OrganIschemia-Reperfusion Verletzung durch Simulation hämodynamischer Veränderungen im Lebertransplantationsmodell der Ratte

Zusammenfassung

Dieses Papier enthält eine detaillierte Beschreibung, wie man ein Tiermodell der anhepatischen Phase (Leberischämie) bei Ratten baut, um die Grundlagenforschung zur Ischämie-Reperfusionsverletzung nach einer Lebertransplantation zu erleichtern.

Zusammenfassung

Orthotopische Lebertransplantation (OLT) bei Ratten ist ein bewährtes Tiermodell, das für präoperative, intraoperative und postoperative Studien verwendet wird, einschließlich Ischämie-Reperfusionsverletzungen (IRI) von extrahepatischen Organen. Dieses Modell erfordert zahlreiche Experimente und Geräte. Die Dauer der anhepatischen Phase hängt eng mit der Zeit zusammen, iri nach der Transplantation zu entwickeln. In diesem Experiment verwendeten wir hämodynamische Veränderungen, um extrahepatische Organschäden bei Ratten zu induzieren und die maximale Toleranzzeit zu bestimmen. Die Zeit bis zur schwersten Organverletzung variierte für verschiedene Organe. Diese Methode kann leicht repliziert werden und kann auch verwendet werden, um IRI der extrahepatischen Organe nach lebertransplantation zu studieren.

Einleitung

Ischämie-Reperfusionsverletzung (IRI) ist eine häufige Komplikation nach Lebertransplantation. Hepatische IRI ist ein pathologischer Prozess mit Ischämie-vermittelten Zellschäden und abnormale Verschlechterung der Leberreperfusion. Leber-IRI und die lokale angeborene Immunantwort können in heiße und kalte IRI unterteilt werden, je nach Unterschieden in der klinischen Umgebung¹. Hot IRI wird durch Stammzellverletzungen induziert, in der Regel als Folge von Lebertransplantation, Schock und Trauma². Cold IRI ist eine Komplikation der Lebertransplantation, die durch Endothelzellen und periphere Zirkulation verursacht wird³. Klinische Berichte haben gezeigt, dass Leber IRI mit 10% der frühen Organversagen verbunden ist und kann die Inzidenz von akuter und chronischer Abstoßung erhöhen^4,5. Darüber hinaus kann Leber IRI auch mehrere Organdysfunktionssyndrome oder systemische Entzündliche Reaktionssyndrom induzieren, mit hoher Mortalität⁶. Patienten mit extrahepatischer Organbeteiligung neigen dazu, länger im Krankenhaus zu bleiben, mehr Geld auszugeben und eine schlechtere Prognose⁷zu haben. Die Entwicklung von Komplikationen ist eng mit der Länge der anhepatischen Phase der Lebertransplantation⁸verbunden.

Orthotopische Lebertransplantation (OLT) bei Ratten wurde erstmals 1973 vom amerikanischen Professor Lee berichtet. Die experimentelle Operation simulierte die Schritte der klinischen Lebertransplantation und die Anastomose der Blutgefäße und den gemeinsamen Gallengang (CBD) mit der Nahtmethode. Das Verfahren ist schwierig und zeitaufwändig mit einer geringen Erfolgsrate⁹. 1979 verbesserten Kamada et al. olT bei Ratten deutlich, indem sie kreativ die "Zwei-Manschetten-Methode" für anastomose der Portalvene nutzten, um die anhepatische Phase innerhalb von 26 Minuten¹⁰zu kontrollieren. Im selben Jahr schlug Zimmermann die "Single Biliary Stent-Methode" vor. Auf der Grundlage von Lees Arbeit verwendete Zimmermann Polyethylenrohre, um das CBD des Spenders und Empfängers direkt zu anastomose, vereinfachte die Rekonstruktion von CBD und bewahrte die Funktion des Schließmuskels, und diese Methode wurde zum Standard für die Gallenrekonstruktion der OLT-Modelle¹¹. 1980 schlugen Miyata et al. die "Drei-Manschetten-Methode" vor, bei der die Portalvene (PV), die suprahepatische Vena cava (SVC) und die intrahepatische Vena cava (IVC) durch die Manschettenmethode anastomosed wurden. Es besteht jedoch die Gefahr einer Verzerrung der Kanüle mit dieser Methode, die zur Obstruktion eines minderwertigen Vena-Cava-Refluxs¹²führen kann. 1983 wurde die "Zwei-Manschetten-Methode" mit der Manschettenmethode für die Anastomose der PV und IVC vorgeschlagen, aber die Nahtmethode für den SVC¹³übernommen. Diese Methode wurde von Wissenschaftlern weltweit angenommen, um OLT-Modelle zu etablieren. Seitdem wurden die Anastomoseschritte der Manschette verbessert, um die anhepatische Phase zu verkürzen und die Überlebensrate der Ratten¹⁴zu verbessern. In ähnlicher Weise werden verbesserte Methoden in der klinischen Praxis verwendet, um die anhepatische Phase¹⁵zu verkürzen. Die Grundlagenforschung zu IRI nach einer Lebertransplantation hat jedoch gezeigt, dass die Überlebensrate umgekehrt mit dem Grad der Verletzung von extrahepatischen Organen zusammenhängt. Daher ist weitere Forschung erforderlich, und ein einfaches und reproduzierbares Tiermodell ist erforderlich, um IRI nach einer Lebertransplantation zu simulieren.

Basierend auf der Definition der anhepatischen Phase simulierten wir die hämodynamischen Veränderungen in der Lebertransplantation, die zu IRI von extrahepatischen Organen bei Ratten führten. Hierin bieten wir eine detaillierte Beschreibung, wie man ein Tiermodell der anhepatischen Phase (Leberischämie) bei Ratten baut, um die Grundlagenforschung zu IRI nach einer Lebertransplantation zu erleichtern.

Protokoll

Die Tierethikkommission genehmigte das Experiment der Guangxi Medical University (No20190920). Alle Tiere wurden vom Animal Experiment Center der Guangxi Medical University versorgt. Wir verwendeten SPF Männchen Sprague Dawley Ratten (200-250 g, 10-12 Wochen), gehalten unter der Raumtemperatur von 25 ± 2°C und Feuchtigkeit von 50 ± 10%. Die Fütterung wurde 24 Stunden vor dem Betrieb gestoppt; wasserversorgt war.

HINWEIS: Ein Bediener kann alle Operationen ohne Mikrochirurgie oder chirurgisches Mikroskop durchführen.

1. Betrieb

1. Nach dem Wiegen die Ratten mit Isofluran ansien (5%) mit einer Tieranästhesiemaschine.
2. Nach 1-2 Minuten die Zehen der Ratte vorsichtig mit einer Pinzette einklemmen. Wenn die Ratte nach dem Kneifen nicht reagiert, ist sie in einen Zustand der Anästhesie eingetreten. Verwenden Sie Tierarzt Salbe auf den Augen, um Trockenheit zu verhindern. Verwenden Sie Tierheizungslampen, um die Körpertemperatur der Ratten bei 37-38 °C zu halten.
3. Nach der Abdominaldesinfektion (Povidon-Jodlösung) die Ratte auf dem Tierseziertisch fixieren. Machen Sie einen mittleren Schnitt von 3 cm unter dem xiphoiden Prozess mit Zangen und Schere.
4. Öffnen Sie die Bauchhöhle, setzen Sie die Leber mit einem Retraktor aus und mobilisieren Sie das hepatogastrische Band. Verwenden Sie Wattestäbchen, um den mittleren Lappen der Leber sanft umzudrehen und drehen Sie ihn nach oben, um die Porta hepatis freizulegen. Identifizieren Sie CBD, PV und HA.
5. Schieben Sie den Dünndarm mit Wattestäbchen in Richtung der linken unteren Bauchhöhle, bedecken Sie ihn mit nasser Gaze und bewegen Sie die intrahepatische Vena cava in die rechte Nierenvene.
6. Isolieren Sie die Portalvene, die Leberarterie und die untere Vena cava oberhalb der rechten Nierenvene mit einer Intraokularlinse und Zangen, die mit 3-0 Seidenfaden markiert sind, jeweils mit einem Schlupfknoten.
7. Schneiden Sie die linke und rechte untere Extremität san und belichten Sie die Oberschenkelvene mit ophthalmologischen Zangen. Injizieren Sie langsam niedermolekulares Heparin 625 I.E./kg durch die Femoralvene, um den ganzen Körper zu heparinisieren.
8. Ligate die Portalvene, Leberarterie, und unterlegene Vena Cava über der rechten Nierenvene mit Nr. 3-0 Nähte, dauere 45 Minuten (Abbildung 1). Ersetzen Sie den Dünndarm in der Bauchhöhle und bedecken Sie ihn mit Gaze. Reduzieren Sie die Inhalationsanästhesie während dieser Perioden.
9. Nach 45 Minuten, lassen Sie die Portalvene, leberarteriende arterien, und die unterlegene Vena cava über der rechten Nierenvene.
10. Den Muskel und die Haut schichtenund befolgen und die inhalative Anästhesie beenden. Stellen Sie postoperative Analgesie mit subkutanem Morphin von 5 mg/kg alle 4 Stunden zur Verfügung.
11. Beobachten Sie die Ratte, bis sie wach ist, und füttern Sie sie unter einer Temperatur von 25 ± 2 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 50 ± 10 %. Tierheizungslampen sind notwendig.

