Murine 模型心肌梗塞后 MSC 加载注射水凝胶的心内移植

摘要

干细胞治疗已成为修复心肌梗塞后受伤的心脏组织的有效策略。我们使用明胶水凝胶为干细胞移植提供最佳的体内应用，这些水凝胶能够酶交叉连接。

摘要

目前用于预防后发性心力衰竭的心脏干细胞疗法面临的主要问题之一是受伤心肌内移植细胞的保留率和存活率低，限制了其治疗效果。最近，脚手架生物材料的使用已引起人们的关注，以改善和最大限度地提高干细胞治疗。该协议的目的是引入一种简单明了的技术，使用注射羟基丙酸（GH）水凝胶移植骨髓源性间质干细胞（MSCs）:水凝胶是心脏组织工程应用的细胞输送平台，具有现场交叉连接和高生物相容性的能力。我们提出了一个简单的方法来制造MSC加载GH水凝胶（MSC/水凝胶），并评估其生存和增殖的三维（3D）体外培养。此外，我们演示了在小鼠体内移植MSC/水凝胶的技术，描述了通过左前下降（LAD）冠状动脉结结和随后的MSC/水凝胶移植诱导心肌梗塞（MI）的外科手术。

引言

心脏干细胞治疗已成为心肌修复和再生^{的潜在方法1，2。}尽管最近动物模型和临床试验取得了积极成果，但由于在梗塞的心脏组织^3、4的留存率低和注射细胞存活率低^，干细胞治疗心肌修复的应用有限。因此，对细胞组织工程的使用进行了深入的研究，包括注射生物材料^5、心脏贴片⁶和细胞片^7，以改善宿主心肌内的细胞保留和整合。

在生物工程心脏组织修复的各种潜在方法中，注射式水凝胶与适当的细胞类型相结合，如间质干细胞（MSCs）、胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs），是有效将细胞输送到心肌区域^8、9的一个有吸引力的选择。明胶是一种众所周知的天然聚合物，与用于生物医学应用的各种生物材料相比，由于其巨大的生物相容性、可显著的生物降解性和免疫原性降低，可以用作注射基质。虽然基于明胶的注射平台有很大的潜力，但其在体内的适用性仍然有限，因为其机械刚度低，在生理环境中容易降解。

为了克服这些局限性，提出了一种由羟基丙酸组成的明胶基水凝胶的全新简单设计，用于体内应用。明胶-羟基丙烯酸（GH）结合物可在酶、马萝卜过氧化酶（HRP）存在的情况下就地交叉连接，随后在水凝胶内封装各种药物、生物分子或细胞，表明在组织工程应用^{10、11、12、13、14}方面具有巨大潜力。此外，我们最近调查了含有封装MSC的GH水凝胶的治疗效果，并证明它们在MI后在Murine模型¹⁵中成功用于心脏修复和再生。在此协议中，我们描述了在 GH 水凝胶内封装和体外三维 （3D） 增殖的简单技术。我们还引入了一个外科手术，旨在通过冠状动脉结结和MSC加载GH水凝胶的心内移植到梗塞的心脏产生一个Murine MI模型。

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研究方案

所有动物研究程序都是根据《实验室动物福利法》、《实验室动物照料和使用指南》以及韩国天主教大学医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）提供的啮齿动物实验指南和政策提供的。

1. MSC 和注射明胶水凝胶的准备

1. 100 毫米培养皿中的培养 MSC，37 °C 和 5% CO₂。当 MSC 增长达到 80% 的汇合时，用 DPBS 洗两次菜，并在 37 °C 下加入 1 mL 的三蛋白替代剂，持续 3 分钟。
   注:MSC在常规程序¹⁶后从骨髓中分离出，在杜尔贝科的改良鹰介质（DMEM）中培养，含有10%的胎儿牛血清（FBS）和1%的抗生素-抗霉菌溶液，并在7-u20129通道之间用于这项研究。
2. 加入9 mL的文化介质和离心机在500 x g 3分钟。接下来，丢弃由此产生的超常剂，在PBS的1mL中重新悬浮细胞，并在冰上保持细胞悬浮。
3. 用 10 μL 的 Trypan 蓝色稀释 10 μL 的细胞悬架，并使用自动电池计数器获得细胞浓度。
4. 以 1 x 10⁷ 细胞/mL 的密度将 MSC 重新悬浮并传输到 1 mL 管中。
5. 在PBS中准备 6.25 wt% 的 GH 结合解决方案，并分离成 2 瓶。接下来，将 GH 解决方案与 HRP （GH 解决方案 A） 的 6 微克/mL 或 H₂O 2（GH 溶液 B） 的 0.07 wt% 混合。
   注:根据已公布的协议^12、15，准备明胶-羟基丙烯酸^（GH）结合。
   1. 将GH结合溶液与HRP（GH溶液A）的容积比保持在9:1，将GH结合溶液分别保持在H 2 O_2（GH溶液B）。
6. 在将 MSC 与 GH 溶液 A 混合之前，将电池悬架短暂离心至 1，000 x g， 并小心地吸气由此产生的超纳坦。随后，将含有MSC的颗粒与GH溶液A混合。

