Murine Modelinde Miyokard İnfarktüsünden Sonra MSC Yüklemeli Enjekte Edilebilir Hidrojellerin intramiyokardiyal Transplantasyonu

Özet

Kök hücre bazlı tedavi, miyokard enfarktüsünden sonra yaralı kalp dokularını onarmak için etkili bir strateji olarak ortaya çıkmıştır. Enzmatik olarak çapraz bağlanabilen jelatin hidrojelleri kullanarak kök hücre nakli için en uygun in vivo uygulamayı sağlıyoruz.

Özet

Postinfarkt kalp yetmezliğini önlemek için mevcut kardiyak kök hücre tedavilerinin karşılaştığı en önemli sorunlardan biri, yaralı miyokard içindeki nakledilen hücrelerin düşük tutma ve sağkalım oranlarıdır ve terapötik etkinliklerini sınırlar. Son zamanlarda, kök hücre tedavisini geliştirmek ve en üst düzeye çıkarmak için iskele biyomalzemelerinin kullanımı dikkat çekmektedir. Bu protokolün amacı, enjekte edilebilir hidroksifenil propiyonik asit (GH) hidrojelleri kullanarak kemik iliği türevi mezenkimal kök hücreleri (MSC' ler) nakletmek için basit ve basit bir teknik sunmaktır; hidrojeller, kardiyak doku mühendisliği uygulamaları için bir hücre dağıtım platformu olarak elverişlidir, çünkü çapraz in situ ve yüksek biyouyumluluk yeteneğine sahiptir. MSC yüklemeli GH hidrojellerini (MSC/hidrojeller) imal etmek ve hayatta kalmalarını ve çoğalmalarını üç boyutlu (3D) in vitro kültürde değerlendirmek için basit bir yöntem sunuyoruz. Ek olarak, farelerde MSC/hidrojellerin intramiyokardiyal nakli için bir teknik göstererek, sol ön alçalma (LAD) koroner arter ligasyonu ve daha sonra MSC/hidrojel nakli yoluyla miyokard infarktüsüne (MI) indükleyen cerrahi bir prosedürü tarif ediyoruz.

Giriş

Kardiyak kök hücre tedavisi miyokard onarımı ve yenilenmesi için potansiyel bir yaklaşım olarak ortaya çıkmıştır^1,2. Hayvan modellerinde ve klinik çalışmalarda son olumlu sonuçlara rağmen, miyokard onarımı için kök hücre bazlı tedavi uygulaması, enfarktüslü kalp dokularında enjekte edilen hücrelerin düşük tutulması ve zayıf hayatta kalması nedeniyle sınırlıdır^3,4. Sonuç olarak, enjekte edilebilir biyomalzemeler⁵, kardiyak yamalar⁶ve hücre sayfaları⁷dahil olmak üzere hücre bazlı doku mühendisliğinin kullanımı, konak miyokard içinde hücre tutulmasını ve entegrasyonunu iyileştirmek için yoğun bir şekilde çalışılmıştır.

Biyomühendislik kalp dokusu onarımına yönelik çeşitli potansiyel yaklaşımlar arasında, mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), embriyonik kök hücreler (ESC'ler) ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) gibi uygun hücre tipleriyle birlikte enjekte edilebilir hidrojeller, hücreleri miyokard bölgelerine etkili bir şekilde ulaştırmak için cazip bir seçenektir^8,9. Tanınmış bir doğal polimer olan jelatin, biyomedikal uygulamalarda kullanılan çok çeşitli biyomalzemelerle karşılaştırıldığında, büyük biyouyumluluğu, önemli ölçüde biyobozunurluğu ve azaltılmış immünojenikliği nedeniyle enjekte edilebilir bir matris olarak kullanılabilir. Jelatin bazlı enjekte edilebilir platformlar büyük bir potansiyele sahip olsa da, düşük mekanik sertliklerine ve fizyolojik ortamdaki kolay bozulmalarına bağlı olarak in vivo uygulanabilirlikleri sınırlı kalır.

Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, in vivo uygulamalar için hidroksifenil propiyonik asitten oluşan jelatin bazlı hidrojellerin yeni ve basit bir tasarımı önerilmiştir. Jelatin-hidroksifenil propiyonik asit (GH) konjugeleri bir enzim, yaban turpu peroksidaz (HRP) varlığında yerinde çapraz bağlanabilir ve daha sonra çeşitli ilaçları, biyomolekülleri veya hidrojel içindeki hücreleri kapsülleyebilir, bu da doku mühendisliği uygulamalarında büyük potansiyel olduğunu düşündürür^10,11,12,^13,14. Ek olarak, son zamanlarda kapsüllenmiş MSC'ler içeren GH hidrojellerinin terapötik etkilerini araştırdık ve bir murine modelinde MI'den sonra başarılı kardiyak onarım ve rejenerasyonda kullanımlarını gösterdik¹⁵. Bu protokolde, GH hidrojelleri içindeki MSC'lerin kapsüllenmesi ve in vitro üç boyutlu (3D) çoğalması için basit bir teknik açıklıyoruz. Ayrıca koroner arter ligasyonu ve MSC yüklemeli GH hidrojellerinin enfarktüslü kalbe intramiyokardiyal nakli yoluyla bir murine MI modeli oluşturmak için tasarlanmış cerrahi bir prosedür sunuyoruz.

Protokol

Tüm hayvan araştırma prosedürleri, Kore Katolik Üniversitesi Tıp Fakültesi'nde Laboratuvar Hayvanları Refahı Yasası, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından sağlanan Kemirgen Deneyleri Kılavuz ve Politikalarına uygun olarak sağlanmıştır.

1. MSC'lerin ve enjekte edilebilir jelatin hidrojellerinin hazırlanması

1. 37 °C ve %5 CO_2'de100 mm'lik bir kültür çanasında KÜLTÜR MSC'leri. MSC büyümesi% 80 izdihama ulaştığında, kabı DPBS ile iki kez yıkayın ve 3 dakika boyunca 37 °C'de 1 mL tripsin ikame ekleyin.
   NOT: MSC'ler geleneksel prosedürlerden sonra murine kemik iliğinden izole edildi¹⁶, Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortası'nda (DMEM) %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 antibiyotik−antimykotik çözelti içeren kültürlendi ve bu çalışma için 7\u20129 geçişi arasında kullanıldı.
2. 3 dakika boyunca 500 x g'da 9 mL kültür ortamı ve santrifüj ekleyin. Daha sonra, elde edilen süpernatant atın, hücreleri 1 mL PBS'de yeniden biriktirin ve hücre süspansiyonunun buzda tutulmasını sağlayın.
3. 10 μL hücre süspansiyonu 10 μL Trypan mavisi ile seyreltin ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre konsantrasyonu elde edin.
4. MSC'leri 1 x 10⁷ hücre/mL yoğunlukta 1 mL'lik bir tüpe yeniden aktarın ve aktarın.
5. PBS'de GH konjuge çözeltisinin %6,25'ini hazırlayın ve 2 şişeye ayırın. Ardından, GH çözümlerini 6 μg/mL HRP (GH çözeltisi A) veya H 2 O_{2'nin (GH}çözümü B)_%0,07 wt ile karıştırın.
   NOT: Yayınlanan protokollere göre jelatin-hidroksifenil propiyonik asit (GH) konjugeleri hazırlayın^12,15.
   1. Sırasıyla GH konjuge çözümünün HRP (GH çözümü A) ve GH konjuge çözümünün H 2 O_2'ye(GH çözümü B) 9:1 hacimsel oranını koruyun.
6. MSC'leri GH çözeltisi A ile karıştırmadan önce, hücre süspansiyonu 1.000 x g'da kısa bir süre santrifüj edin ve elde eden süpernatantı dikkatlice emiş edin. Daha sonra, MSC'leri içeren peleti GH çözeltisi A ile karıştırın.

