JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu makale, karaciğer naklinden sonra iskemi-reperfüzyon hasarı ile ilgili temel araştırmaları kolaylaştırmak için sıçanlarda anhepatik fazın (karaciğer iskemisi) bir hayvan modelinin nasıl inşaılacağına dair ayrıntılı bir açıklama sunmaktadır.

Özet

Sıçanlarda ortotopik karaciğer nakli (OLT), ekstrahepatik organların iskemi-reperfüzyon yaralanması (IRI) da dahil olmak üzere ameliyat öncesi, intraoperatif ve postoperatif çalışmalar için kullanılan denenmiş ve kanıtlanmış bir hayvan modelidir. Bu model çok sayıda deney ve cihaz gerektirir. Anhepatik fazın süresi transplantasyon sonrası IRI geliştirme süresi ile yakından ilgilidir. Bu deneyde, sıçanlarda ekstrahepatik organ hasarına neden olmak için hemodinamik değişiklikler kullandık ve maksimum tolerans süresini belirledik. En ağır organ yaralanmasına kadar geçen süre farklı organlar için farklıydı. Bu yöntem kolayca çoğaltılabilir ve karaciğer naklinden sonra ekstrahepatik organların IRI'sını incelemek için de kullanılabilir.

Giriş

İskemi-reperfüzyon hasarı (IRI) karaciğer nakli sonrası sık görülen bir komplikasyondur. Hepatik IRI, iskemi aracılı hücre hasarı ve karaciğer reperfüzyonunun anormal bozulmasını içeren patolojik bir süreçtir. Hepatik IRI ve lokal doğuştan gelen immün yanıt, klinik ortamdaki farklılıklara göre sıcak ve soğuk IRI olarak ayrılabilir1. Sıcak IRI, genellikle karaciğer nakli, şok ve travma sonucu kök hücre yaralanması ile indüklenmiştir2. Soğuk IRI, endotel hücrelerinin ve periferik dolaşımın neden olduğu karaciğer naklinin bir komplikasyonudur3. Klinik raporlar hepatik IRI'nın erken organ yetmezliklerinin% 10'unun ile ilişkili olduğunu ve akut ve kronik ret insidansını artırabileceğini göstermiştir4,5. Ek olarak, hepatik IRI ayrıca yüksek mortalite ile çoklu organ disfonksiyonu sendromlarına veya sistemik inflamatuar yanıt sendromuna neden olabilir6. Ekstrahepatik organ tutulumu olan hastalar hastanede daha uzun süre kalma, daha fazla para harcama ve daha kötü bir prognoza sahip olma eğilimindedir7. Komplikasyonların gelişimi karaciğer naklinin anhepatik fazının uzunluğu ile yakından ilgilidir8.

Sıçanlarda ortotopik karaciğer nakli (OLT) ilk olarak 1973 yılında Amerikalı profesör Lee tarafından bildirilmiştir. Deneysel operasyon, dikiş yöntemini kullanarak klinik karaciğer naklinin adımlarını ve kan damarlarının anastomozini ve ortak safra kanalını (CBD) simüle etti. Prosedür zor ve zaman alıcıdır düşük bir başarı oranı ile9. 1979'da Kamada ve arkadaşları, 26 dakika içinde anhepatik fazı kontrol etmek için portal damarın anastomoz için 'iki manşet yöntemini' yaratıcı bir şekilde kullanarak sıçanlarda OLT'de önemli bir gelişme yaptı10. Aynı yıl Zimmermann 'tek safra stenti yöntemini' önerdi. Lee'nin çalışmalarına dayanarak Zimmermann, donörün ve alıcının CBD'sini doğrudan anastomoz etmek için polietilen tüpler kullandı, CBD'nin yeniden inşasını basitleştirdi ve sfinkterin işlevini korudu ve bu yöntem OLT modellerinin safra rekonstrüksiyonu için standart haline geldi11. 1980'de Miyata ve arkadaşları portal damar (PV), suprahepatik vena kava (SVC) ve intrahepatik vena kavanın (IVC) manşet yöntemiyle anastomoz edildiği 'üç manşet yöntemini' önerdi. Bununla birlikte, bu yöntemle damarın bozulma riski vardır, bu da inferior vena kava reflüsünün tıkanmasına yol açabilir12. 1983'te, PV ve IVC'nin anastomoz için manşet yöntemi kullanılarak, ancak SVC13için dikiş yönteminin benimsenmesi için 'iki manşet yöntemi' önerildi. Bu yöntem olt modelleri oluşturmak için küresel olarak akademisyenler tarafından benimsenmiştir. O zamandan beri, manşet anastomoz adımları anhepatik fazı kısaltmak ve sıçanların hayatta kalma oranını iyileştirmek için geliştirilmiştir14. Benzer şekilde, klinik uygulamada anhepatik faz15'ikısaltmak için geliştirilmiş yöntemler kullanılır. Bununla birlikte, karaciğer naklinden sonra IRI'ya yapılan temel araştırmalar, sağkalım oranının ekstrahepatik organların yaralanma derecesi ile ters ilişkili olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, daha fazla araştırma yapılması ve karaciğer naklinden sonra IRI'yı simüle etmek için basit ve tekrarlanabilir bir hayvan modeline ihtiyaç vardır.

