Trapianto intramiocardico di idrogel iniettabili a carico MSC dopo infarto del miocardio in un modello murino

Riepilogo

La terapia a base di cellule staminali è emersa come una strategia efficiente per riparare i tessuti cardiaci feriti dopo l'infarto del miocardio. Forniamo un'applicazione in vivo ottimale per il trapianto di cellule staminali utilizzando idrogel di gelatina che possono essere enzimaticamente incrociati.

Abstract

Uno dei principali problemi che devono affrontare le attuali terapie con cellule staminali cardiache per prevenire l'insufficienza cardiaca postinfarct è il basso tasso di ritenzione e sopravvivenza delle cellule trapiantate all'interno del miocardio ferito, limitandone l'efficacia terapeutica. Recentemente, l'uso di biomateriali impalcatura ha attirato l'attenzione per migliorare e massimizzare la terapia con cellule staminali. L'obiettivo di questo protocollo è introdurre una tecnica semplice e diretta per trapiantare le cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo (MSC) utilizzando idrogel di acido propionico idrossifenile iniettabile (GH); gli idrogel sono favorevoli come piattaforma di somministrazione cellulare per applicazioni di ingegneria dei tessuti cardiaci a causa della loro capacità di essere collegati in situ incrociati e dell'elevata biocompatibilità. Presentiamo un metodo semplice per fabbricare idrogel GH a caricamento MSC (MSC/idrogel) e valutarne la sopravvivenza e la proliferazione in coltura tridimensionale (3D) in vitro. Inoltre, dimostriamo una tecnica per il trapianto intramiocardico di MSC / idrogel nei topi, descrivendo una procedura chirurgica per indurre l'infarto miocardico (MI) tramite la legatura coronarica discendente anteriore sinistro (LAD) e il successivo trapianto MSC / idrogels.

Introduzione

La terapia con cellule staminali cardiache è emersa come un potenziale approccio per la riparazione e la rigenerazione del^{miocardio 1,2}. Nonostante i recenti risultati positivi nei modelli animali e negli studi clinici, l'applicazione della terapia a base di cellule staminali per la riparazione del miocardio è limitata a causa della bassa ritenzione e della scarsa sopravvivenza delle cellule iniettate nei tessuti cardiaci infarti^3,4. Di conseguenza, l'uso dell'ingegneria tissutale a base cellulare, compresi i biomateriali iniettabili^5,le chiazze cardiache⁶e i^{fogli cellulari 7,}è stato intensamente studiato per migliorare la ritenzione cellulare e l'integrazione all'interno del miocardio ospite.

Tra i vari approcci potenziali alla riparazione del tessuto cardiaco bioingegnerato, gli idrogel iniettabili combinati con tipi di cellule appropriati, come le cellule staminali mesenchimali (MCC), le cellule staminali embrionali (ESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte (IPSC), sono un'opzione interessante per fornire efficacemente le cellule nelle regioni del miocardio^8,9. La gelatina, un noto polimero naturale, può essere utilizzata come matrice iniettabile grazie alla sua grande biocompatibilità, alla notevole biodegradabilità e alla ridotta immunogenicità rispetto a una vasta gamma di biomateriali utilizzati in applicazioni biomediche. Sebbene le piattaforme iniettabili a base di gelatina abbiano un grande potenziale, la loro applicabilità in vivo rimane limitata in base alla loro bassa rigidità meccanica e alla facile degradabilità nell'ambiente fisiologico.

Per superare questi limiti, è stato proposto un nuovo e semplice design di idrogel a base di gelatina costituiti da acido propionico idrossifenile per applicazioni in vivo. I coniugati gelatino-idrossifenil propionico (GH) possono essere reticolati in situ in presenza di un enzima, la perossidasi di rafano (HRP), e successivamente incapsulare vari farmaci, biomolecole o cellule all'interno dell'idrogel, suggerendo un grande potenziale nelle applicazioni di ingegneria^{tissutale 10,11,12,13,14}. Inoltre, abbiamo recentemente studiato gli effetti terapeutici degli idrogel gh contenenti MSC incapsulati e dimostrato il loro uso nella riparazione e rigenerazione cardiaca di successo dopo l'MI in un modello murino¹⁵. In questo protocollo, descriviamo una semplice tecnica per l'incapsulamento e la proliferazione tridimensionale in vitro (3D) dei CCI all'interno degli idrogel GH. Introduciamo anche una procedura chirurgica progettata per generare un modello MI murino attraverso la legatura dell'arteria coronarica e il trapianto intramiocardico di idrogel GH a caricamento MSC nel cuore infarto.

