Transplante intramial de hidrogéis injetáveis de carregamento de MSC após infarto do miocárdio em um modelo murino

Resumo

A terapia baseada em células-tronco emergiu como uma estratégia eficiente para reparar tecidos cardíacos feridos após o infarto do miocárdio. Fornecemos uma aplicação in vivo ideal para transplante de células-tronco usando hidrogéis de gelatina que são capazes de ser enzimaticamente intercessos.

Resumo

Um dos principais problemas enfrentados pelas atuais terapias de células-tronco cardíacas para prevenir a insuficiência cardíaca pós-infarto é a baixa retenção e as taxas de sobrevivência das células transplantadas dentro do miocárdio ferido, limitando sua eficácia terapêutica. Recentemente, o uso de biomateriais de andaimes ganhou atenção para melhorar e maximizar a terapia com células-tronco. O objetivo deste protocolo é introduzir uma técnica simples e simples para transplantar células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea (MSCs) utilizando hidrogéis de ácido propínico hidroxifenil injetável (GH); os hidrogéis são favoráveis como uma plataforma de entrega de células para aplicações de engenharia de tecidos cardíacos devido à sua capacidade de estar intercingo in situ e alta biocompatibilidade. Apresentamos um método simples para fabricar hidrogéis GH de carregamento de MSC (MSC/hidrogéis) e avaliar sua sobrevivência e proliferação na cultura in vitro tridimensional (3D). Além disso, demonstramos uma técnica para transplante intramialárdio de MSC/hidrogéis em camundongos, descrevendo um procedimento cirúrgico para induzir o infarto do miocárdio (MI) através da ligadura da artéria coronária descendente anterior (LAD) e posterior transplante de MSC/hidrogéis.

Introdução

A terapia com células-tronco cardíacas emergiu como uma abordagem potencial para reparação e regeneração do miocárdio^1,2. Apesar dos resultados positivos recentes em modelos animais e ensaios clínicos, a aplicação de terapia baseada em células-tronco para reparação do miocárdio é limitada devido à baixa retenção e má sobrevivência das células injetadas nos tecidos cardíacos infartados^3,4. Como resultado, o uso de engenharia de tecidos baseados em células, incluindo biomateriais injetáveis⁵, patches cardíacos⁶e folhas de células⁷, tem sido intensamente estudado para melhorar a retenção e integração celular dentro do miocárdio hospedeiro.

Entre as várias abordagens potenciais para a reparação de tecidos cardíacos bioengenharia, hidrânis injetáveis combinados com tipos de células apropriadas, como células-tronco mesenquimais (MSCs), células-tronco embrionárias (ESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), são uma opção atraente para efetivamente entregar células nas regiões miocárdias^8,9. A gelatina, um polímero natural bem conhecido, pode ser usada como uma matriz injetável devido à sua grande biocompatibilidade, biodegradabilidade considerável e imunogenicidade reduzida quando comparada com uma ampla gama de biomaterias usados em aplicações biomédicas. Embora as plataformas injetáveis à base de gelatina tenham grande potencial, sua aplicabilidade in vivo permanece limitada com base em sua baixa rigidez mecânica e fácil degradabilidade no ambiente fisiológico.

Para superar essas limitações, foi proposto um design novo e simples de hidrogéis à base de gelatina, compostos por ácido propiônico hidroxifenil. Os conjugados de ácido propiônico gelatino-hidroxifenil (GH) podem ser interligados in situ na presença de uma enzima, peroxidase de rabanete (HRP) e, posteriormente, encapsular várias drogas, biomoléculas ou células dentro do hidrogel, sugerindo grande potencial nas aplicações de engenharia de tecidos^{10,11,12,13,14}. Além disso, recentemente investigamos os efeitos terapêuticos dos hidrogéis GH contendo MSCs encapsulados e demonstramos seu uso em reparo e regeneração cardíaca bem-sucedido após a MI em um modelo murino¹⁵. Neste protocolo, descrevemos uma técnica simples para o encapsulamento e a proliferação tridimensional in vitro (3D) de MSCs dentro de hidrogéis GH. Também introduzimos um procedimento cirúrgico projetado para gerar um modelo mi murina através da ligadura da artéria coronária e transplante intramocárdio de hidrogéis GH que carregam MSC no coração infartado.

