JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تقدم هذه الورقة وصفاً مفصلاً لكيفية بناء نموذج حيواني للمرحلة الـ"هيبد" (نقص التروية في الكبد) في الفئران لتسهيل البحوث الأساسية في إصابة الإقفار في الدم بعد زرع الكبد.

Abstract

زرع الكبد التقويمي (OLT) في الفئران هو نموذج حيواني مجربة ومثبتة يستخدم في الدراسات قبل الجراحة، وفيما بين العمليات، و ما بعد العملية الجراحية، بما في ذلك إصابة الإقفاريات-إعادة الحقن (IRI) للأعضاء خارج الجسم. يتطلب هذا النموذج العديد من التجارب والأجهزة. ترتبط مدة المرحلة الوهنية ارتباطًا وثيقًا بالوقت الذي يتم تطويره بعد الزرع. في هذه التجربة، استخدمنا التغيرات الديناميكية الدموية للحث على تلف الأعضاء خارج الكبد في الفئران وحددنا أقصى وقت للتسامح. الوقت حتى أشد إصابة الجهاز تختلف لمختلف الأجهزة. يمكن بسهولة تكرار هذه الطريقة ويمكن استخدامها أيضا لدراسة IRI من الأعضاء خارج الكبد بعد زرع الكبد.

Introduction

إصابة الإقفاري بالوريد (IRI) هي من المضاعفات الشائعة بعد زراعة الكبد. IRI الكبد هي عملية مرضية تنطوي على تلف الخلايا بوساطة الإقفاريات وتدهور غير طبيعي في تكاثر الكبد. يمكن تقسيم IRI الكبدية والاستجابة المناعية الفطرية المحلية إلى IRI الساخنة والباردة، وفقا للاختلافات في البيئة السريرية1. يتم حث IRI الساخنة من قبل إصابة الخلايا الجذعية، وعادة نتيجة لزرع الكبد، صدمة، والصدماتالنفسية 2. IRI الباردة هو من مضاعفات زرع الكبد الناجمة عن الخلايا البطانية والدورة الدموية الطرفية3. وقد أظهرت التقارير السريرية أن يرتبط IRI الكبدي مع 10٪ من فشل الجهاز المبكر، ويمكن أن تزيد من حدوث الرفض الحاد والمزمن4,5. بالإضافة إلى ذلك ، قد يؤدي IRI الكبدي أيضًا إلى متلازمات خلل وظيفي متعددة في الأعضاء أو متلازمة الاستجابة الالتهابية النظامية ، مع ارتفاع معدل الوفيات6. المرضى الذين يعانون من مشاركة الجهاز خارج الكبد تميل إلى البقاء لفترة أطول في المستشفى، تنفق المزيد من المال، ويكون أسوأ التكهن7. ويرتبط تطور المضاعفات ارتباطا وثيقا بطول المرحلة الالكبدة من زرع الكبد8.

تم الإبلاغ عن زراعة الكبد التقويمي (OLT) في الفئران لأول مرة من قبل البروفيسور الأمريكي لي في عام 1973. تحاكي العملية التجريبية خطوات زراعة الكبد السريرية وosistomosis الأوعية الدموية والقناة الصفراوية المشتركة (CBD) باستخدام طريقة الغرز. الإجراء صعب وتستغرق وقتا طويلا مع معدل نجاح منخفض9. في عام 1979، أدلى كامادا وآخرون تحسنا كبيرا OLT في الفئران باستخدام خلاق 'طريقة اثنين الكفة' لالتموخ من الوريد المدخل للسيطرة على المرحلة anhepatic في غضون 26 دقيقة10. في العام نفسه، اقترح زيمرمان "طريقة الدعامة الصفراوية الفردية". على أساس عمل لي، استخدم زيمرمان أنابيب البولي إيثيلين إلى أنستيوميوس مباشرة اتفاقية التنوع البيولوجي للمتبرع والمتلقي، وتبسيط إعادة بناء اتفاقية التنوع البيولوجي، والحفاظ على وظيفة العضلة العاصرة، وأصبحت هذه الطريقة المعيار لإعادة بناء الصفراوية من نماذج OLT11. في عام 1980، اقترح مياتا وآخرون "طريقة الكفة الثلاثية" حيث تم استئصال الوريد البوّلي (PV) و vena cava (SVC) وداخلي الكبدي (IVC) بواسطة طريقة الكفة. ومع ذلك ، هناك خطر تشويه القنية مع هذه الطريقة ، والتي يمكن أن تؤدي إلى عرقلة السفلية فينا كافا الجزر12. في عام 1983، تم اقتراح "طريقة الكفتين" باستخدام طريقة الكفة لتمتُس الفلطائن من الفلطائية الضوئية و IVC، ولكن اعتماد طريقة خياطة SVC13. وقد اعتمد العلماء هذه الطريقة على الصعيد العالمي لإنشاء نماذج OLT. ومنذ ذلك الحين، تم تحسين الخطوات تانوميسيس الكفة لتقصير المرحلة anhepatic وتحسين معدل البقاء على قيد الحياة من الفئران14. وبالمثل، يتم استخدام أساليب محسنة في الممارسة السريرية لتقصير المرحلة anhepatic15. ومع ذلك، أظهرت الأبحاث الأساسية في IRI بعد زرع الكبد أن معدل البقاء على قيد الحياة يرتبط عكسيا لدرجة إصابة الأعضاء خارج الكبد. لذلك، هناك حاجة إلى مزيد من البحوث، ونموذج حيواني بسيط ويمكن استنساخه مطلوب لمحاكاة IRI بعد زرع الكبد.

