Lesión de isquemia-reperfusión de órganos mediante la simulación de cambios hemodinámicos en el modelo de trasplante de hígado de rata

Resumen

Este trabajo proporciona una descripción detallada de cómo construir un modelo animal de la fase anhepática (isquemia hepática) en ratas para facilitar la investigación básica sobre lesiones por isquemia-reperfusión después del trasplante de hígado.

Resumen

El trasplante ortotópico de hígado (OLT) en ratas es un modelo animal probado y probado utilizado para estudios preoperatorios, intraoperatorios y postoperatorios, incluyendo lesiones por isquemia-reperfusión (IRI) de órganos extrahepáticos. Este modelo requiere numerosos experimentos y dispositivos. La duración de la fase anhepática está estrechamente relacionada con el tiempo para desarrollar IRI después del trasplante. En este experimento, utilizamos cambios hemodinámicos para inducir daño extrahepático de órganos en ratas y determinamos el tiempo máximo de tolerancia. El tiempo hasta la lesión orgánica más grave varió para diferentes órganos. Este método se puede replicar fácilmente y también se puede utilizar para estudiar IRI de los órganos extrahápticos después del trasplante de hígado.

Introducción

La lesión por isquemia y reperfusión (IRI) es una complicación común después del trasplante de hígado. Hepatic IRI es un proceso patológico que implica daño celular mediado por isquemia y deterioro anormal de la reperfusión hepática. El IRI hepático y la respuesta inmune innata local se pueden dividir en IRI caliente y frío, según las diferencias en el entorno clínico^1. Hot IRI es inducido por lesión de células madre, generalmente como resultado de trasplante de hígado, shock, y trauma^2. Cold IRI es una complicación del trasplante hepático causado por células endoteliales y circulación periférica^3. Los informes clínicos han demostrado que la IRI hepática está asociada con el 10% de las fallas tempranas de órganos y puede aumentar la incidencia de rechazo agudo y crónico^4,5. Además, la IRI hepática también puede inducir múltiples síndromes de disfunción orgánica o síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, con alta mortalidad^6. Los pacientes con afectación extrahéptica de órganos tienden a permanecer más tiempo en el hospital, gastan más dinero y tienen un peor pronóstico^7. El desarrollo de complicaciones está estrechamente relacionado con la duración de la fase anháptica del trasplante hepático^8.

El trasplante ortotópico de hígado (OLT) en ratas fue reportado por primera vez por el profesor estadounidense Lee en 1973. La operación experimental simuló los pasos del trasplante clínico de hígado y la anastomosis de los vasos sanguíneos y el conducto biliar común (CBD) utilizando el método de sutura. El procedimiento es difícil y requiere mucho tiempo con una baja tasa de éxito^9. En 1979, Kamada et al. realizaron una mejora significativa de la OLT en ratas mediante el uso creativo del "método de dos puños" para la anastomosis de la vena del portal para controlar la fase anhepatica dentro de 26 minutos^10. En el mismo año, Zimmermann propuso el "método único de stent biliar". Sobre la base del trabajo de Lee, Zimmermann utilizó tubos de polietileno para anastomosar directamente el CBD del donante y receptor, simplificó la reconstrucción del CBD y conservó la función del esfínter, y este método se convirtió en el estándar para la reconstrucción biliar de los modelos¹¹de OLT. En 1980, Miyata et al. propusieron el «método de tres puños» en el que la vena portal (PV), el cava de vena supraháptica (SVC) y el cava vena intraháptico (CIV) eran anastomosados por el método del manguito. Sin embargo, existe el riesgo de distorsión de la cánula con este método, que puede conducir a la obstrucción del reflujo inferior de vena cava^12. En 1983, se propuso el «método de dos puños» utilizando el método del manguito para la anastomosis de la PV y el CIV, pero adoptando el método de sutura para el SVC¹³. Este método fue adoptado por académicos a nivel mundial para establecer modelos OLT. Desde entonces, se han mejorado los pasos de anastomosis del manguito para acortar la fase anhepática y mejorar la tasa de supervivencia de las ratas^14. Del mismo modo, métodos mejorados se utilizan en la práctica clínica para acortar la fase anhepática^15. Sin embargo, la investigación básica sobre la IRI después del trasplante hepático ha demostrado que la tasa de supervivencia está inversamente relacionada con el grado de lesión en los órganos extrahápticos. Por lo tanto, se requiere más investigación, y se necesita un modelo animal simple y reproducible para simular IRI después del trasplante de hígado.

Basándonos en la definición de la fase anhepática, simulamos los cambios hemodinámicos en el trasplante de hígado que resultan en IRI de órganos extrahápticos en ratas. En este documento, proporcionamos una descripción detallada de cómo construir un modelo animal de la fase anhepatica (isquemia hepática) en ratas para facilitar la investigación básica en IRI después del trasplante hepático.

Protocolo

El Comité de Ética Animal aprobó el experimento de la Universidad Médica guangxi (nº20190920). Todos los animales fueron suministrados por el Centro de Experimentación Animal de la Universidad Médica de Guangxi. Utilizamos ratas Sprague Dawley macho Sprague (200-250 g, 10-12 semanas), mantenidas bajo la temperatura ambiente de 25 ± 2°C y humedad de 50 ± 10%. La alimentación se detuvo 24 horas antes de la operación; sin embargo, se proporcionó agua.

NOTA: Un operador puede realizar todas las operaciones sin una base de microcirugía o microscopio quirúrgico.

1. Operación

1. Después de pesar, anestesiar a las ratas con isoflurano (5%) utilizando una máquina de anestesia animal.
2. Después de 1-2 minutos, sujete suavemente los dedos de los dedos de los dedos de la rata con pinzas. Si la rata no responde después de pellizcar, ha entrado en un estado de anestesia. Utilice ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad. Utilice lámparas de calefacción animal para mantener la temperatura corporal de las ratas a 37-38 °C.
3. Después de la desinfección abdominal (solución de yodo povidone), fije la rata en la mesa de disección animal. Haga una incisión mediana de 3 cm por debajo del proceso xifoide utilizando fórceps y tijeras.
4. Abra la cavidad abdominal, exponga el hígado con un retractor y movilice el ligamento hepatogástrico. Use hisopos de algodón para voltear suavemente el lóbulo medio del hígado y girarlo hacia arriba para exponer los hepatis porta. Identifique el CBD, pv y HA.
5. Empuje el intestino delgado hacia la cavidad abdominal inferior izquierda usando hisopos de algodón, cúbralo con gasa húmeda y mueva el cava de vena intraháptica a la vena renal derecha.
6. Aísle la vena del portal, la arteria hepática y el cava de vena inferior por encima de la vena renal derecha con una lente intraocular y fórceps marcados con hilo de seda 3-0, cada uno con un nudo deslizante.
7. Abra la piel de las extremidades inferiores izquierda y derecha y exponga la vena femoral con fórceps oftálmicos. Inyectar lentamente heparina de bajo peso molecular 625 UI/kg a través de la vena femoral para heparinizar todo el cuerpo.
8. Ligar la vena del portal, la arteria hepática y el cava de vena inferior por encima de la vena renal derecha con suturas no. 3-0, con una duración de 45 minutos(Figura 1). Reemplace el intestino delgado en la cavidad abdominal y cúbralo con gasa. Reduzca la anestesia por inhalación durante estos períodos.
9. Después de 45 minutos, libere la vena del portal, la arteria hepática y el cava de vena inferior por encima de la vena renal derecha.
10. Suturar el músculo y la piel, capa por capa, y terminar la anestesia inhalacional. Proporcionar analgesia postoperatoria utilizando morfina subcutánea de 5 mg/kg cada 4 horas.
11. Observe a la rata hasta que esté despierta y alimente bajo una temperatura de 25 ± 2 °C y humedad de 50 ± 10%. Las lámparas de calefacción de animales son necesarias.