Protocolo

Todos os procedimentos de pesquisa animal foram fornecidos de acordo com a Lei de Bem-Estar dos Animais de Laboratório, o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e as Diretrizes e Políticas para Experimentos de Roedores fornecidas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) na Faculdade de Medicina da Universidade Católica da Coreia.

1. Preparação de MSCs e hidrogéis de gelatina injetáveis

1. MSCs de cultura em um prato de cultura de 100 mm a 37 °C e 5% DE CO₂. Quando o crescimento das MSCs atingir 80% de confluência, lave o prato duas vezes com DPBS e adicione 1 mL de trippsina-substituto a 37 °C por 3 min.
   NOTA: Os MSCs foram isolados da medula óssea murina após os procedimentos convencionais¹⁶, cultivados no Médio De Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% de solução antimíctica antibiótico,e utilizado entre a passagem 7\u20129 para este estudo.
2. Adicione 9 mL de cultura média e centrífuga a 500 x g por 3 min. Em seguida, descarte o supernaente resultante, resuspenque as células em 1 mL de PBS, e mantenha a suspensão celular no gelo.
3. Diluir 10 μL de suspensão celular com 10 μL de azul Trypan e obter a concentração celular usando um contador celular automatizado.
4. Resuspend e transfira MSCs para um tubo de 1 mL a uma densidade de 1 x 10⁷ células/mL.
5. Prepare uma solução conjugada de 6,25 wt% de GH em PBS e separe em 2 frascos. Em seguida, misture as soluções GH com 6 μg/mL de HRP (solução GH A) ou 0,07 wt% de H₂O₂ (solução GH B).
   NOTA: Prepare os conjugados de ácido propiônico gelatin-hidroxifenil (GH) de acordo com os protocolos publicados^12,15.
   1. Mantenha uma razão volumosa de 9:1 da solução conjugada GH para hrp (solução GH solução A) e solução conjugada GH para H₂O₂ (solução B DE GH), respectivamente.
6. Antes de misturar os MSCs com a solução GH A, centrifufique brevemente a suspensão celular a 1.000 x g e aspire cuidadosamente o supernanato resultante. Posteriormente, misture a pelota contendo MSCs com a solução GH A.

2. In situ MSC-loading e tridimensional cultura in vitro

1. Solução de carga GH A (contendo MSCs) e solução GH B em ambos os lados de uma seringa dupla. Placa 300 μL das soluções GH combinadas com MSCs a uma densidade final de 5 x 10⁶ células/mL em um slide de câmara de oito poços.
2. Após a formação de hidrogel in situ e posterior encapsulamento msc via ligação cruzada enzimática, adicione 700 μL de DMEM contendo 10% de FBS e 1% de solução antimicomolítica.
3. Incubar o slide a 37 °C e 5% de CO₂ e substituir o meio de cultura a cada 2\u20123 dias.

3. Confirmação da proliferação in vitro e sobrevivência de MSCs dentro de hidrogéis GH

1. Para determinar a viabilidade de MSCs cultivados em 3D dentro de hidrogéis GH, use um ensaio de coloração de células vivas/mortas após o tempo de incubação predeterminado.
2. Após a incubação dos MSCs encapsulados em hidrogéis GH por 3, 5, 7 ou 14 dias, aspire o médio e lave o poço duas vezes com PBS.
3. Prepare uma solução de coloração contendo 5 μL de calcein AM e 20 μL de ethidium homodimer-1 (EthD-1) em 10 mL de DPBS.
4. Adicione 200 μL da solução de coloração ao poço e incubar por 30 minutos no escuro à temperatura ambiente.
5. Aspire a solução de coloração e lave o poço duas vezes com PBS.
6. Separe cuidadosamente a câmara do slide e coloque uma tampa completa sobre os hidrogéis GH. Use uma microscopia confocal para visualizar o grau de proliferação e alterações morfológicas dos MSCs encapsulados.
   NOTA: As imagens fluorescentes foram adquiridas sob ampliação de 200x e imagens nos comprimentos de onda de excitação/emissão de 470/540 nm para calcein e 516/607 nm para EthD-1.

