Transplantation intramyocardique d’hydrogels injectables à chargement MSC après l’infarctus du myocarde dans un modèle murin

Résumé

La thérapie à base de cellules souches est apparue comme une stratégie efficace pour réparer les tissus cardiaques blessés après l’infarctus du myocarde. Nous fournissons une application in vivo optimale pour la transplantation de cellules souches utilisant des hydrogels de gélatine qui peuvent être enzymatiquement liés.

Résumé

L’un des principaux problèmes auxquels sont confrontées les thérapies actuelles de cellules souches cardiaques pour prévenir l’insuffisance cardiaque postinfarcte est le faible taux de rétention et de survie des cellules transplantées dans le myocarde blessé, limitant leur efficacité thérapeutique. Récemment, l’utilisation de biomatériaux d’échafaudage a attiré l’attention pour améliorer et maximiser la thérapie par cellules souches. L’objectif de ce protocole est d’introduire une technique simple et simple pour transplanter les cellules souches mésenchymales dérivées de la moelle osseuse (MSCs) à l’aide d’hydrogels injectables d’acide propionique hydroxyphényle (GH); les hydrogels sont favorables en tant que plate-forme de livraison de cellules pour des applications d’ingénierie de tissu cardiaque en raison de leur capacité à être in situ inter-liée et à la biocompatibilité élevée. Nous présentons une méthode simple pour fabriquer des hydrogels GH à chargement par MSC (MSC/hydrogels) et évaluer leur survie et leur prolifération dans la culture in vitro tridimensionnelle (3D). En outre, nous démontrons une technique pour la transplantation intramyocardique de MSC/hydrogels chez les souris, décrivant une procédure chirurgicale pour induire l’infarctus du myocarde (MI) par ligature antérieure gauche d’artère coronaire (LAD) et transplantation suivante de MSC/hydrogels.

Introduction

La thérapie cardiaque de cellules souches est apparue comme approche potentielle pour la réparation et la régénération myocardiques^1,2. Malgré les résultats positifs récents dans les modèles animaux et les essais cliniques, l’application de la thérapie à base de cellules souches pour la réparation du myocarde est limitée en raison de la faible rétention et la mauvaise survie des cellules injectées dans les tissus cardiaques infarctus^3,4. En conséquence, l’utilisation de l’ingénierie tissulaire à base de cellules, y compris les biomatériaux injectables⁵, les patchs^{cardiaques 6}, et les feuilles^{cellulaires 7}, a été intensivement étudié pour améliorer la rétention cellulaire et l’intégration dans le myocarde hôte.

Parmi les diverses approches potentielles de la réparation des tissus cardiaques bioingénieurs, les hydrogels injectables combinés à des types de cellules appropriés, tels que les cellules souches mésenchymiques (CSM), les cellules souches embryonnaires (ESC) et les cellules souches pluripotentes induites (IPSC), sont une option attrayante pour livrer efficacement les cellules dans les régions myocardiques^8,9. La gélatine, un polymère naturel bien connu, peut être utilisée comme matrice injectable en raison de sa grande biocompatibilité, de sa biodégradabilité considérable et de sa réduction de l’immunogénicité par rapport à un large éventail de biomatériaux utilisés dans les applications biomédicales. Bien que les plates-formes injectables à base de gélatine aient un grand potentiel, leur applicabilité in vivo reste limitée en raison de leur faible rigidité mécanique et de leur dégradabilité facile dans l’environnement physiologique.

Pour surmonter ces limitations, une conception nouvelle et simple d’hydrogels à base de gélatine composé d’acide propionique hydroxyphényle a été proposée pour des applications in vivo. Les conjugués à l’acide propionique gélatine-hydroxyphényle (GH) peuvent être reliés in situ en présence d’une enzyme, la peroxidase de raifort (HRP), et par la suite encapsuler divers médicaments, biomolécules ou cellules dans l’hydrogel, suggérant un grand potentiel dans les applications d’ingénierie^{tissulaire 10,11,12,13,14}. En outre, nous avons récemment étudié les effets thérapeutiques des hydrogels de GH contenant des MSCs encapsulés et avons démontré leur utilisation dans la réparation et la régénération cardiaques réussies après MI dans un modèle murin^15. Dans ce protocole, nous décrivons une technique simple pour l’encapsulation et la prolifération tridimensionnelle in vitro (3D) des MSCs dans les hydrogels de GH. Nous introduisons également une procédure chirurgicale conçue pour produire un modèle murin d’MI par ligature d’artère coronaire et transplantation intramyocardique des hydrogels de GH MSC-chargement dans le coeur infarctus.