Anhepatik fazın tanımına dayanarak, karaciğer transplantasyonundaki hemodinamik değişiklikleri simüle ettik ve sıçanlarda ekstrahepatik organların IRI'sı ile sonuçlandı. Burada, karaciğer naklinden sonra IRI ile ilgili temel araştırmaları kolaylaştırmak için sıçanlarda anhepatik fazın (karaciğer iskemisi) bir hayvan modelinin nasıl inşa edeceğine dair ayrıntılı bir açıklama sunuyoruz.

Protokol

Hayvan Etik Kurulu, Guangxi Tıp Üniversitesi'nin (No20190920) deneyini onayladı. Tüm hayvanlar Guangxi Tıp Üniversitesi Hayvan Deney Merkezi tarafından tedarik edildi. 25 ± 2°C oda sıcaklığında tutulan ve %50 ± 10 nem oranına sahip SPF erkek Sprague Dawley sıçanları (200-250 g, 10-12 hafta) kullandık. Beslenme operasyondan 24 saat önce durduruldu; ancak su sağlandı.

NOT: Bir operatör tüm ameliyatları mikrocerrahi temeli veya cerrahi mikroskop olmadan gerçekleştirebilir.

1. Operasyon

  1. Tartımdan sonra, sıçanları izofluran ile uyuşturun (%5) bir hayvan anestezi makinesi kullanarak.
  2. 1-2 dakika sonra, sıçanın toynaklarını cımbızla hafifçe kenetleyin. Sıçan çimdikledikten sonra yanıt vermezse, anestezi durumuna girmiştir. Kuruluğu önlemek için gözlerde veteriner merhem kullanın. Sıçanların vücut sıcaklığını 37-38 ° C'de tutmak için hayvan ısıtma lambaları kullanın.
  3. Karın dezenfeksiyonu (povidone iyot çözeltisi) sonrasında, sıçanı hayvan diseksiyon masasına sabitleyin. Dikinç ve makas kullanarak xiphoid işleminin 3 cm altında ortanca bir kesi yapın.
  4. Karın boşluğunu açın, karaciğeri bir retraktör kullanarak ortaya çıkarın ve hepatogastrik bağı harekete geçirin. Karaciğerin orta lobunun hafifçe çevrilmek ve porta hepatis'i açığa çıkarmak için yukarı doğru çevirmek için pamuklu çubuklar kullanın. CBD, PV ve HA'yı tanımlayın.
  5. İnce bağırsağı pamuklu çubuklar kullanarak sol alt karın boşluğuna doğru itin, ıslak gazlı bezle örtün ve intrahepatik vena kavayı sağ böbrek damarına taşıyın.
  6. Portal damarı, hepatik arteri ve alt vena kavayı sağ böbrek damarının üzerinde göz içi lensi ve her biri kayma düğümü olan 3-0 ipek iplikle işaretlenmiş önseçimlerle izole edin.
  7. Sol ve sağ alt ekstremite derisini kesin ve oftalmik toksinler kullanarak femoral damarı ortaya çıkarın. Tüm vücudu heparize etmek için femoral damardan düşük moleküler ağırlıklı heparin 625 IU/ kg'ı yavaşça enjekte edin.
  8. Portal damarı, hepatik arteri ve alt vena kavasını 45 dakika süren 3-0 numaralı dikişlerle sağ böbrek damarının üzerinde lige alın (Şekil 1). Karın boşluğundaki ince bağırsağı değiştirin ve gazlı bezle örtün. Bu dönemlerde inhalasyon anesteziyi azaltın.
  9. 45 dakika sonra, portal damarı, hepatik arteri ve sağ böbrek damarının üstündeki alt vena kavayı serbest bırakın.
  10. Kası ve cildi kat kat dikin ve inhalasyon anestezisini sonlandırın. Her 4 saatte bir 5 mg/kg'lık deri altı morfin kullanarak postoperatif analjezi sağlayın.
  11. Sıçanı uyanana kadar gözlemleyin ve 25 ± 2 ° C sıcaklık ve 50 ±% 10 nem altında besleyin. Hayvan ısıtma lambaları gereklidir.