4. Indução do infarto do miocárdio em camundongos

1. Anestesize camundongos C57BL/6 masculinos de 7 semanas de idade (20\u201222 g) com injeção intraperitoneal de uma mistura de Zoletil (30 mg/kg) e Rompun (10 mg/kg) em soro fisiológico.
2. Antes da cirurgia, depilar o peito do rato usando creme de depilação e esterilizar a pele com iodo.
3. Coloque o mouse sobre uma mesa de operação e entubar inserindo um cateter na traqueia para fornecer oxigênio suplementar através de ventilação mecânica.
4. Corte suavemente a pele usando uma tesoura cirúrgica e, em seguida, penetre os músculos intercostais por micro tesoura. Separe as costelas esquerdas 2ª e 3ª usando uma sutura de seda 5-0 para manter uma cavidade torácica aberta.
5. Ligar cuidadosamente a artéria coronária anterior esquerda (LAD) usando um suporte de agulha com um 8-0 sutura de polipropileno e corte a sutura usando eletrocauteria.
6. Observe uma mudança de cor imediata na parede ventricular esquerda anterior.

5. Transplante intramyocárdio de hidrogéis GH de carregamento de MSC

1. Depois de induzir o infarto do miocárdio por ligadura LAD, injete 10 μL de soluções GH de carregamento MSC em dois pontos diferentes na zona de fronteira infarto (total: 2 x 10⁵ MSCs/20 μL) usando uma seringa dupla equipada com uma agulha de 26G.
   1. Seguindo o mesmo procedimento descrito na Etapa 1, prepare e transfira as soluções GH de carregamento de MSC em uma seringa dupla.
      NOTA: Para avaliar o engrafamento dos hidrogéis GH de carregamento de MSC dentro da área infarto, os MSCs e os conjugados GH foram pré-rotulados com PHK26 e isoticianato de fluoresceína (FITC), respectivamente.
2. Restaure a cavidade torácica aberta e feche os músculos e a pele usando suturas 5-0.
   NOTA: Antes do fechamento do peito, remova o ar usando uma seringa de cateter.
3. Remova o tubo traqueal e coloque o mouse em uma gaiola sob uma lâmpada infravermelha durante a recuperação.
4. Para analgesia pós-operatória, administre injeções subcutâneas de Cetoprofeno (5 mg/kg por dia) por um mínimo de 72 h. Todos os camundongos devem ser monitorados de perto por um tempo adequado para garantir a recuperação adequada após os procedimentos cirúrgicos, bem como o tratamento adequado da dor.

6. Ecocardiografia

1. Quatro semanas após o transplante, inicialmente anestesiar o camundongo com 5% de isoflurane e, em seguida, ajustar a concentração de isoflurane para 1%.
2. Despito o baú usando creme de depilação e coloque o mouse em uma almofada de aquecimento. Aplique gel transdutor de ultrassom no peito.
3. Adquira vistas bidimensionais de eixo curto e registre traçados no modo M ao nível do músculo papilar.
   NOTA: Coloque um transdutor de matriz linear (7\u201215 MHz) na linha parasternal esquerda e visualize as estruturas anatômicas.
4. Meça linhas correspondentes para LVAW, LVID e LVPW para obter espessura da parede cardíaca, dimensão da câmara e encurtamento fracionado.
   NOTA: Compare a função cardíaca, incluindo a fração de ejeção (EF), encurtamento fracionado (FS) e volume sistólico final (ESV) ao nível do músculo papilar para garantir a avaliação adequada no mesmo local anatômico.

7. Avaliação histológica

1. No tempo predeterminado após o transplante de hidrogéis GH carregados de MSC no coração infartado, eutanize o rato em uma câmara de CO₂ e colete o coração para análise histológica¹⁵.
2. Para hematoxilina e eosina (H&E) e coloração tricrática (MT) de Masson, fixar os tecidos cardíacos dissecados em 4% de paraformaldeído (PFA) e incorporar em parafina. Em seguida, corte os blocos cardíacos incorporados à parafina em seções seriais de 4 μm usando um microtome e colora as seções com mancha DE MT de acordo com os protocolos padrão¹⁷.
3. Adquira imagens em um scanner de slides a 20x de ampliação e calcule o tamanho do infarto dos grupos de tratamento.
   Tamanho do infarto (%) = circunferência total infarto / circunferência total de LV x 100
4. Calcule ambas as circunferências por medição de comprimento médio. Para circunferências da linha média LV, meça os comprimentos da linha central entre as superfícies endocárdia e epicoardial. Para circunferências infartos midline, meça os comprimentos do infarto, incluindo mais de 50 % de toda a espessura do miocárdio¹⁸.
   NOTA: Todas as análises de imagem foram realizadas por meio do software ImageJ.
5. Meça a espessura da parede da cicatriz nos níveis musculares papilares.
6. Calcule a fração da área de colágeno.
   Área de colágeno (%) = área total de fibrose intersticial/área de miócito x 100

Resultados

Para efetivamente fornecer MSCs ao miocárdio infartado, foram utilizados neste protocolo o carregamento de MSC em hidrogéis transfronteiriços descritos na Figura 1. Antes do transplante in vivo, a proliferação e sobrevivência de MSCs em hidrogéis GH foram confirmadas por um ensaio de coloração de células mortas/in vitro 3D (ao vivo: verde; morto: vermelho). Como mostrado na Figura 2,imagens representativas exibiram proliferação suficiente de MSCs, mo...

Discussão

Os hidrogéis GH injetáveis têm grande potencial para aplicações in vivo devido à sua capacidade de incorporar homogêneo agentes terapêuticos in situ. Além disso, suas propriedades físicas e bioquímicas podem ser facilmente manipuladas com base em requisitos dependentes de doenças. Nesse sentido, hidrogéis injetáveis têm sido propostos para abordar as principais limitações na atual terapia de células-tronco cardíacas dificultadas pela má sobrevida e retenção celular (ou seja, < 10% dentro de 24h apó...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4 % paraformaldehyde (PFA)	Intron	IBS-BP031-2
5-0 silk suture	AILEE	SK534
8-0 polypropylene suture	ETHICON	M8732H
8-well chamber slide	Nunc LAB-TEK	154534
Angiocath Plus (22GA) catheter	BD Angiocath Plus	REF382423
Antibiotic-antimyocotic	Gibco	15240-062
Centrifuge	GYROGEN	1582MGR
Confocal microscope	Zeiss	LSM 510
Cover slipe	MARIENFELD	101242
Deluxe High Temperature Cautery kit	Bovie	QTY1
DMEM	Gibco	11995-065
DPBS	Gibco	14040-133
Dual-syringe
EOSIN	SIGMA-ALDRICH	HT110116
Ethanol	EMSURE	K49350783 739
FBS	Gibco	16000-044
Fechtner conjunctiva forceps titanium	WORLD PRECISISON INSTRUMENTS	WP1820
Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC)	SIGMA-ALDRICH	F7250
Forcep	HEBU	HB0458
Hair removal cream	Ildong Pharmaceutical
Heating pad	Stoelting	50300	Homeothermic Blanket System
		50301	Replacement Heating Pad for 50300 (10 X 12.5cm)
Hematoxylin	SIGMA-ALDRICH	HHS80
Horseradish peroxide (HRP; 250-330 U/mg)	SIGMA-ALDRICH	P8375
Hydrogen peroxide (H2O2; 30 wt % in H2O)	SIGMA-ALDRICH	216763
Iodine	Green Pharmaceutical
LIVE/DEAD cell staining kit	Thermo Fisher	R37601
Mechanical ventilator	Harvard Apparatus
Micro centrifuge	HANIL	Micro 12
Micro needle holder	KASCO	37-1452
Micro scissor	HEBU	HB7381
Microscope	OLYMPUS	SZ61
MT staining kit	SIGMA-ALDRICH	HT1079-1SET	Weigert’s iron hematoxylin solution
		HT15-1KT	Trichrome Stain (Masson) Kit
Paraffin	LK LABKOREA	H06-660-107
PBS buffer	Gibco	10010-023
PHK26 staining kit	SIGMA-ALDRICH	MINI26
Slide scanner	Leica	SCN400
Surgical scissor	HEBU	HB7454
Surgical tape	3M micopore	1530-1
Tissue cassette	Scilab Korea	Cas3003
Transducer gel	SUNGHEUNG	SH102
Trout-Barraquer needle holder curved	KASCO	50-3710c
Ultrasound system	Philips	Affiniti 50
Xylene	JUNSEI	25175-0430