2. Yerinde MSC yükleme ve üç boyutlu in vitro kültürü

1. GH çözümü A 'yı (MSC'leri içeren) ve GH çözümü B'yi çift şırıngın her iki tarafına yükleyin. Sekiz kuyulu bir hazne slaydı üzerine 5 x 10 6 hücre/mL'lik son yoğunlukta MSC'lerle kombine^GH çözeltilerinin plakası 300 μL.
2. In situ hidrojel oluşumu ve daha sonra enzymatic çapraz bağlama ile MSC kapsüllemeden sonra, % 10 FBS ve% 1 antibiyotik−antimycotic çözelti içeren 700 μL DMEM ekleyin.
3. Slaydı 37 °C ve %5 CO_2'de kuluçkaya yatırın ve kültür ortamını her 2\u20123 günde bir değiştirin.

3. GH hidrojelleri içindeki MSC'lerin in vitro çoğalması ve hayatta kalmasının onaylanması

1. GH hidrojelleri içinde 3D kültürlü MSC'lerin uygulanabilirliğini belirlemek için, önceden belirlenmiş kuluçka süresinden sonra canlı / ölü hücre boyama tahlilini kullanın.
2. GH hidrojellerinde kapsüllenmiş MSC'lerin 3, 5, 7 veya 14 gün boyunca inkübasyonundan sonra, ortamı aspire edin ve kuyuyu PBS ile iki kez yıkayın.
3. 10 mL DPBS'de 5 μL kalsein ve 20 μL ethidyum homodimer-1 (EthD-1) içeren bir boyama çözeltisi hazırlayın.
4. Kuyuya 200 μL boyama çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika kuluçkaya yatırın.
5. Boyama çözeltisini epire edin ve kuyuyu PBS ile iki kez yıkayın.
6. Odayı slayttan dikkatlice ayırın ve GH hidrojellerinin üzerine tam bir kapak yerleştirin. Kapsüllenmiş MSC'lerin çoğalma derecesini ve morfolojik değişikliklerini görselleştirmek için konfokal mikroskopi kullanın.
   NOT: Floresan görüntüler 200x büyütme altında elde edildi ve calcein için 470/540 nm ve EthD-1 için 516/607 nm uyarılma / emisyon dalga boylarında görüntülendi.

4. Farelerde miyokard enfarktüsü indüksiyonu

1. 7 haftalık erkek C57BL/6 fareleri (20\u201222 g) salin içinde Zoletil (30 mg/kg) ve Rompun (10 mg/kg) karışımının intraperitoneal enjeksiyonu ile uyuşturun.
2. Ameliyattan önce, epilasyon kremi kullanarak fare göğsünü depilate edin ve cildi iyotla sterilize edin.
3. Fareyi bir ameliyat masasına yerleştirin ve mekanik havalandırma yoluyla ek oksijen sağlamak için nefes borusuna bir kateter takarak entübe edin.
4. Cerrahi makas kullanarak cildi hafifçe kesin ve ardından mikro makasla interkostal kaslara nüfuz edin. Açık göğüs boşluğunu korumak için 5-0 ipek dikiş kullanarak 2. ve 3. sol kaburgaları ayırın.
5. Sol ön alçalı (LAD) koroner arteri 8-0'lık bir iğne tutucu kullanarak dikkatlice lige edin polipropilen dikiş ve elektrokoter kullanarak dikişi kesin.
6. Ön sol ventrikül duvarında hemen bir renk değişikliği gözlemleyin.

5. MSC yüklü GH hidrojellerinin intramiyokardiyal nakli

1. LAD ligasyonu ile miyokard enfarktüsüne indükledikten sonra, 26G iğne ile donatılmış çift şırınga kullanarak enfarktüs sınır bölgesindeki iki farklı noktaya (toplam: 2 x^{10 5} MSC/20 μL) 10 μL MSC yüklemeli GH çözeltisi enjekte edin.
   1. Adım 1'de açıklanan prosedürü izleyerek, MSC yüklemeli GH çözümlerini hazırlayın ve çift şırınna aktarın.
      NOT: MSC yüklemeli GH hidrojellerinin enfarktüs alanı içindeki entrikalarını değerlendirmek için, MSC'ler ve GH konjugeleri sırasıyla PHK26 ve floresan izotiyosiyanat (FITC) ile önceden etiketlenmiştir.
2. Açılan göğüs boşluğunu geri yükleyin ve 5-0 dikiş kullanarak kasları ve cildi kapatın.
   NOT: Göğüs kapatmadan önce kateter şırınnası kullanarak havayı çıkarın.
3. Trakeal tüpü çıkarın ve kurtarma sırasında fareyi kızılötesi lambanın altındaki bir kafese yerleştirin.
4. Ameliyat sonrası analjezi için, en az 72 saat boyunca deri altı Ketoprofen enjeksiyonları (günde 5 mg / kg) verin. Tüm fareler, yeterli ağrı tedavisinin yanı sıra cerrahi işlemlerden sonra uygun iyileşmeyi sağlamak için uygun bir süre için yakından izlenmelidir.

6. Ekokardiyografi

1. Transplantasyondan dört hafta sonra, başlangıçta fareyi% 5 izofluran ile uyuşturun ve daha sonra izofluran konsantrasyonu% 1'e ayarlayın.
2. Epilasyon kremi kullanarak göğsünü depilate edin ve fareyi bir ısıtma yastığına yerleştirin. Göğüse ultrason dönüştürücü jel uygulayın.
3. İki boyutlu parasternal kısa eksen görünümleri elde edin ve papiller kas seviyesinde M modu izlemeleri kaydedin.
   NOT: Sol parasternal çizgiye doğrusal bir dizi dönüştürücü (7\u201215 MHz) yerleştirin ve anatomik yapıları görüntüleyin.
4. Kardiyak duvar kalınlığı, oda boyutu ve fraksiyonel kısaltma elde etmek için LVAW, LVID ve LVPW için karşılık gelen çizgileri ölçün.
   NOT: Aynı anatomik konumda doğru değerlendirmeyi sağlamak için papiller kas seviyesinde ejeksiyon fraksiyonu (EF), fraksiyonel kısaltma (FS) ve son sistolik hacim (ESV) dahil olmak üzere kardiyak fonksiyonu karşılaştırın.

7. Histolojik değerlendirme

1. MSC yüklemeli GH hidrojellerinin enfarktüslü kalbe naklinden sonra önceden belirlenmiş zamanda, fareyi bir CO₂ odasında ötenazi yapın ve histolojik analiz için kalbi toplayın¹⁵.
2. Hematoksilin ve eozin (H&E) ve Masson'un üç renkli (MT) lekeleri için, parçalanmış kalp dokularını% 4 paraformaldehitte (PFA) sabitlenin ve parafin içine gömün. Daha sonra, parafin gömülü kalp bloklarını bir mikrotom kullanarak 4 μm seri bölümlere kesin ve bölümleri standart protokollere göre MT lekesi ile lekele¹⁷.
3. Slayt tarayıcısında 20x büyütme ile görüntü alın ve tedavi gruplarının enfarktüs boyutunu hesaplayın.
   Enfarktüs boyutu (%) = toplam enfarktüs çevresi / toplam LV çevresi x 100
4. Orta çizgi uzunluğu ölçümüne göre her iki çevreyi de hesaplayın. LV orta hat çevreleri için endokardiyal ve epikardiyal yüzeyler arasındaki merkez çizgisi uzunluklarını ölçün. Orta hat enfarktüs çevreleri için, miyokard^18'intüm kalınlığının% 50'sinden fazlası dahil olmak üzere enfarktüs uzunluklarını ölçün.
   NOT: Tüm görüntü analizleri ImageJ yazılımı kullanılarak gerçek gerçekleştirildi.
5. Papiller kas seviyelerinde yara izinin duvar kalınlığını ölçün.
6. Kollajen alanının fraksiyonunu hesaplayın.
   Kollajen alanı (%) = interstisyel fibrozis/miyosit alanının toplam alanı x 100