Protocole

Toutes les procédures de recherche sur les animaux ont été fournies conformément à la Loi sur le bien-être des animaux de laboratoire, au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et aux Lignes directrices et politiques pour les expériences de rongeurs fournies par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’École de médecine de l’Université catholique de Corée.

1. Préparation des MSC et des hydrogels injectables de gélatine

1. Culture MSCs dans un plat de culture de 100 mm à 37 °C et 5% CO₂. Lorsque la croissance des MSC atteint 80% de confluence, laver le plat deux fois avec du DPBS et ajouter 1 mL de trypsine substitut à 37 °C pendant 3 min.
   REMARQUE : Les MSC ont été isolés de la moelle osseuse murine suivant les^{procédures conventionnelles 16}, cultivés dans le milieu modifié de l’aigle de Dulbecco (DMEM) contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de solution antibiotique−antimycotique, et utilisés entre le passage 7\u20129 pour cette étude.
2. Ajouter 9 mL de culture moyenne et centrifugeuse à 500 x g pendant 3 min. Ensuite, jetez le supernatant qui en résulte, resuspendez les cellules en 1 mL de PBS et maintenez la suspension cellulaire sur la glace.
3. Diluer 10 μL de suspension cellulaire avec 10 μL de bleu Trypan et obtenir la concentration cellulaire à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé.
4. Resuspendez et transférez les MSC dans un tube de 1 mL à une densité de 1 x 10⁷ cellules/mL.
5. Préparez une solution conjuguée GH de 6,25 % dans PBS et séparez-la en 2 flacons. Ensuite, mélangez les solutions GH avec 6 μg/mL de HRP (gh solution A) ou 0,07 wt% de H₂O₂ (GH solution B).
   NOTE : Préparer l’acide propionique gélatine-hydroxylphylphyle (GH) conjugué selon les protocoles^{édités 12,15.}
   1. Gardez un rapport volumétrique de 9:1 de gh solution conjuguée à HRP (GH solution A) et GH solution conjuguée à H₂O₂ (GH solution B), respectivement.
6. Avant de mélanger les MSC avec la solution GH A, centrifugez brièvement la suspension cellulaire à 1 000 x g et aspirez soigneusement le supernatant qui en résulte. Par la suite, mélanger la pastille contenant des MSC avec la solution GH A.

2. Chargement in situ du MSC et culture in vitro tridimensionnelle

1. Chargez la solution GH A (contenant des MSCs) et la solution GH B de chaque côté d’une double seringue. Plaque 300 μL des solutions GH combinées avec les MSC à une densité finale de 5 x 10⁶ cellules/mL sur une glissière de chambre de huit puits.
2. Après la formation in situ d’hydrogel et l’encapsulation suivante de MSC par l’intermédiaire de la liaison croisée enzymatique, ajoutez 700 μL de DMEM contenant 10% de FBS et 1% de solution antibiotique−antimycotique.
3. Incuber la diapositive à 37 °C et 5 % de CO_{2 et} remplacer le milieu de culture tous les 2\u20123 jours.

3. Confirmation de la prolifération in vitro et de la survie des SMC dans les hydrogels GH

1. Pour déterminer la viabilité des SMC cultivés en 3D dans les hydrogels GH, utilisez un test de coloration des cellules vivantes ou mortes après le temps d’incubation prédéterminé.
2. Après incubation des MSC encapsulés dans les hydrogels GH pendant 3, 5, 7 ou 14 jours, aspirez le milieu et lavez le puits deux fois avec du PBS.
3. Préparer une solution de coloration contenant 5 μL de calcéine AM et 20 μL d’éthidium homodimer-1 (EthD-1) dans 10 mL de DPBS.
4. Ajouter 200 μL de la solution de coloration au puits et incuber pendant 30 min dans l’obscurité à température ambiante.
5. Aspirer la solution de coloration et laver le puits deux fois avec PBS.
6. Séparez soigneusement la chambre de la glissière et placez un coverslip complet sur les hydrogels GH. Utilisez une microscopie confocale pour visualiser le degré de prolifération et les changements morphologiques des CSM encapsulés.
   REMARQUE : Les images fluorescentes ont été acquises sous grossissement de 200 x et photographiées aux longueurs d’onde excitation/émission de 470/540 nm pour la calcéine et de 516/607 nm pour EthD-1.

4. Induction de l’infarctus du myocarde chez la souris

1. Anesthésier les souris C57BL/6 mâles de 7 semaines (20\u201222 g) par injection intraperitoneal d’un mélange de Zoletil (30 mg/kg) et rompun (10 mg/kg) en solution saline.
2. Avant la chirurgie, dépolar le coffre de la souris à l’aide de crème d’épilation et stériliser la peau avec de l’iode.
3. Placez la souris sur une table d’opération et intubez en insérant un cathéter dans la trachée pour fournir de l’oxygène supplémentaire par ventilation mécanique.
4. Coupez doucement la peau à l’aide de ciseaux chirurgicaux, puis pénètrez les muscles intercostals par micro ciseaux. Séparez les 2e et 3e côtes gauches à l’aide d’une suture en soie 5-0 pour maintenir une cavité thoracique ouverte.
5. Ligate soigneusement l’artère coronaire descendante antérieure gauche (LAD) utilisant un support d’aiguille avec un 8-0 suture en polypropylène et couper la suture à l’aide d’électrocautery.
6. Observez un changement de couleur immédiat dans la paroi ventriculaire gauche antérieure.

5. Transplantation intramyocardique d’hydrogels GH à chargement par MSC

1. Après avoir induisé l’infarctus du myocarde par ligature LAD, injectez 10 μL de solutions GH à chargement MSC en deux points différents à la zone frontalière infarctus (total : 2 x 10⁵ MSCs/20 μL) à l’aide d’une seringue double munie d’une aiguille 26G.
   1. Suivant la même procédure décrite à l’étape 1, préparez et transférez les solutions GH à chargement par MSC dans une double seringue.
      REMARQUE : Pour évaluer l’engraftment des hydrogels GH à chargement par MSC dans la zone infarctusée, les SMC et les conjugués gh ont été pré-étiquetés avec phk26 et isothiocyanate de fluorescéine (FITC), respectivement.
2. Restaurer la cavité thoracique ouverte et fermer les muscles et la peau à l’aide de sutures 5-0.
   REMARQUE : Avant la fermeture de la poitrine, retirez l’air à l’aide d’une seringue cathéter.
3. Retirez le tube trachéal et placez la souris dans une cage sous une lampe infrarouge pendant la récupération.
4. Pour l’analgésie postopératoire, administrer des injections sous-cutanées de kétoprofène (5 mg/kg par jour) pour un minimum de 72 h. Toutes les souris devraient être étroitement surveillées pendant un moment approprié pour assurer le rétablissement approprié après des procédures chirurgicales aussi bien que le traitement adéquat de douleur.

6. Échocardiographie

1. Quatre semaines après la transplantation, anesthésier d’abord la souris avec 5% d’isoflurane, puis ajuster la concentration d’isoflurane à 1%.
2. Dépeler la poitrine à l’aide de crème d’épilation et placer la souris sur un coussin chauffant. Appliquer le gel transducteur à ultrasons sur la poitrine.
3. Acquérir des vues parasternales à axe court bidimensionnel et enregistrer des tracés en mode M au niveau du muscle papillaire.
   REMARQUE : Placez un transducteur linéaire (7\u201215 MHz) dans la ligne parasternale gauche et visualisez les structures anatomiques.
4. Mesurez les lignes correspondantes pour LVAW, LVID et LVPW pour obtenir l’épaisseur de la paroi cardiaque, la dimension de la chambre et le raccourcissement fractionnel.
   REMARQUE : Comparez la fonction cardiaque comprenant la fraction d’éjection (EF), le raccourcissement fractionnel (FS), et le volume systolique final (ESV) au niveau du muscle papillaire pour assurer l’évaluation appropriée au même endroit anatomique.

7. Évaluation histologique

1. Au moment prédéterminé après la transplantation des hydrogels GH msc-chargement dans le coeur infarctus, euthanasier la souris dans une chambre de CO₂ et de recueillir le cœur pour l’analyse histologique¹⁵.
2. Pour l’hématoxyline et l’éosine (H&E) et la coloration trichrome (MT) de Masson, fixez les tissus cardiaques disséqués en paraformaldéhyde (PFA) à 4 % et intégris à la paraffine. Ensuite, coupez les blocs cardiaques intégrés à la paraffine en sections de série de 4 μm à l’aide d’une microtome et tachez les sections avec de la tache MT selon les protocoles standard¹⁷.
3. Obtenez des images sur un scanner de diapositives à 20x grossissement et calculez la taille infarctus des groupes de traitement.
   Taille infarctus (%) = circonférence infarctus totale / circonférence totale du LV x 100
4. Calculez les deux circonférences par mesure de la longueur médiane. Pour les circonférences intermédiaires LV, mesurez les longueurs de la ligne centrale entre les surfaces endocardiques et épicardiales. Pour les circonférences infarctus de la ligne médiane, mesurer les longueurs de l’infarctus, y compris plus de 50 % de toute l’épaisseur du myocarde¹⁸.
   REMARQUE : Toutes les analyses d’images ont été effectuées à l’aide du logiciel ImageJ.
5. Mesurer l’épaisseur de la paroi de la cicatrice aux niveaux musculaires papillaires.
6. Calculer la fraction de la zone de collagène.
   Zone de collagène (%) = superficie totale de fibrose interstitielle/zone myocyte x 100

Résultats

Pour livrer efficacement les CSM au myocarde infarctus, des hydrogels in situ à chargement in situ à liaison croisée décrits à la figure 1 ont été utilisés dans ce protocole. Avant la transplantation in vivo, la prolifération et la survie des SMC dans les hydrogels GH ont été confirmées par un test de coloration 3D in vitro des cellules vivantes/mortes (vivant : vert; mort : rouge). Comme le montre la figure 2, lesimages représentatives présentaien...

Discussion

Hydrogels GH injectables ont un grand potentiel pour les applications in vivo en raison de leur capacité à incorporer homogènement divers agents thérapeutiques in situ. En outre, leurs propriétés physiques et biochimiques peuvent être facilement manipulées en fonction des besoins dépendants de la maladie. À cet égard, des hydrogels injectables ont été proposés pour répondre aux principales limitations de la thérapie actuelle par cellules souches cardiaques entravées par une mauvaise survie et la rétenti...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4 % paraformaldehyde (PFA)	Intron	IBS-BP031-2
5-0 silk suture	AILEE	SK534
8-0 polypropylene suture	ETHICON	M8732H
8-well chamber slide	Nunc LAB-TEK	154534
Angiocath Plus (22GA) catheter	BD Angiocath Plus	REF382423
Antibiotic-antimyocotic	Gibco	15240-062
Centrifuge	GYROGEN	1582MGR
Confocal microscope	Zeiss	LSM 510
Cover slipe	MARIENFELD	101242
Deluxe High Temperature Cautery kit	Bovie	QTY1
DMEM	Gibco	11995-065
DPBS	Gibco	14040-133
Dual-syringe
EOSIN	SIGMA-ALDRICH	HT110116
Ethanol	EMSURE	K49350783 739
FBS	Gibco	16000-044
Fechtner conjunctiva forceps titanium	WORLD PRECISISON INSTRUMENTS	WP1820
Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC)	SIGMA-ALDRICH	F7250
Forcep	HEBU	HB0458
Hair removal cream	Ildong Pharmaceutical
Heating pad	Stoelting	50300	Homeothermic Blanket System
		50301	Replacement Heating Pad for 50300 (10 X 12.5cm)
Hematoxylin	SIGMA-ALDRICH	HHS80
Horseradish peroxide (HRP; 250-330 U/mg)	SIGMA-ALDRICH	P8375
Hydrogen peroxide (H2O2; 30 wt % in H2O)	SIGMA-ALDRICH	216763
Iodine	Green Pharmaceutical
LIVE/DEAD cell staining kit	Thermo Fisher	R37601
Mechanical ventilator	Harvard Apparatus
Micro centrifuge	HANIL	Micro 12
Micro needle holder	KASCO	37-1452
Micro scissor	HEBU	HB7381
Microscope	OLYMPUS	SZ61
MT staining kit	SIGMA-ALDRICH	HT1079-1SET	Weigert’s iron hematoxylin solution
		HT15-1KT	Trichrome Stain (Masson) Kit
Paraffin	LK LABKOREA	H06-660-107
PBS buffer	Gibco	10010-023
PHK26 staining kit	SIGMA-ALDRICH	MINI26
Slide scanner	Leica	SCN400
Surgical scissor	HEBU	HB7454
Surgical tape	3M micopore	1530-1
Tissue cassette	Scilab Korea	Cas3003
Transducer gel	SUNGHEUNG	SH102
Trout-Barraquer needle holder curved	KASCO	50-3710c
Ultrasound system	Philips	Affiniti 50
Xylene	JUNSEI	25175-0430