Ergebnisse

Rattentoleranz gegenüber Leber-Ischämie
In diesem Tiermodell sind die Stellen, an denen Blutgefäße während des Betriebs ligiert wurden, in Abbildung 1dargestellt. Die Ratten wurden nach dem Zufallsprinzip in 5 Gruppen für Ischämie für 15 Minuten (I15-Gruppe), 30 Minuten (I30-Gruppe), 45 Minuten (I45-Gruppe), 60 Minuten (I60) und Scheingruppe mit 10 Ratten in jeder Gruppe eingeteilt. Die Überlebensrate jeder Gruppe wurde 14 Tage nach der Operation beobachtet. Alle...

Diskussion

OLT bei Ratten ist ein ideales Modell für die Untersuchung der Organkonservierung bei Lebertransplantation, IRI, Transplantationsabstoßung, Immuntoleranz, Transplantationspathologie und Pharmakologie, Homotransplantation und Xenotransplantation. Derzeit ist es weit verbreitet in der experimentellen Forschung der Lebertransplantation verwendet.

Während Pilotstudien verabreichten wir zunächst pentobarbitales Natriumintraperitonealanästhesie und fanden heraus, dass dies zu einer hohen postop...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde solution	Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd	P804536
air drying oven	Shanghai Binglin Electronic Technology Co., Ltd.	BPG
Alanine aminotransferase (ALT)Kit	Elabscience Biotechnology Co.,Ltd	E-BC-K235-S
ammonia	Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd	10002118
amylase Kit	Elabscience Biotechnology Co.,Ltd	E-BC-K005-M
anhydrous ethanol	Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd	100092183
Animal anesthesia machine	Shenzhen Ruiwode Life Technology Co. Ltd	R640
aspartate aminotransferase (AST)kit	Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd.	S03040
automatic biochemical analyzer.	SIEMENS AG FWB:SIE, NYSE:SI Co., Ltd.	2400
Biosystems (when nessary)	Chengdu Taimeng Electronics Co., Ltd.	BL-420F
Centrifuge	Baiyang Medical Instrument Co., Ltd.	BY-600A
cover glass	Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co. Ltd	10212432C
creatinine Kit	Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd.	S03076
dewatering machine	Hungary 3DHISTECH Co.,Ltd	Donatello Series 2
embedding machine	Hubei Xiaogan Kuohai Medical Technology Co., Ltd.	KH-BL1
frozen machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-L5
hematoxylin-eosin dye solution	Wuhan Saiwell Biotechnology Co., Ltd	G1005
high-efficiency paraffin wax	Shanghai huayong paraffin wax co., Ltd	Q/YSQN40-91
hydrochloric acid	Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd	10011018
intraocular lens (IOL)forceps	Guangzhou Guangmei Medical Equipment Co., Ltd.	JTZRN
Isoflurane	Shenzhen Ruiwode Life Technology Co. Ltd	—
micro Scissors(when nessary)	Shanghai Surgical Instrument Factory	WA1010
needle holders	Shanghai Surgical Instrument Factory	J32010
neutral gum	Shanghai Huashen Healing Equipment Co.,Ltd.	—
normal optical microscope	Nikon Instrument Shanghai Co., Ltd	Nikon Eclipse CI
ophthalmic forceps	Shanghai Surgical Instrument Factory	J3CO30	straight
ophthalmic forceps	Shanghai Surgical Instrument Factory	JD1060	bending
ophthalmic Scissors	Shanghai Surgical Instrument Factory	J1E0
pathological slicer	Shanghai Leica Instrument Co., Ltd	RM2016
pipettes	Dragon Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101008
retractors	Beijing Jinuotai Technology Development Co.,Ltd.	JNT-KXQ
scanner	Hungary 3DHISTECH Co.,Ltd	Pannoramic 250
slide	Wuhan Saiwell Biotechnology Co., Ltd	G6004
xylene	Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd	1330-20-7