2. 原位MSC加载和三维体外培养

1. 将GH溶液A（包含MSC）和GH溶液B加载到双注射器的两侧。板 300μL 的组合 GH 解决方案与 MSC 在最终密度为 5 x 10⁶ 细胞/mL 到八井室幻灯片。
2. 通过酶交叉连接进行原位水凝胶形成和随后的MSC封装后，加入含有10%FBS和1%抗生素-抗霉溶液的700μL DMEM。
3. 在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵化幻灯片，每 2+u20123 天更换一次培养介质。

3. 确认GH水凝胶内MSC的体外增殖和生存

1. 要确定 GH 水凝胶中 3D 培养的 MSC 的可行性，请在预定的潜伏时间后使用活/死细胞染色检测。
2. 在 GH 水凝胶中孵化封装的 MSC 3、5、7 或 14 天后，吸气介质，用 PBS 两次清洗油井。
3. 在 10 mL 的 DPBS 中准备含有 5 μL 钙蛋白 AM 和 20 μL 同质-1 （EthD-1） 的染色溶液。
4. 将 200μL 的染色溶液添加到井中，并在室温下在黑暗中孵育 30 分钟。
5. 吸气染色溶液，用PBS洗两次井。
6. 小心地将腔室与滑梯分开，并在 GH 水凝胶上放置一个完整的盖片。使用共生显微镜可视化封装 MSC 的增殖程度和形态变化。
   注:荧光图像是在 200 倍放大倍数下获得的，图像的激发/发射波长为 470/540 nm 用于钙素，EthD-1 获得 516/607 nm。

4. 小鼠心肌梗塞的诱导

1. 麻醉7周大的雄性C57BL/6小鼠（20+u201222g），在盐水中注射Zoletil（30毫克/千克）和龙朋（10毫克/千克）的混合物。
2. 手术前，使用脱毛霜去除小鼠胸部，用碘对皮肤进行消毒。
3. 将鼠标放在手术台上，通过将导管插入气管以通过机械通风提供补充氧气进行插管。
4. 用手术剪刀轻轻切开皮肤，然后用微剪刀穿透间切肌肉。使用 5-0 丝缝将第二根和第三根左肋分开，以保持胸腔开放。
5. 使用 8 - 0 的针架小心地解放左前下降 （LAD） 冠状动脉聚丙烯缝合，并使用电宫切割缝合。
6. 观察前左心室壁的即时颜色变化。

5. MSC装载GH水凝胶的心肌内移植

1. 在通过 LAD 结扎诱导心肌梗塞后，使用配备 26G 针头的双注射器将 10μL 的 MSC 加载 GH 溶液注入到梗塞边界区的两个不同点（总计:2 x^{10 5} MSC/20 μL）。
   1. 按照步骤 1 中描述的相同程序，准备并将 MSC 加载 GH 解决方案转移到双注射器中。
      注:为了评估在梗塞区域内雕刻的MSC装载GH水凝胶，MSC和GH结合体分别用PHK26和荧光异氰酸酯（FITC）预先标记。
2. 恢复开放的胸腔，并关闭肌肉和皮肤使用5-0缝合。
   注:在关闭胸部之前，使用导管注射器取出空气。
3. 取出气管，在恢复过程中将鼠标放在红外灯下的笼子里。
4. 对于术后镇痛，至少72小时进行皮下酮洛芬注射（每天5毫克/千克）。所有小鼠都应在适当时间受到密切监测，以确保手术后恢复良好，并进行适当的疼痛治疗。

6. 回声心动图

1. 移植后四周，先用5%的异氟化麻醉小鼠，然后将异氟浓度调整到1%。
2. 使用脱毛霜脱毛胸部，并将鼠标放在加热垫上。将超声波传感器凝胶涂在胸前。
3. 获取二维寄生短轴视图，并在肌水平记录 M 模式跟踪。
   注:将线性阵列传感器（7+u201215 MHz）放在左副星线中，查看解剖结构。
4. 测量LVAW、LVID和LVPW的相应线条，以获得心脏壁厚度、腔室尺寸和部分缩短。
   注:比较心脏功能，包括弹出分数（ EF ）、分数缩短（ FS ）和肌水平的末代收缩体积（ ESV ），以确保在同一解剖位置进行适当的评估。

