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摘要

本文详细介绍了如何构建大鼠肝相（肝缺血）动物模型，促进肝移植后缺血-输液损伤的基础研究。

摘要

大鼠的正畸肝移植 （OLT） 是一种经过验证的动物模型，用于术前、术中和术后研究，包括肝外器官的缺血-输液损伤 （IRI）。此模型需要大量的实验和设备。肝相的持续时间与移植后开发 IRI 的时间密切相关。在这个实验中，我们利用血动力学的变化诱导大鼠的肝外器官损伤，并确定了最大耐受时间。对于不同的器官来说，直到最严重的器官损伤的时间各不相同。这种方法可以很容易地复制，也可用于研究肝移植后肝外器官的IRI。

引言

缺血性输液损伤（IRI）是肝脏移植后常见的并发症。肝 IRI 是一个病理过程，涉及缺血介导细胞损伤和肝脏再输液异常恶化。肝ARI和局部与生俱来的免疫反应可分为冷热ARI，根据临床环境的差异1。热 IRI 是由干细胞损伤引起的，通常由肝脏移植、休克和创伤2引起。冷ARI是由内皮细胞和外周循环3引起的肝移植并发症。临床报告显示，肝IRI与10%的早期器官衰竭有关，并可能增加急性和慢性排斥的发病率4，5。此外，肝ARI也可能诱发多种器官功能障碍综合征或全身炎症反应综合征，死亡率高6.肝外器官介入的患者往往在医院停留更长的时间，花更多的钱，并有一个更差的预后7。并发症的发展与肝移植8的肝移植阶段的长度密切相关。

1973年，美国李教授首次报道了大鼠骨科肝移植（OLT）。实验操作采用缝合法模拟临床肝移植步骤、血管和普通胆管（CBD）的解剖步骤。这个过程是困难和耗时的，成功率低9。1979年，Kamada等人创造性地使用"双袖法"对门户静脉进行解剖，在26分钟内控制肝炎期，从而大大改善了大鼠的OLT。同年，齐默尔曼提出了"单胆汁支架法"。在李安工作的基础上，齐默尔曼利用聚乙烯管直接对捐赠人和接受者的CBD进行解剖，简化了CBD的重建，保留了括约肌的功能，使之成为OLT模型11的胆汁重建标准。1980年，宫田等人提出了"三袖法"，即门户静脉（PV）、超肝静脉卡瓦（SVC）和内皮静脉卡瓦（IVC）被袖口法麻醉。然而，有扭曲的管子与这种方法的风险，这可能导致阻碍劣质的静脉曲道倒流12。1983年，"双袖法"被提出使用袖口法进行光伏和IVC的解剖，但采用SVC13的缝合方法。这种方法被全球学者采用，以建立OLT模型。此后，袖口解剖步骤得到改善，缩短了肝病期，提高了14只大鼠的存活率。同样，改进的方法用于临床实践，以缩短肝阶段15。然而，肝移植后对IRI的基础研究表明，存活率与肝外器官的损伤程度成反比。因此，需要进一步的研究，需要一个简单和可重复的动物模型来模拟肝移植后的IRI。

基于肝相的定义，我们模拟了肝移植的造血变化，导致大鼠肝外器官的IRI。在此，我们提供了如何建立大鼠肝相（肝缺血）动物模型的详细描述，以促进肝移植后对IRI的基础研究。

研究方案

动物伦理委员会批准了广西医科大学（No20190920）的实验。所有动物均由广西医科大学动物实验中心提供。我们使用SPF雄性斯普拉格道利大鼠（200-250克，10-12周），保持在室温下25±2°C和湿度50±10%。喂食在手术前24小时停止:然而，提供了水。

注:一名操作员无需显微外科或手术显微镜即可执行所有操作。

1. 操作

  1. 称量后，用异氟化物麻醉大鼠 （5%）使用动物麻醉机。
  2. 1-2分钟后，用钳子轻轻夹住老鼠的脚趾。如果大鼠在捏捏后没有反应，它已进入麻醉状态。使用兽医软膏的眼睛，以防止干燥。使用动物加热灯将大鼠的体温保持在37-38°C。
  3. 腹部消毒（波维酮碘溶液）后，将鼠固定在动物解剖台上。使用钳子和剪刀在 xiphoid 工艺下方 3 厘米处切口中位数。
  4. 打开腹腔，用缩管暴露肝脏，并调动肝胃韧带。使用棉签轻轻地翻转肝脏的中叶，并向上转动以暴露肝炎。识别中央商务区、光伏和医管局。
  5. 用棉签将小肠向左下腹腔推，用湿纱布盖住，并将内湿静脉卡瓦移到右肾静脉。
  6. 用眼内镜片和用3-0丝线标记的钳子隔离入口静脉、肝动脉和右肾静脉上方的劣质静脉卡瓦，每个都带有一个滑结。
  7. 切开左下肢皮肤，用眼钳露出股骨静脉。慢慢地通过股骨静脉注射低分子量肝素625 IU/kg，使整个身体肝素化。
  8. 用3-0号缝合的右肾静脉上方的入口静脉、肝动脉和劣质静脉卡瓦，持续45分钟（图1）。更换腹腔中的小肠，用纱布盖住。减少这些期间的吸入麻醉。
  9. 45分钟后，释放入口静脉、肝动脉和右肾静脉上方的劣质静脉卡瓦。
  10. 缝合肌肉和皮肤，一层一层，并终止吸入麻醉。每4小时使用皮下吗啡5毫克/千克提供术后镇痛。
  11. 观察大鼠，直到它清醒，并在25±2°C的温度和50±10%的湿度下喂养。动物加热灯是必要的。

结果

老鼠对肝缺血的耐受性
在这个动物模型中，在操作过程中血管被放出的部位显示在图1中。大鼠被随机分成5组进行缺血15分钟（I15组）、30分钟（I30组）、45分钟（I45组）、60分钟（I60组）和假组，每组10只大鼠。手术后14天观察到每组的存活率。所有老鼠在I15组、I30组和假组存活下来。在I45组，有8人存活了14天，在I60组中只有2人幸存下来。这些结果表明，大鼠?...

讨论

大鼠OLT是研究肝移植、IRI、移植排斥、免疫耐受性、移植病理学和药理学、同质移植和异种移植器官保存的理想模型。目前，它已广泛应用于肝移植的实验研究。

在试验性研究中，我们首先对五巴比妥钠进行腹膜内麻醉，发现这导致术后死亡率高，对血动性变化的耐受性短。因此，我们在随后的试验中使用吸入麻醉剂，以快速开始行动和快速排除 体外 特征。转向吸入...

披露声明

这份手稿的作者没有利益冲突可以披露。

致谢

我们要感谢广西医科大学第二附属医院的李文涛博士和吴继华博士提出的有益建议。作者要感谢我们的队友们的有益评论和讨论。作者还要感谢JoVE的匿名评论者和编辑们的评论。特别感谢袁医生的父母们的不断支持和鼓励。这项工作得到了宁波市自然科学基金委员会（2014A610248）的支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
4% paraformaldehyde solutionShanghai Macklin Biochemical Co.,LtdP804536
air drying ovenShanghai Binglin Electronic Technology Co., Ltd.BPG
Alanine aminotransferase (ALT)KitElabscience Biotechnology Co.,LtdE-BC-K235-S
ammoniaSinopharm Chemical Reagents Co. Ltd10002118
amylase KitElabscience Biotechnology Co.,LtdE-BC-K005-M
anhydrous ethanolSinopharm Chemical Reagents Co. Ltd100092183
Animal anesthesia machineShenzhen Ruiwode Life Technology Co. LtdR640
aspartate aminotransferase (AST)kitRayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd.S03040
automatic biochemical analyzer.SIEMENS AG FWB:SIE, NYSE:SI Co., Ltd.2400
Biosystems (when nessary)Chengdu Taimeng Electronics Co., Ltd.BL-420F
CentrifugeBaiyang Medical Instrument Co., Ltd.BY-600A
cover glassJiangsu Shitai Experimental Equipment Co. Ltd10212432C
creatinine KitRayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd.S03076
dewatering machineHungary 3DHISTECH Co.,LtdDonatello Series 2
embedding machineHubei Xiaogan Kuohai Medical Technology Co., Ltd.KH-BL1
frozen machineWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-L5
hematoxylin-eosin dye solutionWuhan Saiwell Biotechnology Co., LtdG1005
high-efficiency paraffin waxShanghai huayong paraffin wax co., LtdQ/YSQN40-91
hydrochloric acidSinopharm Chemical Reagents Co. Ltd10011018
intraocular lens (IOL)forcepsGuangzhou Guangmei Medical Equipment Co., Ltd.JTZRN
IsofluraneShenzhen Ruiwode Life Technology Co. Ltd—
micro Scissors(when nessary)Shanghai Surgical Instrument FactoryWA1010
needle holdersShanghai Surgical Instrument FactoryJ32010
neutral gumShanghai Huashen Healing Equipment Co.,Ltd.—
normal optical microscopeNikon Instrument Shanghai Co., LtdNikon Eclipse CI
ophthalmic forcepsShanghai Surgical Instrument FactoryJ3CO30straight
ophthalmic forcepsShanghai Surgical Instrument FactoryJD1060bending
ophthalmic ScissorsShanghai Surgical Instrument FactoryJ1E0
pathological slicerShanghai Leica Instrument Co., LtdRM2016
pipettesDragon Laboratory Instruments Co., Ltd.7010101008
retractorsBeijing Jinuotai Technology Development Co.,Ltd.JNT-KXQ
scannerHungary 3DHISTECH Co.,LtdPannoramic 250
slideWuhan Saiwell Biotechnology Co., LtdG6004
xyleneSinopharm Chemical Reagents Co. Ltd1330-20-7

参考文献

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