Protocollo

Tutte le procedure di ricerca sugli animali sono state fornite in conformità con il Laboratory Animals Welfare Act, la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e le linee guida e le politiche per gli esperimenti sui roditori fornite dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) nella School of Medicine dell'Università Cattolica della Corea.

1. Preparazione di CSC e idrogel di gelatina iniettabili

1. CCI della cultura in un piatto da coltura da 100 mm a 37 °C e 5% CO₂. Quando la crescita degli MSC raggiunge l'80% di confluenza, lavare il piatto due volte con DPBS e aggiungere 1 mL di sostituto della tripsiderina a 37 °C per 3 min.
   NOTA: I CSC sono stati isolati dal midollo osseo murino seguendo^{le procedure convenzionali 16}, coltivati nel Mezzo dell'Aquila Modificata (DMEM) di Dulbecco contenenti il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di soluzione antibiotico-antimicotica, e utilizzati tra il passaggio 7\u20129 per questo studio.
2. Aggiungere 9 mL di mezzo di coltura e centrifuga a 500 x g per 3 min. Successivamente, scartare il supernatante risultante, rimescolare le cellule in 1 mL di PBS e mantenere la sospensione cellulare sul ghiaccio.
3. Diluire 10 μL di sospensione cellulare con 10 μL di blu Trypan e ottenere la concentrazione cellulare utilizzando un contatore di celle automatizzato.
4. Resuspend e trasferire i MBC su un tubo da 1 ml ad una densità di 1 x 10⁷ celle/ml.
5. Preparare un 6,25 wt% di soluzione coniugata GH in PBS e separare in 2 flaconcini. Quindi, mescolare le soluzioni GH con 6 μg/mL di HRP (soluzione GH A) o 0,07 wt% di H₂O_{2 (soluzione} GH B).
   NOTA: Preparare coniugati gelatina-idrossifenil propionico (GH) secondo i protocolli^{pubblicati 12,15}.
   1. Mantenere un rapporto volumetrico 9:1 di soluzione coniugata GH a soluzione coniugata HRP (GH soluzione A) e GH coniugata rispettivamente a H₂O_{2 (soluzione} GH B).
6. Prima di miscelare i CBC con la soluzione GH A, centrifugare brevemente la sospensione cellulare a 1.000 x g e aspirare con cura il supernatante risultante. Successivamente, mescolare il pellet contenente MSC con la soluzione GH A.

2. In situ MSC-loading e coltura tridimensionale in vitro

1. Caricare gh soluzione A (contenente MSC) e GH soluzione B su entrambi i lati di una doppia siringa. Piastra 300 μL delle soluzioni GH combinate con MBC ad una densità finale di 5 x 10⁶ celle/mL su uno scivolo a camera a otto poi.
2. Dopo la formazione di idrogel in situ e la successiva incapsulamento MSC tramite cross-linking enzimatico, aggiungere 700 μL di DMEM contenente il 10% di FBS e l'1% di soluzione antibiotico-antimicotica.
3. Incubare lo scivolo a 37 °C e 5% di CO₂ e sostituire il mezzo di coltura ogni 2\u20123 giorni.

3. Conferma della proliferazione in vitro e della sopravvivenza dei CG MSC all'interno degli idrogel gh

1. Per determinare la fattibilità dei CBC coltivati in 3D all'interno degli idrogel GH, utilizzare un saggio di colorazione delle cellule vive / morte dopo il tempo di incubazione predeterminato.
2. Dopo l'incubazione dei CBC incapsulati negli idrogel GH per 3, 5, 7 o 14 giorni, aspirare il mezzo e lavare il pozzo due volte con PBS.
3. Preparare una soluzione di colorazione contenente 5 μL di calceina AM e 20 μL di omodimero di etidio-1 (EthD-1) in 10 mL di DPBS.
4. Aggiungere 200 μL della soluzione di colorazione al pozzo e incubare per 30 minuti al buio a temperatura ambiente.
5. Aspirare la soluzione di colorazione e lavare il pozzo due volte con PBS.
6. Separare accuratamente la camera dallo scivolo e posizionare un coverslip completo sugli idrogel GH. Utilizzare una microscopia confocale per visualizzare il grado di proliferazione e i cambiamenti morfologici degli MSC incapsulati.
   NOTA: Le immagini fluorescenti sono state acquisite con ingrandimento inferiore a 200x e immagini alle lunghezze d'onda di eccitazione/emissione di 470/540 nm per la calceina e 516/607 nm per EthD-1.

4. Induzione dell'infarto del miocardio nei topi

1. Anestetizzare topi maschi C57BL/6 di 7 settimane (20\u201222 g) con iniezione intraperitoneale di una miscela di Zoletil (30 mg/kg) e Rompun (10 mg/kg) in soluzione salina.
2. Prima dell'intervento chirurgico, depilate il torace del topo usando la crema per la depilazione e sterilizzare la pelle con iodio.
3. Posizionare il mouse su un tavolo operatorio e intubare inserendo un catetere nella trachea per fornire ossigeno supplementare attraverso la ventilazione meccanica.
4. Tagliare delicatamente la pelle usando forbici chirurgiche e quindi penetrare nei muscoli intercostali con micro forbici. Separare la seconda e la terza costola sinistra usando una sutura di seta 5-0 per mantenere una cavità toracica aperta.
5. Legare con cura l'arteria coronarica discendente anteriore sinistro (LAD) utilizzando un portaaghi con un 8-0 sutura in polipropilene e tagliare la sutura usando l'elettrocauteria.
6. Osservare un cambiamento di colore immediato nella parete ventricolare sinistra anteriore.

5. Trapianto intramiocardico di idrogel GH a carico di MSC

1. Dopo aver indotto l'infarto del miocardio mediante legatura LAD, iniettare 10 μL di soluzioni GH a caricamento MSC in due punti diversi nella zona di confine infarto (totale: 2 x 10⁵ MSC/20 μL) utilizzando una doppia siringa dotata di un ago 26G.
   1. Seguendo la stessa procedura descritta nella fase 1, preparare e trasferire le soluzioni GH a caricamento MSC in una doppia siringa.
      NOTA: Per valutare l'innesto degli idrogel GH a carico di MSC all'interno dell'area infarcted, gli MSC e i coniugati GH sono stati preetichetti rispettivamente con PHK26 e isotiocianato di fluoresceina (FITC).
2. Ripristinare la cavità toracica aperta e chiudere i muscoli e la pelle usando 5-0 suture.
   NOTA: Prima della chiusura del torace, rimuovere l'aria usando una siringa catetere.
3. Rimuovere il tubo tracheale e posizionare il mouse in una gabbia sotto una lampada a infrarossi durante il recupero.
4. Per l'analgesia postoperatoria, somministrare iniezioni sottocutanee di Chetoprofene (5 mg/kg al giorno) per un minimo di 72 ore. Tutti i topi devono essere attentamente monitorati per un tempo appropriato per garantire un corretto recupero dopo le procedure chirurgiche e un adeguato trattamento del dolore.

6. Ecocardiografia

1. Quattro settimane dopo il trapianto, inizialmente anestetizza il topo con il 5% di isoflurane e quindi regola la concentrazione di isoflurane all'1%.
2. Depilate il petto usando la crema per la depilazione e posizionare il mouse su una pastiglia riscaldante. Applicare il gel trasduttore ad ultrasuoni sul petto.
3. Acquisire viste bidimensionali parasternali a basso asse e registrare tracciati in modalità M a livello del muscolo papillare.
   NOTA: Posizionare un trasduttore di array lineare (7\u201215 MHz) nella linea parasternale sinistra e visualizzare le strutture anatomiche.
4. Misurare le linee corrispondenti per LVAW, LVID e LVPW per ottenere lo spessore della parete cardiaca, la dimensione della camera e l'accorciamento frazionato.
   NOTA: Confrontare la funzione cardiaca tra cui la frazione di espulsione (EF), l'accorciamento frazionato (FS) e il volume estolico finale (ESV) a livello del muscolo papillare per garantire una corretta valutazione nella stessa posizione anatomica.

7. Valutazione istologica

1. Al momento predeterminato dopo il trapianto di idrogel GH a carico di MSC nel cuore infarto, eutanasiare il topo in una camera di CO₂ e raccogliere il cuore per l'analisi istologica¹⁵.
2. Per la colorazione tricromatica ed eosina (H&E) e tricromo (MT) di Masson, fissare i tessuti cardiaci sezionati in paraformaldeide (PFA) al 4% e incorporare nella paraffina. Successivamente, tagliare i blocchi cardiaci incorporati nella paraffina in sezioni seriali da 4 μm utilizzando un microtomo e macchiare le sezioni con macchia MT secondo i protocolli standard¹⁷.
3. Acquisire immagini su uno scanner di diapositive con ingrandimento 20x e calcolare la dimensione infaritta dei gruppi di trattamento.
   Dimensioni infarct (%) = circonferenza totale infarct / circonferenza totale LV x 100
4. Calcolare entrambe le circonferenze in base alla misurazione della lunghezza della linea mediana. Per le circonferenze della linea mediana LV, misurare le lunghezze dell'linea centrale tra le superfici endocardiale ed epicardiale. Per le circonferenze infariche della linea mediana, misurare le lunghezze di infarto, compreso più del 50 % dello spessore intero del miocardio¹⁸.
   NOTA: Tutte le analisi delle immagini sono state eseguite utilizzando il software ImageJ.
5. Misurare lo spessore della parete della cicatrice ai livelli muscolari papillari.
6. Calcola la frazione dell'area del collagene.
   Area di collagene (%) = superficie totale della fibrosi interstiziale/area del miocita x 100

Risultati

Per fornire efficacemente i CFC al miocardio infartuato, in questo protocollo sono stati utilizzati idrogel collegabili incrociati in situ a caricamento MSC descritti nella figura 1. Prima del trapianto in vivo, la proliferazione e la sopravvivenza dei MBC negli idrogel gh sono stati confermati da un saggio di colorazione in cellule vive / morte in vitro 3D (vivo: verde; morto: rosso). Come mostrato nella figura 2, le immagini rappresentative mostravano una suff...

Discussione

Gli idrogel GH iniettabili hanno un grande potenziale per applicazioni in vivo grazie alla loro capacità di incorporare omogeneamente diversi agenti terapeutici in situ. Inoltre, le loro proprietà fisiche e biochimiche possono essere facilmente manipolate in base a requisiti dipendenti dalla malattia. A questo proposito, sono stati proposti idrogel iniettabili per affrontare le principali limitazioni dell'attuale terapia con cellule staminali cardiache ostacolate dalla scarsa sopravvivenza e ritenzione cellulare (cioè...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4 % paraformaldehyde (PFA)	Intron	IBS-BP031-2
5-0 silk suture	AILEE	SK534
8-0 polypropylene suture	ETHICON	M8732H
8-well chamber slide	Nunc LAB-TEK	154534
Angiocath Plus (22GA) catheter	BD Angiocath Plus	REF382423
Antibiotic-antimyocotic	Gibco	15240-062
Centrifuge	GYROGEN	1582MGR
Confocal microscope	Zeiss	LSM 510
Cover slipe	MARIENFELD	101242
Deluxe High Temperature Cautery kit	Bovie	QTY1
DMEM	Gibco	11995-065
DPBS	Gibco	14040-133
Dual-syringe
EOSIN	SIGMA-ALDRICH	HT110116
Ethanol	EMSURE	K49350783 739
FBS	Gibco	16000-044
Fechtner conjunctiva forceps titanium	WORLD PRECISISON INSTRUMENTS	WP1820
Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC)	SIGMA-ALDRICH	F7250
Forcep	HEBU	HB0458
Hair removal cream	Ildong Pharmaceutical
Heating pad	Stoelting	50300	Homeothermic Blanket System
		50301	Replacement Heating Pad for 50300 (10 X 12.5cm)
Hematoxylin	SIGMA-ALDRICH	HHS80
Horseradish peroxide (HRP; 250-330 U/mg)	SIGMA-ALDRICH	P8375
Hydrogen peroxide (H2O2; 30 wt % in H2O)	SIGMA-ALDRICH	216763
Iodine	Green Pharmaceutical
LIVE/DEAD cell staining kit	Thermo Fisher	R37601
Mechanical ventilator	Harvard Apparatus
Micro centrifuge	HANIL	Micro 12
Micro needle holder	KASCO	37-1452
Micro scissor	HEBU	HB7381
Microscope	OLYMPUS	SZ61
MT staining kit	SIGMA-ALDRICH	HT1079-1SET	Weigert’s iron hematoxylin solution
		HT15-1KT	Trichrome Stain (Masson) Kit
Paraffin	LK LABKOREA	H06-660-107
PBS buffer	Gibco	10010-023
PHK26 staining kit	SIGMA-ALDRICH	MINI26
Slide scanner	Leica	SCN400
Surgical scissor	HEBU	HB7454
Surgical tape	3M micopore	1530-1
Tissue cassette	Scilab Korea	Cas3003
Transducer gel	SUNGHEUNG	SH102
Trout-Barraquer needle holder curved	KASCO	50-3710c
Ultrasound system	Philips	Affiniti 50
Xylene	JUNSEI	25175-0430