Sonuçlar

MsC'leri enfarktüslü miyokardlara etkili bir şekilde ulaştırmak için, Şekil 1'de açıklanan MSC yüklemeli yerinde çapraz bağlanabilir hidrojeller bu protokolde kullanılmıştır. In vivo transplantasyondan önce, GH hidrojellerinde MSC'lerin çoğalması ve hayatta kalması 3D in vitro canlı / ölü hücre boyama tahlili ile doğrulandı (canlı: yeşil; ölü: kırmızı). Şekil 2'degösterildiği gibi, temsili görüntüler GH hidrojelleri içind...

Tartışmalar

Enjekte edilebilir GH hidrojelleri, çeşitli terapötik ajanları yerinde homojen bir şekilde dahil etme yetenekleri nedeniyle in vivo uygulamalar için büyük bir potansiyele sahiptir. Ayrıca, fiziksel ve biyokimyasal özellikleri hastalığa bağlı gereksinimlere göre kolayca manipüle edilebilir. Bu bakımdan, enjekte edilebilir hidrojeller, yaralı kalp^19,20'dezayıf sağkalım ve hücre tutulması (yani, 24 saat içinde % 10) tarafından engellenen mev...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
4 % paraformaldehyde (PFA)	Intron	IBS-BP031-2
5-0 silk suture	AILEE	SK534
8-0 polypropylene suture	ETHICON	M8732H
8-well chamber slide	Nunc LAB-TEK	154534
Angiocath Plus (22GA) catheter	BD Angiocath Plus	REF382423
Antibiotic-antimyocotic	Gibco	15240-062
Centrifuge	GYROGEN	1582MGR
Confocal microscope	Zeiss	LSM 510
Cover slipe	MARIENFELD	101242
Deluxe High Temperature Cautery kit	Bovie	QTY1
DMEM	Gibco	11995-065
DPBS	Gibco	14040-133
Dual-syringe
EOSIN	SIGMA-ALDRICH	HT110116
Ethanol	EMSURE	K49350783 739
FBS	Gibco	16000-044
Fechtner conjunctiva forceps titanium	WORLD PRECISISON INSTRUMENTS	WP1820
Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC)	SIGMA-ALDRICH	F7250
Forcep	HEBU	HB0458
Hair removal cream	Ildong Pharmaceutical
Heating pad	Stoelting	50300	Homeothermic Blanket System
		50301	Replacement Heating Pad for 50300 (10 X 12.5cm)
Hematoxylin	SIGMA-ALDRICH	HHS80
Horseradish peroxide (HRP; 250-330 U/mg)	SIGMA-ALDRICH	P8375
Hydrogen peroxide (H2O2; 30 wt % in H2O)	SIGMA-ALDRICH	216763
Iodine	Green Pharmaceutical
LIVE/DEAD cell staining kit	Thermo Fisher	R37601
Mechanical ventilator	Harvard Apparatus
Micro centrifuge	HANIL	Micro 12
Micro needle holder	KASCO	37-1452
Micro scissor	HEBU	HB7381
Microscope	OLYMPUS	SZ61
MT staining kit	SIGMA-ALDRICH	HT1079-1SET	Weigert’s iron hematoxylin solution
		HT15-1KT	Trichrome Stain (Masson) Kit
Paraffin	LK LABKOREA	H06-660-107
PBS buffer	Gibco	10010-023
PHK26 staining kit	SIGMA-ALDRICH	MINI26
Slide scanner	Leica	SCN400
Surgical scissor	HEBU	HB7454
Surgical tape	3M micopore	1530-1
Tissue cassette	Scilab Korea	Cas3003
Transducer gel	SUNGHEUNG	SH102
Trout-Barraquer needle holder curved	KASCO	50-3710c
Ultrasound system	Philips	Affiniti 50
Xylene	JUNSEI	25175-0430