Sonuçlar

Sıçanların karaciğer iskemisine toleransı
Bu hayvan modelinde, ameliyat sırasında kan damarlarının lige edildiği bölgeler Şekil 1'de gösterilmiştir. Sıçanlar rastgele 15 dakika (I15 grubu), 30 dakika (I30 grubu), 45 dakika (I45 grubu), 60 dakika (I60) ve sham grubu için 5 gruba ayrıldı ve her grupta 10 sıçan vardı. Her grubun sağkalım oranı operasyondan 14 gün sonra gözlendi. Tüm sıçanlar I15 grubunda, I30 grubunda ve sahte grupta hayatta kal...

Tartışmalar

Sıçanlarda OLT karaciğer nakli, IRI, nakil reddi, immün tolerans, transplantasyon patolojisi ve farmakoloji, homotransplantasyon ve ksenotransplantasyonda organ koruma çalışmaları için ideal bir modeldir. Günümüzde karaciğer naklinin deneysel araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır.

Pilot çalışmalar sırasında ilk olarak pentobarbital sodyum intraperitoneal anestezi uyguladık ve bunun yüksek postoperatif mortaliteye ve hemodinamik değişikliklere kısa toleran...

Açıklamalar

Bu makalenin yazarlarının açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Guangxi Tıp Üniversitesi İkinci Bağlı Hastanesi'nden Dr. Wen-tao Li ve Dr. Ji-hua Wu tarafından verilen yararlı önerileri kabul etmek istiyoruz. Yazarlar yararlı yorumlar ve tartışmalar için ekip arkadaşlarımıza teşekkür eder. Yazarlar ayrıca JoVE'nin anonim yorumcularına ve editörlerine yorumları için teşekkür eder. Sürekli destekleri ve teşvikleri için Dr. Yuan'ın ailesine özel teşekkürler verilmelidir. Çalışma Ningbo Doğa Bilimleri Vakfı (2014A610248) tarafından desteklendi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
4% paraformaldehyde solutionShanghai Macklin Biochemical Co.,LtdP804536
air drying ovenShanghai Binglin Electronic Technology Co., Ltd.BPG
Alanine aminotransferase (ALT)KitElabscience Biotechnology Co.,LtdE-BC-K235-S
ammoniaSinopharm Chemical Reagents Co. Ltd10002118
amylase KitElabscience Biotechnology Co.,LtdE-BC-K005-M
anhydrous ethanolSinopharm Chemical Reagents Co. Ltd100092183
Animal anesthesia machineShenzhen Ruiwode Life Technology Co. LtdR640
aspartate aminotransferase (AST)kitRayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd.S03040
automatic biochemical analyzer.SIEMENS AG FWB:SIE, NYSE:SI Co., Ltd.2400
Biosystems (when nessary)Chengdu Taimeng Electronics Co., Ltd.BL-420F
CentrifugeBaiyang Medical Instrument Co., Ltd.BY-600A
cover glassJiangsu Shitai Experimental Equipment Co. Ltd10212432C
creatinine KitRayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd.S03076
dewatering machineHungary 3DHISTECH Co.,LtdDonatello Series 2
embedding machineHubei Xiaogan Kuohai Medical Technology Co., Ltd.KH-BL1
frozen machineWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-L5
hematoxylin-eosin dye solutionWuhan Saiwell Biotechnology Co., LtdG1005
high-efficiency paraffin waxShanghai huayong paraffin wax co., LtdQ/YSQN40-91
hydrochloric acidSinopharm Chemical Reagents Co. Ltd10011018
intraocular lens (IOL)forcepsGuangzhou Guangmei Medical Equipment Co., Ltd.JTZRN
IsofluraneShenzhen Ruiwode Life Technology Co. Ltd—
micro Scissors(when nessary)Shanghai Surgical Instrument FactoryWA1010
needle holdersShanghai Surgical Instrument FactoryJ32010
neutral gumShanghai Huashen Healing Equipment Co.,Ltd.—
normal optical microscopeNikon Instrument Shanghai Co., LtdNikon Eclipse CI
ophthalmic forcepsShanghai Surgical Instrument FactoryJ3CO30straight
ophthalmic forcepsShanghai Surgical Instrument FactoryJD1060bending
ophthalmic ScissorsShanghai Surgical Instrument FactoryJ1E0
pathological slicerShanghai Leica Instrument Co., LtdRM2016
pipettesDragon Laboratory Instruments Co., Ltd.7010101008
retractorsBeijing Jinuotai Technology Development Co.,Ltd.JNT-KXQ
scannerHungary 3DHISTECH Co.,LtdPannoramic 250
slideWuhan Saiwell Biotechnology Co., LtdG6004
xyleneSinopharm Chemical Reagents Co. Ltd1330-20-7

Referanslar

  1. Dar, W. A., Sullivan, E., Byon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms. Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).
  2. Qiao, P. F., Yao, L., Zhang, X. C., Li, G. D., Wu, D. Q. Heat shock pretreatment improves stem cell repair following ischemia-reperfusion injury via autophagy. World Journal of Gastroenterology. 21 (45), 12822-12834 (2015).
  3. Liu, Y., et al. Activation of YAP attenuates hepatic damage and fibrosis in liver ischemia-reperfusion injury. Journal of Hepatology. 71 (4), 719-730 (2019).
  4. Hirao, H., Dery, K. J., Kageyama, S., Nakamura, K., Kupiec-Weglinski, J. W. Heme Oxygenase-1 in liver transplant ischemia-reperfusion injury: From bench-to-bedside. Free Radical Biology and Medicine. 157, 75-82 (2020).
  5. Motiño, O., et al. Protective role of hepatocyte cyclooxygenase-2 expression against liver ischemia-reperfusion injury in mice. Hepatology. 70 (2), 650-665 (2019).
  6. Guo, W. A. The search for a magic bullet to fight multiple organ failure secondary to ischemia/reperfusion injury and abdominal compartment syndrome. Journal of Surgical Research. 184 (2), 792-793 (2013).
  7. Elham, M., Mahmoudi, M., Nassiri-Toosi, M., Baghfalaki, T., Zeraati, H. Post liver transplantation survival and related prognostic factors among adult recipients in tehran liver transplant center; 2002-2019. Archives of Iranian Medicine. 1 (23), 326-334 (2020).
  8. Kim, E. H., Ko, J. S., Gwak, M. S., Lee, S. K., Kim, G. S. Incidence and clinical significance of hyperfibrinolysis during living donor liver transplantation. Blood Coagulation and Fibrinolysis. 29 (3), 322-326 (2018).
  9. Czigány, Z. Improving research practice in rat orthotopic and partial orthotopic liver transplantation: a review, recommendation, and publication guide. European Surgical Research. 55 (1-2), 119-138 (2015).
  10. Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28 (1), 47-50 (1979).
  11. Zimmermann, F. A., et al. Techniques for orthotopic liver transplantation in the rat and some studies of the immunologic responses to fully allogeneic liver grafts. Transplantation Proceedings. 11 (1), 571-577 (1979).
  12. Miyata, M., Fischer, J. H., Fuhs, M., Isselhard, W., Kasai, Y. A simple method for orthotopic liver transplantation in the rat. Cuff technique for three vascular anastomoses. Transplantation. 30 (5), 335-338 (1980).
  13. Kamada, N. A., Calne, R. Y. Surgical experience with five hundred thirty liver transplants in the rat. Surgery. 93 (1), 64-69 (1983).
  14. Yang, L. F., et al. A rat model of orthotopic liver transplantation using a novel magnetic anastomosis technique for suprahepatic vena cava reconstruction. Journal of Visualized Experiments. 19 (133), e56933 (2018).
  15. Liu, L. X., He, C., Huang, T., Gu, J. Development of a new technique for reconstruction of hepatic artery during liver transplantation in sprague-dawley rat. PLoS One. 10 (12), 0145662 (2015).
  16. Paller, M. S., Hoidal, J. R., Ferris, T. F. Oxygen free radicals in ischemic acute renal failure In the rat. Journal of Clinical Investigation. 74 (4), 1156-1164 (1984).
  17. Schmidt, J., Lewandrowsi, K., Warshaw, A. L., Compton, C. C., Rattner, D. W. Morphometric characteristics and homogeneity of a new model of acute pancreatitis in the rat. International Journal of Pancreatology. 12 (1), 41-51 (1992).
  18. Chui, C. J., McArdle, A. H., Brown, R., Scott, H. J., Gurd, F. N. Intestinal mucosal lesion in low-flow states. I. A morphological, hemodynamic, and metabolic reappraisal. Archives of Surgery. 101 (4), 478-483 (1970).
  19. Kozian, A., et al. One-lung ventilation induces hyperfusion and alveolar damage in the ventilated lung:an experimental study. British Journal of Anaesthesia. 100 (4), 549-559 (2008).
  20. Shimada, S., et al. Heavy water (D2O) containing preservation solution reduces hepatic cold preservation and reperfusion injury in an isolated perfused rat liver (IPRL) model. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1818 (2019).
  21. Nakamura, K. Sirtuin 1 attenuates inflammation and hepatocellular damage in liver transplant ischemia/reperfusion: from mouse to human. Liver Transplantation. 23 (10), 1282-1293 (2017).
  22. Blaire, A., et al. Surgical Considerations of Hilar Cholangiocarcinoma. Surgical Oncology Clinics of North America. 28 (4), 601-617 (2019).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 169Hayvan modeliAnhepatik Fazskemi reperf zyon yaralanmasOrtotopik karaci er nakli

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır