Lesão por Isquemia-Reperfusão de Órgãos simulando alterações hemodinâmicas no modelo de transplante de fígado de rato

Resumo

Este artigo fornece uma descrição detalhada de como construir um modelo animal da fase anháptica (isquemia hepática) em ratos para facilitar a pesquisa básica sobre a lesão isquemia-reperfusão após o transplante hepático.

Resumo

O transplante hepático ortotópico (OLT) em ratos é um modelo animal testado e comprovado usado para estudos pré-operatórios, intraoperatórios e pós-operatórios, incluindo lesão isquemia-reperfusão (IRI) de órgãos extraháticos. Este modelo requer inúmeros experimentos e dispositivos. A duração da fase anháptica está intimamente relacionada com o tempo de desenvolvimento do IRI após o transplante. Neste experimento, usamos alterações hemodinâmicas para induzir danos extraháticos de órgãos em ratos e determinamos o tempo máximo de tolerância. O tempo até a lesão mais grave do órgão variou para diferentes órgãos. Este método pode ser facilmente replicado e também pode ser usado para estudar IRI dos órgãos extrahápticos após o transplante de fígado.

Introdução

A lesão por isquemia-reperfusão (IRI) é uma complicação comum após o transplante de fígado. Hepatic IRI é um processo patológico que envolve danos celulares mediados por isquemia e deterioração anormal da reperfusão hepática. O IRI hepático e a resposta imune inata local podem ser divididos em IRI quente e frio, de acordo com diferenças no ambiente clínico¹. O IRI quente é induzido por lesão de células-tronco, geralmente como resultado de transplante de fígado, choque e trauma². O IRI frio é uma complicação do transplante hepático causado por células endoteliais e circulação periférica³. Relatórios clínicos mostraram que o IRI hepático está associado a 10% das falências precoces de órgãos e pode aumentar a incidência de rejeição aguda e crônica^4,5. Além disso, o IRI hepático também pode induzir síndromes de disfunção múltipla de órgãos ou síndrome de resposta inflamatória sistêmica, com alta mortalidade⁶. Pacientes com envolvimento extrahático de órgãos tendem a ficar mais tempo no hospital, gastar mais dinheiro e ter um prognóstico pior⁷. O desenvolvimento de complicações está intimamente relacionado com a duração da fase anháptica do transplante hepático⁸.

O transplante de fígado ortotópico (OLT) em ratos foi relatado pela primeira vez pelo professor americano Lee em 1973. A operação experimental simulou os passos do transplante clínico de fígado e a anastomose dos vasos sanguíneos e do ducto biliar comum (CBD) utilizando o método de sutura. O procedimento é difícil e demorado com uma baixa taxa de sucesso⁹. Em 1979, Kamada et al. fizeram uma melhoria significativa no OLT em ratos, usando criativamente o "método de duas algemas" para a anastomose da veia portal para controlar a fase anháptica dentro de 26 minutos¹⁰. No mesmo ano, Zimmermann propôs o "método único de stent biliar". Com base no trabalho de Lee, Zimmermann usou tubos de polietileno para anastomosar diretamente o CBD do doador e do receptor, simplificou a reconstrução do CBD, e preservou a função do esfíncter, e este método tornou-se padrão para reconstrução biliar dos modelos OLT¹¹. Em 1980, Miyata et al. propuseram o "método de três punhos" onde a veia portal (PV), vena cava suprahepática (SVC) e vena cava intraháptica (IVC) foram anastomosadas pelo método da braçadeira. No entanto, há risco de distorção da cânula com este método, o que pode levar à obstrução do refluxo inferior vena cava¹². Em 1983, foi proposto o "método de duas algemas" utilizando o método de manguito para anastomose do PV e IVC, mas adotando o método de sutura para o SVC¹³. Esse método foi adotado por estudiosos globalmente para estabelecer modelos OLT. Desde então, as etapas de anastomose da braçadeira foram melhoradas para encurtar a fase anháptica e melhorar a taxa de sobrevivência dos ratos¹⁴. Da mesma forma, métodos aprimorados são utilizados na prática clínica para encurtar a fase anháptica¹⁵. No entanto, pesquisas básicas sobre o IRI após o transplante de fígado mostraram que a taxa de sobrevivência está inversamente relacionada ao grau de lesão a órgãos extrahepticos. Portanto, mais pesquisas são necessárias, e um modelo animal simples e reprodutível é necessário para simular IRI após o transplante de fígado.

Com base na definição da fase anháptica, simulamos as alterações hemodinâmicas no transplante hepático resultando em IRI de órgãos extrahêmáticos em ratos. Aqui, fornecemos uma descrição detalhada de como construir um modelo animal da fase anhóptica (isquemia hepática) em ratos para facilitar a pesquisa básica sobre o IRI após o transplante de fígado.

Protocolo

O Comitê de Ética Animal aprovou o experimento da Universidade Médica de Guangxi (No20190920). Todos os animais foram fornecidos pelo Centro de Experimentos Animais da Universidade Médica de Guangxi. Usamos ratos sprague dawley macho sprague (200-250 g, 10-12 semanas), mantidos sob a temperatura ambiente de 25 ± 2°C e umidade de 50 ± 10%. A alimentação foi interrompida 24 horas antes da operação; no entanto, a água foi fornecida.

NOTA: Um operador pode realizar todas as operações sem uma base de microcirurgia ou microscópio cirúrgico.

1. Operação

1. Após a pesagem, anestesia os ratos com isoflurane (5%) usando uma máquina de anestesia animal.
2. Após 1-2 minutos, aperte suavemente os dedos do rato com pinças. Se o rato não responder depois de beliscar, ele entrou em um estado de anestesia. Use pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento. Use lâmpadas de aquecimento animal para manter a temperatura corporal dos ratos em 37-38 °C.
3. Após a desinfecção abdominal (solução de iodo povidone), fixar o rato na mesa de dissecção animal. Faça uma incisão mediana de 3 cm abaixo do processo xifoide usando fórceps e tesouras.
4. Abra a cavidade abdominal, exponha o fígado usando um retrátil e mobilize o ligamento hepatogástrico. Use cotonetes de algodão para virar o lobo médio do fígado suavemente e vire-o para cima para expor a porta hepatis. Identifique o CBD, PV e HA.
5. Empurre o intestino delgado em direção à cavidade abdominal inferior esquerda usando cotonetes de algodão, cubra-o com gaze molhada e mova a veia intrahpática cava para a veia renal direita.
6. Isole a veia portal, a artéria hepática, e a veia cava inferior acima da veia renal direita com uma lente intraocular e fórceps marcados com fio de seda 3-0, cada um com um nó de deslizamento.
7. Corte a pele da extremidade inferior esquerda e direita e exponha a veia femoral usando fórceps oftálmicos. Injete lentamente heparina de baixo peso molecular 625 UI/kg através da veia femoral para heparinar todo o corpo.
8. Ligate a veia portal, artéria hepática e veia cava inferior acima da veia renal direita com suturas nº 3-0, com duração de 45 minutos(Figura 1). Substitua o intestino delgado na cavidade abdominal e cubra-o com gaze. Reduza a anestesia da inalação durante esses períodos.
9. Após 45 minutos, solte a veia portal, artéria hepática e a veia cava inferior acima da veia renal direita.
10. Suturar o músculo e a pele, camada por camada, e terminar a anestesia inalatória. Forneça analgesia pós-operatória usando morfina subcutânea de 5 mg/kg a cada 4 horas.
11. Observe o rato até que ele esteja acordado e se alimente sob uma temperatura de 25 ± 2 °C e umidade de 50 ± 10%. Lâmpadas de aquecimento animal são necessárias.

Resultados

Tolerância dos ratos à isquemia hepática
Neste modelo animal, os locais em que os vasos sanguíneos foram ligados durante a operação são mostrados na Figura 1. Os ratos foram divididos aleatoriamente em 5 grupos para isquemia por 15 minutos (grupo I15), 30 minutos (grupo I30), 45 minutos (grupo I45), 60 minutos (I60) e grupo falso, com 10 ratos em cada grupo. A taxa de sobrevivência de cada grupo foi observada 14 dias após a operação. Todos os ratos sobreviveram...

Discussão

OLT em ratos é um modelo ideal para estudar a preservação de órgãos em transplante hepático, IRI, rejeição de transplantes, tolerância imunológica, patologia de transplante e farmacologia, homotransplantação e xenotransplante. Atualmente, é amplamente utilizado na pesquisa experimental de transplante de fígado.

Durante os estudos-piloto, primeiro administramos anestesia intraperitoneal de sódio pentobarbital e descobrimos que isso levou à alta mortalidade pós-operatória e à ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde solution	Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd	P804536
air drying oven	Shanghai Binglin Electronic Technology Co., Ltd.	BPG
Alanine aminotransferase (ALT)Kit	Elabscience Biotechnology Co.,Ltd	E-BC-K235-S
ammonia	Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd	10002118
amylase Kit	Elabscience Biotechnology Co.,Ltd	E-BC-K005-M
anhydrous ethanol	Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd	100092183
Animal anesthesia machine	Shenzhen Ruiwode Life Technology Co. Ltd	R640
aspartate aminotransferase (AST)kit	Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd.	S03040
automatic biochemical analyzer.	SIEMENS AG FWB:SIE, NYSE:SI Co., Ltd.	2400
Biosystems (when nessary)	Chengdu Taimeng Electronics Co., Ltd.	BL-420F
Centrifuge	Baiyang Medical Instrument Co., Ltd.	BY-600A
cover glass	Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co. Ltd	10212432C
creatinine Kit	Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd.	S03076
dewatering machine	Hungary 3DHISTECH Co.,Ltd	Donatello Series 2
embedding machine	Hubei Xiaogan Kuohai Medical Technology Co., Ltd.	KH-BL1
frozen machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-L5
hematoxylin-eosin dye solution	Wuhan Saiwell Biotechnology Co., Ltd	G1005
high-efficiency paraffin wax	Shanghai huayong paraffin wax co., Ltd	Q/YSQN40-91
hydrochloric acid	Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd	10011018
intraocular lens (IOL)forceps	Guangzhou Guangmei Medical Equipment Co., Ltd.	JTZRN
Isoflurane	Shenzhen Ruiwode Life Technology Co. Ltd	—
micro Scissors(when nessary)	Shanghai Surgical Instrument Factory	WA1010
needle holders	Shanghai Surgical Instrument Factory	J32010
neutral gum	Shanghai Huashen Healing Equipment Co.,Ltd.	—
normal optical microscope	Nikon Instrument Shanghai Co., Ltd	Nikon Eclipse CI
ophthalmic forceps	Shanghai Surgical Instrument Factory	J3CO30	straight
ophthalmic forceps	Shanghai Surgical Instrument Factory	JD1060	bending
ophthalmic Scissors	Shanghai Surgical Instrument Factory	J1E0
pathological slicer	Shanghai Leica Instrument Co., Ltd	RM2016
pipettes	Dragon Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101008
retractors	Beijing Jinuotai Technology Development Co.,Ltd.	JNT-KXQ
scanner	Hungary 3DHISTECH Co.,Ltd	Pannoramic 250
slide	Wuhan Saiwell Biotechnology Co., Ltd	G6004
xylene	Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd	1330-20-7