Resultados

Tolerancia de las ratas a la isquemia hepática
En este modelo animal, los sitios en los que los vasos sanguíneos fueron ligados durante el funcionamiento se muestran en la Figura 1. Las ratas se dividieron aleatoriamente en 5 grupos por isquemia durante 15 minutos (grupo I15), 30 minutos (grupo I30), 45 minutos (grupo I45), 60 minutos (I60) y grupo sham, con 10 ratas en cada grupo. La tasa de supervivencia de cada grupo se observó 14 días después de la operación. To...

Discusión

OLT en ratas es un modelo ideal para estudiar la preservación de órganos en trasplante de hígado, IRI, rechazo de trasplante, tolerancia inmune, patología de trasplante y farmacología, homotransplantación y xenotrasplantación. En la actualidad, es ampliamente utilizado en la investigación experimental del trasplante de hígado.

Durante los estudios piloto, primero administramos anestesia intraperitoneal de sodio pentobarbital y encontramos que esto condujo a una alta mortalidad postope...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde solution	Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd	P804536
air drying oven	Shanghai Binglin Electronic Technology Co., Ltd.	BPG
Alanine aminotransferase (ALT)Kit	Elabscience Biotechnology Co.,Ltd	E-BC-K235-S
ammonia	Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd	10002118
amylase Kit	Elabscience Biotechnology Co.,Ltd	E-BC-K005-M
anhydrous ethanol	Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd	100092183
Animal anesthesia machine	Shenzhen Ruiwode Life Technology Co. Ltd	R640
aspartate aminotransferase (AST)kit	Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd.	S03040
automatic biochemical analyzer.	SIEMENS AG FWB:SIE, NYSE:SI Co., Ltd.	2400
Biosystems (when nessary)	Chengdu Taimeng Electronics Co., Ltd.	BL-420F
Centrifuge	Baiyang Medical Instrument Co., Ltd.	BY-600A
cover glass	Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co. Ltd	10212432C
creatinine Kit	Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd.	S03076
dewatering machine	Hungary 3DHISTECH Co.,Ltd	Donatello Series 2
embedding machine	Hubei Xiaogan Kuohai Medical Technology Co., Ltd.	KH-BL1
frozen machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-L5
hematoxylin-eosin dye solution	Wuhan Saiwell Biotechnology Co., Ltd	G1005
high-efficiency paraffin wax	Shanghai huayong paraffin wax co., Ltd	Q/YSQN40-91
hydrochloric acid	Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd	10011018
intraocular lens (IOL)forceps	Guangzhou Guangmei Medical Equipment Co., Ltd.	JTZRN
Isoflurane	Shenzhen Ruiwode Life Technology Co. Ltd	—
micro Scissors(when nessary)	Shanghai Surgical Instrument Factory	WA1010
needle holders	Shanghai Surgical Instrument Factory	J32010
neutral gum	Shanghai Huashen Healing Equipment Co.,Ltd.	—
normal optical microscope	Nikon Instrument Shanghai Co., Ltd	Nikon Eclipse CI
ophthalmic forceps	Shanghai Surgical Instrument Factory	J3CO30	straight
ophthalmic forceps	Shanghai Surgical Instrument Factory	JD1060	bending
ophthalmic Scissors	Shanghai Surgical Instrument Factory	J1E0
pathological slicer	Shanghai Leica Instrument Co., Ltd	RM2016
pipettes	Dragon Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101008
retractors	Beijing Jinuotai Technology Development Co.,Ltd.	JNT-KXQ
scanner	Hungary 3DHISTECH Co.,Ltd	Pannoramic 250
slide	Wuhan Saiwell Biotechnology Co., Ltd	G6004
xylene	Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd	1330-20-7