزل MSCs من نخاع العظام مورين بعد الإجراءات التقليدية¹⁶، المستزرعة في متوسط النسر المعدل (DMEM) في دولبيككو (DMEM) التي تحتوي على مصل الأبقار الجنينية بنسبة 10٪ (FBS) و 1٪ مضاد حيوي −محلول مضاد للوميكوليك ، وتستخدم بين الممر 7\u20129 لهذه الدراسة.
2. إضافة 9 مل من الثقافة المتوسطة والطرد المركزي في 500 × ز لمدة 3 دقائق. بعد ذلك ، تجاهل الماثر الناتج ، resuspend الخلايا في 1 مل من برنامج تلفزيوني ، والحفاظ على تعليق الخلية على الجليد.
3. تمييع 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 10 ميكرولتر من الأزرق Trypan والحصول على تركيز الخلية باستخدام عداد الخلايا الآلي.
4. إعادة بناء ونقل MSCs إلى أنبوب 1 مل في كثافة 1 × 10⁷ خلايا / مل.
5. إعداد 6.25 wt٪ من محلول غ مترافق في برنامج تلفزيوني وفصل في 2 قارورة. بعد ذلك، اخلطي حلول GH مع إما 6 ميكروغرام/مل من الـ HRP (حل GH A) أو 0.07 wt٪ من H₂O₂ (GH الحل B).
   ملاحظة: إعداد الجيلاتين هيدروكسيفينيل بروبيونيك حمض (GH) conjugates وفقا للبروتوكولات المنشورة^12،15.
   1. الحفاظ على نسبة 9:1 الحجمي من GH حل conjugate لHHP (GH حل A) و GH حل اقتران H₂O₂ (GH الحل B)، على التوالي.
6. قبل خلط MSCs مع GH الحل A، طرد مركزي لفترة وجيزة تعليق الخلية في 1000 × ز وpirate بعناية عظمى الناتجة. في وقت لاحق، مزيج بيليه تحتوي على MSCs مع GH الحل A.

2. في الموقع MSC التحميل وثلاثية الأبعاد في الثقافة في المختبر

1. تحميل GH الحل A (التي تحتوي على MSCs) و GH الحل B في جانبي حقنة مزدوجة. لوحة 300 ميكرولتر من حلول GH المدمجة مع MSCs بكثافة نهائية تبلغ 5 × 10⁶ خلايا/مل على شريحة غرفة ذات ثمانية بئر.
2. بعد تشكيل هيدروجيل في الموقع وتغليف MSC اللاحقة عبر الربط عبر الأنزيمية، إضافة 700 ميكرولتر من DMEM تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ مضاد حيوي-حل مضاد للعمول.
3. احتضان الشريحة عند 37 درجة مئوية و5٪ CO₂ واستبدال الوسط ثقافة كل 2\u20123 أيام.

3. تأكيد انتشار في المختبر والبقاء من MSCs داخل الهيدروجيلات GH

1. لتحديد جدوى MSCs مثقف 3D داخل هيدروجيلس GH، استخدم خلية حية / ميتة تلطيخ المقايسة بعد وقت الحضانة المحددة سلفا.
2. بعد حضانة MSCs مغلفة في هيدروجيلس GH لمدة 3، 5، 7 أو 14 يوما، التعرق المتوسطة وغسل البئر مرتين مع برنامج تلفزيوني.
3. إعداد حل تلطيخ يحتوي على 5 ميكرولتر من الكالسين AM و 20 ميكرولتر من الإتهيديوم هومديمر-1 (EthD-1) في 10 مل من DPBS.
4. إضافة 200 μL من حل تلطيخ إلى البئر واحتضان لمدة 30 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
5. التعرق حل تلطيخ وغسل البئر مرتين مع برنامج تلفزيوني.
6. قم بفصل الغرفة بعناية عن الشريحة ووضع غطاء كامل على الهيدروجيلات GH. استخدم مجهرًا مجهريًا لتصور درجة الانتشار والتغيرات المورفولوجية لثنائيات MSCs المغلفة.
   ملاحظة: تم الحصول على صور الفلورسنت تحت التكبير 200x وصورت في الإثارة / الانبعاثات الطول الموجي من 470/540 نانومتر للكالسين و516/607 نانومتر لEthD-1.