استنادا إلى تعريف المرحلة anhepatic، ونحن محاكاة التغيرات الديناميكية الدموية في زرع الكبد مما أدى إلى IRI من الأجهزة خارج الكبد في الفئران. هنا، نقدم وصفا مفصلا لكيفية بناء نموذج حيواني للمرحلة anhepatic (نقص التروية الكبد) في الفئران لتسهيل البحوث الأساسية في IRI بعد زرع الكبد.

Protocol

وافقت لجنة أخلاقيات الحيوان على تجربة جامعة قوانغشي الطبية (No20190920). تم تزويد جميع الحيوانات من قبل مركز التجارب الحيوانية في جامعة قوانغشى الطبية. استخدمنا SPF الذكور Sprague الفئران داولي (200-250 غرام، 10-12 أسابيع)، أبقى تحت درجة حرارة الغرفة من 25 ± 2 درجة مئوية والرطوبة من 50 ± 10٪. تم إيقاف التغذية قبل 24 ساعة من العملية؛ ومع ذلك، تم توفير المياه.

ملاحظة: يمكن لمشغل واحد إجراء جميع العمليات دون أساس الجراحة المجهرية أو المجهر الجراحي.

1. العملية

  1. بعد وزنها، تخدير الفئران مع ايزوفلوران (5٪). باستخدام آلة تخدير.
  2. بعد 1-2 دقيقة، المشبك بلطف أصابع الجرذ مع ملاقط. إذا لم يستجب الجرذ بعد الضغط ، فقد دخل حالة تخدير. استخدام مرهم الطبيب البيطري على العينين لمنع جفاف. استخدام مصابيح التدفئة الحيوانية للحفاظ على درجة حرارة جسم الفئران في 37-38 درجة مئوية.
  3. بعد تطهير البطن (povidone اليود الحل) ، وإصلاح الفئران على طاولة تشريح الحيوان. جعل شق متوسط 3 سم تحت عملية xiphoid باستخدام ملقط ومقص.
  4. افتح تجويف البطن، وفضح الكبد باستخدام الداخر، وتعبئة الرباط الكبدي. استخدام مسحات القطن لقلب الفص الأوسط للكبد بلطف وتحويلها إلى أعلى لفضح الـ بورتا هيباتيس. تحديد اتفاقية التنوع البيولوجي، الكهروضوئية، والهايّة.
  5. ادفع الأمعاء الدقيقة نحو تجويف البطن السفلي الأيسر باستخدام مسحات القطن، واغطيه بالشاش الرطب، واحرك الوريد الوريدي الوريدي داخل الجسم إلى الوريد الكلوي الأيمن.
  6. عزل الوريد المدخل، الشريان الكبدي، والكافا الوريدية السفلية فوق الوريد الكلوي الأيمن مع عدسة داخل العين واللليبات ملحوظ مع 3-0 خيط حرير، مع كل عقدة زلة.
  7. قطع فتح الجلد السفلي السفلي الأيسر والأيمن وفضح الوريد الفخذي باستخدام ملقط العيون. حقن ببطء منخفض الوزن الجزيئي الهيبارين 625 وحدة دولية / كغ من خلال الوريد الفخذي ل heparinize الجسم كله.
  8. Ligate الوريد المدخل, الشريان الكبدي, وسفاح الوريد السفلي فوق الوريد الكلوي الأيمن مع خياطة رقم 3-0, دائم 45 دقيقة (الشكل 1). استبدل الأمعاء الدقيقة في تجويف البطن واغطيها بالشاش. تقليل التخدير الاستنشاقي خلال هذه الفترات.
  9. بعد 45 دقيقة، حرر الوريد المدخل، الشريان الكبدي، والكافا السفلية فوق الوريد الكلوي الأيمن.
  10. خياطة العضلات والجلد، طبقة بطبقة، وإنهاء التخدير الاستنشاقي. توفير الانسداد بعد الجراحة باستخدام المورفين تحت الجلد من 5 ملغ / كغ كل 4 ساعات.
  11. مراقبة الفئران حتى يكون مستيقظا ويتغذى تحت درجة حرارة 25 ± 2 درجة مئوية والرطوبة من 50 ± 10٪. مصابيح تدفئة الحيوانات ضرورية.

