Trasplante intramiocardio de hidrogeles inyectables msc-loading después de infarto de miocardio en un modelo murino

Resumen

La terapia basada en células madre ha surgido como una estrategia eficiente para reparar los tejidos cardíacos lesionados después del infarto de miocardio. Proporcionamos una aplicación in vivo óptima para el trasplante de células madre utilizando hidrogeles de gelatina que son capaces de ser enzimáticamente cruzados.

Resumen

Uno de los principales problemas a los que se enfrentan las terapias actuales de células madre cardíacas para prevenir la insuficiencia cardíaca postinfarto es la baja retención y las tasas de supervivencia de las células trasplantadas dentro del miocardio lesionado, limitando su eficacia terapéutica. Recientemente, el uso de biomateriales de andamios ha ganado atención para mejorar y maximizar la terapia con células madre. El objetivo de este protocolo es introducir una técnica simple y directa para trasplantar células madre mesenquimales derivadas de médula ósea (MSC) utilizando hidrogeles de ácido propionico hidroxifenilo inyectable (GH); los hidrogeles son favorables como plataforma de administración celular para aplicaciones de ingeniería de tejidos cardíacos debido a su capacidad de estar intercontrados in situ y alta biocompatibilidad. Presentamos un método sencillo para fabricar hidrogeles GH (MSC/hidrogeles) que cargan MSC y evaluar su supervivencia y proliferación en cultivo in vitro tridimensional (3D). Además, demostramos una técnica para el trasplante intramiocardial de MSC/hidrogeles en ratones, describiendo un procedimiento quirúrgico para inducir infarto de miocardio (MI) a través de ligadura arterial coronaria de descenso anterior (LAD) izquierda y posterior trasplante de MSC/hidrogeles.

Introducción

La terapia con células madre cardíacas ha surgido como un enfoque potencial para la reparación y regeneración de miocárdica^1,2. A pesar de los recientes resultados positivos en modelos animales y ensayos clínicos, la aplicación de terapia basada en células madre para la reparación de miocardio es limitada debido a la baja retención y la mala supervivencia de las células inyectadas en los tejidos cardíacos infartos^3,4. Como resultado, el uso de ingeniería de tejidos a base de células, incluyendo biomateriales inyectables^5,parches....

Protocolo

Todos los procedimientos de investigación animal se proporcionaron de conformidad con la Ley de Bienestar de los Animales de Laboratorio, la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y las Directrices y Políticas para experimentos de roedores proporcionadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en la Escuela de Medicina de la Universidad Católica de Corea.

1. Preparación de MSCs e hidrogeles de gelatina inyectables

1. Cultivo MSCs en un plato de cultivo de 100 mm a 37 °C y 5% CO₂. Cuando el crecimiento de los MSC alcance el 80% de confluencia, lave el plato dos veces con DPBS y agregu....

Resultados

Para entregar eficazmente los MSC al miocardio infarto, en este protocolo se utilizaron hidrogeles enlazables cruzados de carga MSC descritos en la Figura 1. Antes del trasplante in vivo, la proliferación y supervivencia de los MSC en los hidrogeles GH fueron confirmados por un ensayo de tinción de células vivas/muertas in vitro en 3D (en vivo: verde; muerto: rojo). Como se muestra en la Figura 2,las imágenes representativas mostraron suficiente proliferaci?.......

Discusión

Los hidrogeles GH inyectables tienen un gran potencial para aplicaciones in vivo debido a su capacidad para incorporar homogéneamente diversos agentes terapéuticos in situ. Además, sus propiedades físicas y bioquímicas se pueden manipular fácilmente en función de los requisitos dependientes de la enfermedad. En este sentido, se han propuesto hidrogeles inyectables para hacer frente a las principales limitaciones en la terapia actual de células madre cardíacas obstaculizadas por la mala supervivencia y retención.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4 % paraformaldehyde (PFA)	Intron	IBS-BP031-2
5-0 silk suture	AILEE	SK534
8-0 polypropylene suture	ETHICON	M8732H
8-well chamber slide	Nunc LAB-TEK	154534
Angiocath Plus (22GA) catheter	BD Angiocath Plus	REF382423
Antibiotic-antimyocotic	Gibco	15240-062
Centrifuge	GYROGEN	1582MGR
Confocal microscope	Zeiss	LSM 510
Cover slipe	MARIENFELD	101242
Deluxe High Temperature Cautery kit	Bovie	QTY1
DMEM	Gibco	11995-065
DPBS	Gibco	14040-133
Dual-syringe
EOSIN	SIGMA-ALDRICH	HT110116
Ethanol	EMSURE	K49350783 739
FBS	Gibco	16000-044
Fechtner conjunctiva forceps titanium	WORLD PRECISISON INSTRUMENTS	WP1820
Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC)	SIGMA-ALDRICH	F7250
Forcep	HEBU	HB0458
Hair removal cream	Ildong Pharmaceutical
Heating pad	Stoelting	50300	Homeothermic Blanket System
		50301	Replacement Heating Pad for 50300 (10 X 12.5cm)
Hematoxylin	SIGMA-ALDRICH	HHS80
Horseradish peroxide (HRP; 250-330 U/mg)	SIGMA-ALDRICH	P8375
Hydrogen peroxide (H2O2; 30 wt % in H2O)	SIGMA-ALDRICH	216763
Iodine	Green Pharmaceutical
LIVE/DEAD cell staining kit	Thermo Fisher	R37601
Mechanical ventilator	Harvard Apparatus
Micro centrifuge	HANIL	Micro 12
Micro needle holder	KASCO	37-1452
Micro scissor	HEBU	HB7381
Microscope	OLYMPUS	SZ61
MT staining kit	SIGMA-ALDRICH	HT1079-1SET	Weigert’s iron hematoxylin solution
		HT15-1KT	Trichrome Stain (Masson) Kit
Paraffin	LK LABKOREA	H06-660-107
PBS buffer	Gibco	10010-023
PHK26 staining kit	SIGMA-ALDRICH	MINI26
Slide scanner	Leica	SCN400
Surgical scissor	HEBU	HB7454
Surgical tape	3M micopore	1530-1
Tissue cassette	Scilab Korea	Cas3003
Transducer gel	SUNGHEUNG	SH102
Trout-Barraquer needle holder curved	KASCO	50-3710c
Ultrasound system	Philips	Affiniti 50
Xylene	JUNSEI	25175-0430