7. 病理学评价

1. 在将MSC装载的GH水凝胶移植到梗塞的心脏后预定时间，在_CO2室中对小鼠实施安乐死，并收集心脏进行组织学分析^15。
2. 对于血氧素和欧辛（H&E）和马森的三叶虫（MT）染色，修复解剖的心脏组织在4%的甲醛（PFA），并嵌入石蜡。接下来，根据标准协议^17，将石蜡嵌入的心脏块切割成4个μm串行部分，并用微切除物和MT污渍染色。
3. 以 20 倍的放大率在幻灯片扫描仪上获取图像，并计算治疗组的梗死大小。
   梗死大小（%）=总梗塞周长/总LV周长x 100
4. 按中线长度测量计算两个周长。对于LV中线周长，测量心内膜和震中表面之间的中线长度。对于中线梗塞周长，测量梗塞的长度，包括超过50%的肌心¹⁸的整体厚度。
   注:所有图像分析都是使用 ImageJ 软件进行的。
5. 测量肌肉水平疤痕的壁厚度。
6. 计算胶原蛋白面积的分数。
   胶原蛋白面积 （%） = 间质纤维化/肌细胞面积总面积 x 100

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结果

为了有效地将 MSC 输送到梗死的心肌，本协议中使用了 图 1 中描述的 MSC 现场装载的可交叉链接水凝胶。在体内移植之前，GH水凝胶中MSC的增殖和存活通过3D体外活/死细胞染色检测（活:绿色;死:红色）证实。如图 2所示，具有代表性的图像显示了足够的 MSC 增殖，显示了 GH 水凝胶内的分支网络。此外，在第14天清楚地观察到MSC广泛的多细胞3D结构，表明GH?...

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讨论

可注射的GH水凝胶具有巨大的潜力，在体内应用，因为他们的能力，均匀地纳入不同的治疗剂就地。此外，它们的物理和生化特性很容易根据疾病依赖性要求进行操纵。在这方面，已建议注射水凝胶，以解决目前心脏干细胞治疗的主要局限性，阻碍不良生存和细胞保留（即+10%在24小时内移植后）在受伤的心脏^19，20。为了克服这一不良结果，本文所述的?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4 % paraformaldehyde (PFA)	Intron	IBS-BP031-2
5-0 silk suture	AILEE	SK534
8-0 polypropylene suture	ETHICON	M8732H
8-well chamber slide	Nunc LAB-TEK	154534
Angiocath Plus (22GA) catheter	BD Angiocath Plus	REF382423
Antibiotic-antimyocotic	Gibco	15240-062
Centrifuge	GYROGEN	1582MGR
Confocal microscope	Zeiss	LSM 510
Cover slipe	MARIENFELD	101242
Deluxe High Temperature Cautery kit	Bovie	QTY1
DMEM	Gibco	11995-065
DPBS	Gibco	14040-133
Dual-syringe
EOSIN	SIGMA-ALDRICH	HT110116
Ethanol	EMSURE	K49350783 739
FBS	Gibco	16000-044
Fechtner conjunctiva forceps titanium	WORLD PRECISISON INSTRUMENTS	WP1820
Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC)	SIGMA-ALDRICH	F7250
Forcep	HEBU	HB0458
Hair removal cream	Ildong Pharmaceutical
Heating pad	Stoelting	50300	Homeothermic Blanket System
		50301	Replacement Heating Pad for 50300 (10 X 12.5cm)
Hematoxylin	SIGMA-ALDRICH	HHS80
Horseradish peroxide (HRP; 250-330 U/mg)	SIGMA-ALDRICH	P8375
Hydrogen peroxide (H2O2; 30 wt % in H2O)	SIGMA-ALDRICH	216763
Iodine	Green Pharmaceutical
LIVE/DEAD cell staining kit	Thermo Fisher	R37601
Mechanical ventilator	Harvard Apparatus
Micro centrifuge	HANIL	Micro 12
Micro needle holder	KASCO	37-1452
Micro scissor	HEBU	HB7381
Microscope	OLYMPUS	SZ61
MT staining kit	SIGMA-ALDRICH	HT1079-1SET	Weigert’s iron hematoxylin solution
		HT15-1KT	Trichrome Stain (Masson) Kit
Paraffin	LK LABKOREA	H06-660-107
PBS buffer	Gibco	10010-023
PHK26 staining kit	SIGMA-ALDRICH	MINI26
Slide scanner	Leica	SCN400
Surgical scissor	HEBU	HB7454
Surgical tape	3M micopore	1530-1
Tissue cassette	Scilab Korea	Cas3003
Transducer gel	SUNGHEUNG	SH102
Trout-Barraquer needle holder curved	KASCO	50-3710c
Ultrasound system	Philips	Affiniti 50
Xylene	JUNSEI	25175-0430