النتائج

الجرذان' التسامح إلى نقص التروية الكبد
في هذا النموذج الحيواني، تظهر المواقع التي تم ربط الأوعية الدموية فيها أثناء التشغيل في الشكل 1. تم تقسيم الجرذان بشكل عشوائي إلى 5 مجموعات لـ ISCHEMIA لمدة 15 دقيقة (مجموعة I15) و30 دقيقة (مجموعة I30) و45 دقيقة (مجموعة I45) و60 دقيقة (I60) وم?...

Discussion

OLT في الفئران هو نموذج مثالي لدراسة الحفاظ على الأعضاء في زراعة الكبد، IRI، رفض زرع، التسامح المناعي، زرع الأمراض والصيدلة، homotransplantation، وxenotransplantation. في الوقت الحاضر، ويستخدم على نطاق واسع في البحوث التجريبية لزرع الكبد.

خلال الدراسات التجريبية قمنا أولاً بإعطاء التخدير داخل...

Disclosures

ليس لدى مؤلفي هذه المخطوطة أي تضارب في المصالح للكشف عنها.

Acknowledgements

ونود أن نُقرّ بالاقتراحات المفيدة التي قدمها الدكتور وين تاو لي والدكتور جي هوا وو من المستشفى الثاني التابع لجامعة غوانغشي الطبية. ويود المؤلفون أن يشكروا زملاءنا في الفريق على التعليقات والمناقشات المفيدة. كما يود المؤلفون أن يشكروا المراجعين ومحرري JoVE المجهولين على تعليقاتهم. وينبغي توجيه شكر خاص إلى والدي الدكتور يوان على دعمهما وتشجيعهما المستمرين. وقد دعم العمل مؤسسة نينغبو للعلوم الطبيعية (2014A610248).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
4% paraformaldehyde solutionShanghai Macklin Biochemical Co.,LtdP804536
air drying ovenShanghai Binglin Electronic Technology Co., Ltd.BPG
Alanine aminotransferase (ALT)KitElabscience Biotechnology Co.,LtdE-BC-K235-S
ammoniaSinopharm Chemical Reagents Co. Ltd10002118
amylase KitElabscience Biotechnology Co.,LtdE-BC-K005-M
anhydrous ethanolSinopharm Chemical Reagents Co. Ltd100092183
Animal anesthesia machineShenzhen Ruiwode Life Technology Co. LtdR640
aspartate aminotransferase (AST)kitRayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd.S03040
automatic biochemical analyzer.SIEMENS AG FWB:SIE, NYSE:SI Co., Ltd.2400
Biosystems (when nessary)Chengdu Taimeng Electronics Co., Ltd.BL-420F
CentrifugeBaiyang Medical Instrument Co., Ltd.BY-600A
cover glassJiangsu Shitai Experimental Equipment Co. Ltd10212432C
creatinine KitRayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd.S03076
dewatering machineHungary 3DHISTECH Co.,LtdDonatello Series 2
embedding machineHubei Xiaogan Kuohai Medical Technology Co., Ltd.KH-BL1
frozen machineWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-L5
hematoxylin-eosin dye solutionWuhan Saiwell Biotechnology Co., LtdG1005
high-efficiency paraffin waxShanghai huayong paraffin wax co., LtdQ/YSQN40-91
hydrochloric acidSinopharm Chemical Reagents Co. Ltd10011018
intraocular lens (IOL)forcepsGuangzhou Guangmei Medical Equipment Co., Ltd.JTZRN
IsofluraneShenzhen Ruiwode Life Technology Co. Ltd—
micro Scissors(when nessary)Shanghai Surgical Instrument FactoryWA1010
needle holdersShanghai Surgical Instrument FactoryJ32010
neutral gumShanghai Huashen Healing Equipment Co.,Ltd.—
normal optical microscopeNikon Instrument Shanghai Co., LtdNikon Eclipse CI
ophthalmic forcepsShanghai Surgical Instrument FactoryJ3CO30straight
ophthalmic forcepsShanghai Surgical Instrument FactoryJD1060bending
ophthalmic ScissorsShanghai Surgical Instrument FactoryJ1E0
pathological slicerShanghai Leica Instrument Co., LtdRM2016
pipettesDragon Laboratory Instruments Co., Ltd.7010101008
retractorsBeijing Jinuotai Technology Development Co.,Ltd.JNT-KXQ
scannerHungary 3DHISTECH Co.,LtdPannoramic 250
slideWuhan Saiwell Biotechnology Co., LtdG6004
xyleneSinopharm Chemical Reagents Co. Ltd1330-20-7