4. التعريفي احتشاء عضلة القلب في الفئران

1. تخدير الذكور 7 أسابيع من العمر C57BL/6 الفئران (20\u201222 غرام) مع حقن داخل الصفتون من خليط من Zoletil (30 ملغ / كجم) وRompun (10 ملغ / كغ) في المالحة.
2. قبل الجراحة، إزالة الصدر الماوس باستخدام كريم إزالة الشعر وتعقيم الجلد مع اليود.
3. ضع الماوس على طاولة التشغيل و intubate عن طريق إدخال قسطرة في القصبة الهوائية لتوفير الأكسجين التكميلي عن طريق التهوية الميكانيكية.
4. قطع بلطف من خلال الجلد باستخدام مقص الجراحية ومن ثم اختراق العضلات الوربية بواسطة مقص صغير. فصل الأضلاع اليسرى 2 و 3 باستخدام خياطة الحرير 5-0 للحفاظ على تجويف الصدر المفتوح.
5. ligate بعناية في اليسار الأمامي تنازلي (LAD) الشريان التاجي باستخدام حامل إبرة مع 8-0 البولي بروبلين خياطة وقطع خياطة باستخدام الكهربائي.
6. مراقبة تغير اللون الفوري في الجدار البطيني الأيسر الأمامي.

5. زرع داخل الرحم من هيدروجيلس GH تحميل MSC

1. بعد الحث على احتشاء عضلة القلب من قبل ربط LAD، حقن 10 ميكرولتر من حلول GH MSC التحميل في نقطتين مختلفتين في المنطقة الحدودية في المزارع (المجموع: 2 × 10⁵ MSCs/20 ميكرولتر) باستخدام حقنة مزدوجة مجهزة بإبرة 26G.
   1. باتباع نفس الإجراء الموضح في الخطوة 1، قم بإعداد ونقل حلول GH التي تحمل MSC إلى حقنة مزدوجة.
      ملاحظة: لتقييم engraftment من هيدروجيل GH تحميل MSC داخل المنطقة الزراعية، MSCs وCONS الاقتران تم مسبقا المسمى مع PHK26 وisothiocyanate الفلوريسين (FITC)، على التوالي.
2. استعادة تجويف الصدر المفتوحة وإغلاق العضلات والجلد باستخدام 5-0 الغرز.
   ملاحظة: قبل إغلاق الصدر، قم بإزالة الهواء باستخدام حقنة قسطرة.
3. قم بإزالة أنبوب القصبة الهوائية ووضع الماوس في قفص تحت مصباح الأشعة تحت الحمراء أثناء التعافي.
4. للانسهاة بعد الجراحة، تُعطى حقن كيتوبروفين تحت الجلد (5 ملغم/كغم يومياً) بحد أدنى 72 ساعة. يجب مراقبة جميع الفئران عن كثب لفترة مناسبة لضمان الشفاء السليم بعد العمليات الجراحية وكذلك علاج الألم الكافي.

6- تخطيط صدى القلب

1. بعد أربعة أسابيع من الزرع، في البداية تخدير الماوس مع isoflurane 5٪ ثم ضبط تركيز isoflurane إلى 1٪.
2. إزالة الصدر باستخدام كريم إزالة الشعر ووضع الماوس على وسادة التدفئة. تطبيق هلام محول الموجات فوق الصوتية على الصدر.
3. الحصول على ثنائي الأبعاد محاور قصيرة الباراسترالي وجهات النظر وسجل M-وضع تتبع على مستوى العضلات الحليمية.
   ملاحظة: ضع محول صفيف خطي (7\u201215 ميغاهرتز) في الخط الباراسترالي الأيسر وعرض الهياكل التشريحية.
4. قياس الخطوط المقابلة لـ LVAW و LVID و LVPW للحصول على سمك جدار القلب ، وبعد الغرفة ، وتقصير جزئي.
   ملاحظة: قارن وظيفة القلب بما في ذلك كسر الطرد (EF)، وتقصير الكسور (FS)، وحجم نهاية الانقباضي (ESV) على مستوى العضلات الحليمية لضمان التقييم السليم في نفس الموقع التشريحي.

7. التقييم الهستولوجي

1. في الوقت المحدد سلفا بعد زرع هيدروجيل GH تحميل MSC في القلب المعاجم، والقتل الرحيم الفأر في غرفة CO₂ وجمع القلب للتحليل النسيجي¹⁵.
2. للهماتوسلين ويوسين (H & E) وماسون ثلاثية اللون (MT) تلطيخ, إصلاح أنسجة القلب تشريح في 4٪ شبهformaldehyde (PFA) وتضمين في البارافين. المقبل، وقطع كتل القلب البارافين جزءا لا يتجزأ من 4 ميكرومتر المقاطع المسلسل باستخدام microtome وصمة عار المقاطع مع وصمة عار طن متري وفقا للبروتوكولات القياسية¹⁷.
3. الحصول على الصور على ماسح الشرائح في التكبير 20x وحساب حجم المزارع لمجموعات العلاج.
   حجم الإحفار (٪) = إجمالي محيط المزارع / إجمالي محيط LV x 100
4. حساب كلا المحيطين قياس طول خط الوسط. بالنسبة لضاحية خط الوسط LV، قم بقياس أطوال الخط المركزي بين الأسطح البطانية والإيبلاردي. بالنسبة لضواط خط الوسط ، قم بقياس أطوال الإحتلال بما في ذلك أكثر من 50٪ من سمك عضلة القلب¹⁸كله .
   ملاحظة: تم إجراء كافة تحليلات الصور باستخدام برنامج ImageJ.
5. قياس سمك الجدار من ندبة في مستويات العضلات الحليمة.
6. حساب جزء من منطقة الكولاجين.
   منطقة الكولاجين (٪) = المساحة الإجمالية للتليف الخلالي/منطقة myocyte × 100

النتائج

ومن أجل تسليم MSCs بفعالية إلى عضلة القلب المُهدَّد، استُخدمت في هذا البروتوكول كبسولات هيدروجيلات قابلة للربط عبرية قابلة للربط في الموقع موصوفة في الشكل 1. قبل زرع الجسم الحي ، تم تأكيد انتشار وبقاء MSCs في هيدروجيلس GH بواسطة 3D في المختبر الحي / الخلية الميتة التي تلطيخ المقا...

Discussion

حقن هيدروجيلس GH لديها إمكانات كبيرة في التطبيقات في الجسم الحي بسبب قدرتها على دمج متجانسة العوامل العلاجية المتنوعة في الموقع. وعلاوة على ذلك، يمكن التلاعب بسهولة بخواصها الفيزيائية والبيوكيميائية استنادا إلى المتطلبات التي تعتمد على الأمراض. في هذا الصدد، وقد اقترح هيدروجيلس عن طريق ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4 % paraformaldehyde (PFA)	Intron	IBS-BP031-2
5-0 silk suture	AILEE	SK534
8-0 polypropylene suture	ETHICON	M8732H
8-well chamber slide	Nunc LAB-TEK	154534
Angiocath Plus (22GA) catheter	BD Angiocath Plus	REF382423
Antibiotic-antimyocotic	Gibco	15240-062
Centrifuge	GYROGEN	1582MGR
Confocal microscope	Zeiss	LSM 510
Cover slipe	MARIENFELD	101242
Deluxe High Temperature Cautery kit	Bovie	QTY1
DMEM	Gibco	11995-065
DPBS	Gibco	14040-133
Dual-syringe
EOSIN	SIGMA-ALDRICH	HT110116
Ethanol	EMSURE	K49350783 739
FBS	Gibco	16000-044
Fechtner conjunctiva forceps titanium	WORLD PRECISISON INSTRUMENTS	WP1820
Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC)	SIGMA-ALDRICH	F7250
Forcep	HEBU	HB0458
Hair removal cream	Ildong Pharmaceutical
Heating pad	Stoelting	50300	Homeothermic Blanket System
		50301	Replacement Heating Pad for 50300 (10 X 12.5cm)
Hematoxylin	SIGMA-ALDRICH	HHS80
Horseradish peroxide (HRP; 250-330 U/mg)	SIGMA-ALDRICH	P8375
Hydrogen peroxide (H2O2; 30 wt % in H2O)	SIGMA-ALDRICH	216763
Iodine	Green Pharmaceutical
LIVE/DEAD cell staining kit	Thermo Fisher	R37601
Mechanical ventilator	Harvard Apparatus
Micro centrifuge	HANIL	Micro 12
Micro needle holder	KASCO	37-1452
Micro scissor	HEBU	HB7381
Microscope	OLYMPUS	SZ61
MT staining kit	SIGMA-ALDRICH	HT1079-1SET	Weigert’s iron hematoxylin solution
		HT15-1KT	Trichrome Stain (Masson) Kit
Paraffin	LK LABKOREA	H06-660-107
PBS buffer	Gibco	10010-023
PHK26 staining kit	SIGMA-ALDRICH	MINI26
Slide scanner	Leica	SCN400
Surgical scissor	HEBU	HB7454
Surgical tape	3M micopore	1530-1
Tissue cassette	Scilab Korea	Cas3003
Transducer gel	SUNGHEUNG	SH102
Trout-Barraquer needle holder curved	KASCO	50-3710c
Ultrasound system	Philips	Affiniti 50
Xylene	JUNSEI	25175-0430