References

  1. Dar, W. A., Sullivan, E., Byon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms. Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).
  2. Qiao, P. F., Yao, L., Zhang, X. C., Li, G. D., Wu, D. Q. Heat shock pretreatment improves stem cell repair following ischemia-reperfusion injury via autophagy. World Journal of Gastroenterology. 21 (45), 12822-12834 (2015).
  3. Liu, Y., et al. Activation of YAP attenuates hepatic damage and fibrosis in liver ischemia-reperfusion injury. Journal of Hepatology. 71 (4), 719-730 (2019).
  4. Hirao, H., Dery, K. J., Kageyama, S., Nakamura, K., Kupiec-Weglinski, J. W. Heme Oxygenase-1 in liver transplant ischemia-reperfusion injury: From bench-to-bedside. Free Radical Biology and Medicine. 157, 75-82 (2020).
  5. Motiño, O., et al. Protective role of hepatocyte cyclooxygenase-2 expression against liver ischemia-reperfusion injury in mice. Hepatology. 70 (2), 650-665 (2019).
  6. Guo, W. A. The search for a magic bullet to fight multiple organ failure secondary to ischemia/reperfusion injury and abdominal compartment syndrome. Journal of Surgical Research. 184 (2), 792-793 (2013).
  7. Elham, M., Mahmoudi, M., Nassiri-Toosi, M., Baghfalaki, T., Zeraati, H. Post liver transplantation survival and related prognostic factors among adult recipients in tehran liver transplant center; 2002-2019. Archives of Iranian Medicine. 1 (23), 326-334 (2020).
  8. Kim, E. H., Ko, J. S., Gwak, M. S., Lee, S. K., Kim, G. S. Incidence and clinical significance of hyperfibrinolysis during living donor liver transplantation. Blood Coagulation and Fibrinolysis. 29 (3), 322-326 (2018).
  9. Czigány, Z. Improving research practice in rat orthotopic and partial orthotopic liver transplantation: a review, recommendation, and publication guide. European Surgical Research. 55 (1-2), 119-138 (2015).
  10. Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28 (1), 47-50 (1979).
  11. Zimmermann, F. A., et al. Techniques for orthotopic liver transplantation in the rat and some studies of the immunologic responses to fully allogeneic liver grafts. Transplantation Proceedings. 11 (1), 571-577 (1979).
  12. Miyata, M., Fischer, J. H., Fuhs, M., Isselhard, W., Kasai, Y. A simple method for orthotopic liver transplantation in the rat. Cuff technique for three vascular anastomoses. Transplantation. 30 (5), 335-338 (1980).
  13. Kamada, N. A., Calne, R. Y. Surgical experience with five hundred thirty liver transplants in the rat. Surgery. 93 (1), 64-69 (1983).
  14. Yang, L. F., et al. A rat model of orthotopic liver transplantation using a novel magnetic anastomosis technique for suprahepatic vena cava reconstruction. Journal of Visualized Experiments. 19 (133), e56933 (2018).
  15. Liu, L. X., He, C., Huang, T., Gu, J. Development of a new technique for reconstruction of hepatic artery during liver transplantation in sprague-dawley rat. PLoS One. 10 (12), 0145662 (2015).
  16. Paller, M. S., Hoidal, J. R., Ferris, T. F. Oxygen free radicals in ischemic acute renal failure In the rat. Journal of Clinical Investigation. 74 (4), 1156-1164 (1984).
  17. Schmidt, J., Lewandrowsi, K., Warshaw, A. L., Compton, C. C., Rattner, D. W. Morphometric characteristics and homogeneity of a new model of acute pancreatitis in the rat. International Journal of Pancreatology. 12 (1), 41-51 (1992).
  18. Chui, C. J., McArdle, A. H., Brown, R., Scott, H. J., Gurd, F. N. Intestinal mucosal lesion in low-flow states. I. A morphological, hemodynamic, and metabolic reappraisal. Archives of Surgery. 101 (4), 478-483 (1970).
  19. Kozian, A., et al. One-lung ventilation induces hyperfusion and alveolar damage in the ventilated lung:an experimental study. British Journal of Anaesthesia. 100 (4), 549-559 (2008).
  20. Shimada, S., et al. Heavy water (D2O) containing preservation solution reduces hepatic cold preservation and reperfusion injury in an isolated perfused rat liver (IPRL) model. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1818 (2019).
  21. Nakamura, K. Sirtuin 1 attenuates inflammation and hepatocellular damage in liver transplant ischemia/reperfusion: from mouse to human. Liver Transplantation. 23 (10), 1282-1293 (2017).
  22. Blaire, A., et al. Surgical Considerations of Hilar Cholangiocarcinoma. Surgical Oncology Clinics of North America. 28 (4), 601-617 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

169

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved