التعرض لدخان السجائر في الفئران باستخدام نظام استنشاق الجسم كله

Daniel E. Morales-Mantilla; Xinyan Huang; Philip Erice; Paul Porter; Yun Zhang; Mary Figueroa; Joya Chandra; Katherine Y. King; Farrah Kheradmand; Antony Rodríguez

doi:10.3791/61793

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

يوضح هذا البروتوكول دراسة الآثار المرضية الفسيولوجية لدخان السجائر (CS) مع نظام التعرض لاستنشاق الجسم بالكامل (WBI) (WBIS) الذي تم بناؤه داخليا. يمكن لهذا النظام أن يعرض الحيوانات ل CS في ظل ظروف قابلة للتكرار خاضعة للرقابة للبحث عن الآثار بوساطة CS على انتفاخ الرئة وورم الدم.

Abstract

أفادت التقارير أن ما يقرب من 14٪ من البالغين في الولايات المتحدة يدخنون السجائر في عام 2018. وقد درست آثار دخان السجائر (CS) على الرئتين وأمراض القلب والأوعية الدموية على نطاق واسع، ومع ذلك، فإن تأثير CS في الأنسجة والأعضاء الأخرى مثل الدم ونخاع العظام لا تزال محددة بشكل غير كامل. ويمكن أن يكون إيجاد النظام المناسب لدراسة آثار CS في القوارض مكلفا للغاية ويتطلب شراء أنظمة متاحة تجاريا. وهكذا ، شرعنا في بناء نظام بأسعار معقولة وموثوق بها وتنوعا لدراسة الآثار المرضية لل CS في الفئران. هذا النظام التعرض استنشاق الجسم كله (WBIS) انشاء يحاكي التنفس والنفخ من السجائر عن طريق التعرض بالتناوب ل CS والهواء النقي. هنا نظهر أن هذا النظام افعل ذلك بنفسك (DIY) يحفز التهاب مجرى الهواء وانتفاخ الرئة في الفئران بعد 4 أشهر من التعرض لدخان السجائر. كما تظهر آثار استنشاق الجسم كله (WBI) من CS على الخلايا الجذعية والذرية الدموية (HSPCs) في نخاع العظام باستخدام هذا الجهاز.

Introduction

تدخين السجائر لا يزال واحدا من الأسباب الرئيسية للأمراض التي يمكن الوقاية منها في الولايات المتحدة على الرغم من الانخفاض المطرد في عدد البالغين الذين يدخنون السجائر في السنوات ال 50-60^{الماضية 1}. ومن المعروف على نطاق واسع أن التدخين يرتبط بأمراض متعددة في الرئتين والدم بما في ذلك مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD) ، وهي مجموعة من الأمراض التي تشمل انتفاخ الرئة والتهاب الشعب الهوائية المزمن²^،³^،⁴. وفقا لمركز السيطرة على الأمراض (CDC) ، في عام 2014 ، كان مرض الانسداد الرئوي المزمن ثالث سبب رئيسي للوفاة في الولايات المتحدة مع أكثر من 15 مليون أمريكي يعانون من هذا المرض^5.

كما ارتبطت CS مؤخرا بارتفاع خطر الإصابة بالهيماتوبويز (CH)⁶^،⁷، وهي حالة تنتج فيها خلية جذعية دموية واحدة بشكل غير متناسب نسبة كبيرة من الدم المحيطي للشخص. تشير هذه النتيجة إلى وجود صلة محتملة بين التدخين ووظيفة نخاع العظم. وبالنظر إلى الآثار الصحية الواسعة النطاق والكبيرة للغاية المترتبة على CS وبالنظر إلى أن نماذج المورفين للأمراض هي حجر الزاوية للتقدم في البحوث الطبية الحيوية ، فمن المفيد تطوير أنظمة فعالة وبأسعار معقولة لنموذج CS في الفئران.

هنا، ونحن نقدم دليل خطوة بخطوة لبناء نظام بأسعار معقولة لعلاج ودراسة الآثار في الجسم الحي من CS على انتفاخ الرئة وانتفاخ الرئة التوازن. تجميع هذه المعدات لا يتطلب المستخدم أن يكون المعرفة المتخصصة، وبالتالي يسمح للتجميع DIY.

Protocol

جميع الحيوانات المشاركة في التجارب وتطوير هذه التقنية كانت تحت بروتوكول استخدام الحيوان لدينا المعتمدة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه (IACUC) وتحت كلية بايلور للطب ومؤسسات MD أندرسون المعتمدة من قبل جمعية تقييم واعتماد الرعاية الحيوانية المختبرية (AAALAC).

1. بناء الجهاز

تجميع ضاغط الهواء مع نظام الصمام.
1. قم بتوصيل مقاييس التدفق (اثنان 15 لتر/دقيقة مع شريط Y وإقلاع 2 طاقة) بمنظم الضغط المصغر باستخدام تركيب حلمة محول ذكر مترابط مقاس 1/8 بوصة. تأكد من استخدام شريط ختم مؤشر الترابط في كافة النهايات مترابطة.
2. قم بتوصيل منظم الضغط المجمع بمقياس التدفق بأداة ضاغط الهواء الطبية باستخدام ما يلي: حلمة سداسية مقاس 1/8 بوصة على منفذ الهواء الضاغط ، وتركيب اقتران مترابط مقاس 1/8 بوصة ، وتركيب حلمة محول ذكر مترابط مقاس 1/8 بوصة يتصل بمنظم الضغط.
3. تثبيت موصل الشائكة قطب الأكسجين على كل (4) مقياس التدفق.
4. تثبيت محول الذكور على منفذ الهواء الأعلى ضاغط الهواء (جزء المدرجة مع أداة ضاغط الهواء الطبية).
تجميع غرف التعريض الضوئي (إنشاء 4 وحدات)
1. قطع 3/4 بوصة كلوريد البولي فينيل المكلورة (CPVC) الأنابيب إلى ثمانية أجزاء 4 بوصة.
2. إدراج كل قطعة إلى واحد 3/4 بوصة 90° الكوع CPVC المناسب وإرفاق الجانب المناسب من الكوع إلى محول الذكور CPVC قطرها 3/4 بوصة. يجب أن يكون هناك ثمانية شرائح CPVC، كل تعلق على تركيب الكوع CPVC واحد ومحول واحد CPVC الذكور.
3. حفر اثنين من الثقوب (قطر 1 1/4 بوصة) على طرفي نقيض أبعد من بعضها البعض من حاوية محكم 8.5 لتر (11.25 × 7.75 × 6 بوصة) مع غطاء (انظر الشكل 1 غرفة التعرض). تحديد المواقع من الثقوب هو أن تركز من أعلى إلى أسفل ومن اليسار إلى اليمين.
4. إدراج الجوانب المترابطة من محول الذكر CPVC تجميعها قبل في كل ثقب في الحاويات.
5. من داخل الحاوية، نعلق 3/4 بوصة غطاء CPVC على الجانب الآخر (غرفة الدخان المدخلات) و3/4 بوصة CPVC بالتنقيط الري محول الإناث على جانب واحد (غرفة الدخان الناتج).
6. حفر خمسة ثقوب 3 ملم على الجزء العلوي من غطاء CPVC من إخراج الدخان غرفة في نمط quincunx (دش الرأس). وهذا سيسمح لدخان السجائر بدخول الغرفة بسرعة أعلى ويضمن انتشاره بالتساوي داخل الغرفة في جميع الاتجاهات.
تجميع غرف السجائر (تتكون من 4 وحدات تعرض للمورين)
1. خذ سدادة مطاطية ذات ثقب واحد (حجم المصنع 8.5) وأدخل موصل Y شائك مقاس 1/4 بوصة على الجانب الأوسع وتركيب شائك مستقيم (فتحة 8 مم) على الجانب الأضيق. سيتم وضع السيجارة هنا أثناء إجراء التدخين (سند السجائر).
2. ربط نهاية واحدة من أنبوب الفينيل الصف الطبي 12 بوصة طويلة إلى واحدة من الموصلات الشائكة على موصل Y تعلق على سدادة المطاط والطرف الآخر لتركيب 1/4 بوصة وإدراج الجانب الآخر من هذا المناسب على سدادة مطاطية حفرة واحدة (حجم الشركة المصنعة 1).
3. على سدادة مطاطية أخرى (حجم الشركة المصنعة 8.5)، أدخل موصل أنابيب مستقيم 1/4 بوصة على الجانب الأوسع من السدادة وربط الطرف الخارجي من التركيب بأنبوب الفينيل من الدرجة الطبية 7 أقدام.
4. قم بتوصيل هيكلي سدادة المطاط المجمعين من قبل في الخطوات 1.3.1-1.3.3 إلى أسطوانة زجاجية مقاس 8 بوصات × 1.75 بوصة من أنبوب تصريف زجاجي مختبري.
نظام التحكم في الصمام
1. يتم التحكم في النظام عن طريق فتح وإغلاق إيقاعي للصمامات السولينويد التي تحاكي استنشاق (نفخ) دخان السجائر والهواء النقي. تم تصميم النظام الذي يتحكم في الصمامات السولينويد تجاريا (انظر جدول المواد).
تجميع كافة المكونات معا (انظر الشكل 1)
1. جبل أربعة صمامات سولينويد إلى جانبي نظام التحكم في صمام باستخدام السحابات 1 بوصة.
2. قم بتوصيل الصمامات السولينويد بنظام التحكم في الصمام باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
3. إرفاق موصل مستقيم مترابطة 10-32 (M) إلى العادم ("EXH") اتصال على صمام سولينويد ومحول منفذ مترابطة على "IN" و "OUT" اتصالات من نفس صمام سولينويد.
4. قم بتوصيل مقياس التدفق المرفق بالضاغط بالصمام السولينويد من خلال اتصال "OUT" باستخدام أنابيب الفينيل الطبية من الدرجة الطبية التي تصل إلى 7 أقدام.
5. قم بتوصيل أنبوب الفينيل 7 قدم تجميعها مع سدادة المطاط في الخطوة 1.3.3. على موصل "IN" على الصمام السولينويد.
6. أدخل سدادة مطاطية صغيرة من غرفة السجائر على مدخلات دخان الغرفة.
7. قم بتوصيل الصمام السولينويد بالربط الثاني لموصل Y الشائك على القاعدة التمثالية للسجائر التي تم تجميعها في الخطوة 1.3.1.

figure-protocol-4366
الشكل 1: تخطيطي لوصلات نظامنا للتعرض ل CS. يوضح هذا الرقم كيفية تجميع كافة المكونات لتشكيل جهاز عمل. يظهر الشكل غرفة تدخين واحدة فقط مجمعة من الأربعة التي تستطيع الآلة تشغيلها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. التعرض لدخان السجائر

تنبيه: تجنب التعرض لدخان السجائر من جهة ثانية أو ثالثة. وينبغي استخدام غرف السجائر والتعرض داخل خزانات السلامة البيولوجية من النوع الثاني B2 Laminar Flow. وينبغي ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة أثناء إجراء تجارب التعرض للدخان (أي الأقنعة والقفازات وشبكة الشعر والثوب).

ضبط الضغط وتدفق الهواء
1. مرة واحدة يتم تجميع جميع المكونات كما هو مبين في الشكل 1،بدوره على ضاغط الهواء وانتظر إنذار السلامة لإيقاف من تلقاء نفسها.
2. ضبط ضغط ضاغط الهواء إلى 40-50 psi عن طريق تحويل مقبض الباب على منظم الضغط.
3. ضبط تدفق الهواء من ضاغط الهواء إلى 5 لتر باستخدام مقياس التدفق.
4. قم بتشغيل وحدة تحكم الصمام.
5. ضبط المؤقت الرقمي على وحدة تحكم صمام لنبض-C (هو مبين في الشاشة باسم "بو-ج") وضع التشغيل عن طريق الضغط على مفتاح SET / LOCK في حين الضغط باستمرار على مفتاح UP في الرقم الأول من الموقت. ثم اضغط على مفتاح UP حتى يتم الوصول إلى وضع Pu-c. اضغط على مفتاح RESET لتعيين وضع التشغيل المعروض (أي Pu-C) كوضع العمل.
6. اضغط على SET/LOCK لتغيير المؤقت 1 (يظهر في الشاشة ك "T1").
7. اضغط على مفاتيح UP أو DOWN لتعيين T1 إلى 20 s.
8. اضغط على SET/LOCK لتغيير المؤقت 2 (يظهر في الشاشة ك "T2").
9. اضغط على مفاتيح UP أو DOWN لتعيين T2 إلى 3 s.
  ملاحظة: تم تصميم الخطوات من 2.1.5 إلى 2.1.9 ليتم استخدامها مع المؤقت المحدد (راجع جدول المواد). لمزيد من الإرشادات حول الاستخدامات الأخرى لهذا المنتج، راجع دليل المستخدم المطابق له.
علاج دخان السجائر
ملاحظة: يسمح هذا النظام باستخدام غرف التعرض للمورين 1-4 في نفس الوقت.
1. قم بتشغيل ضاغط الهواء وانتظر حتى يتم إيقاف تشغيل إنذار السلامة من تلقاء نفسه.
2. قم بتشغيل وحدة تحكم الصمام.
3. نقل 5 الفئران في كل من غرف التعرض الأربع مع أغطية قابلة للإزالة محكم مع حجم 8.5 L. وضع غرف التعرض الأربع مع الفئران داخل الفئة الثانية B2 Laminar تدفق خزانات السلامة البيولوجية.
4. داخل خزانة السلامة البيولوجية تدفق صفح، تضيء سيجارة وإدراج السجائر داخل غرفة السجائر. استخدام السجائر المتاحة تجاريا والتي تحتوي على 15 ملغ / سيج القطران و 1.1 ملغ / سيج النيكوتين⁸ بالمقارنة مع كنتاكي 3RF4 السجائر البحثية (9.5 ملغ / سيج القطران و 0.73 ملغ / سيج النيكوتين)⁹.
5. قم بتشغيل الصمامات الموجودة على وحدة تحكم الصمام التي تتوافق مع الغرف المستخدمة حاليا. وينقسم التعرض إلى مرحلتين: (T1) يتم ضخ الهواء النقي في غرفة التعرض لمدة 20 s و (T2) تدفق الهواء يسبب السجائر لحرق ويتم ضخ الدخان من غرفة السجائر في غرفة التعرض لمدة 3 ق. السماح للسيجارة لحرق تماما حتى تصل إلى مرشح.
  1. ضبط إعدادات جهاز ضبط الوقت لأداء ما متوسطه 10 نفث / سيجارة على مدى فترة ~ 4 دقائق. لاحظ أن جهاز ضبط الوقت والنظام قابلان للتخصيص بسهولة لتعزيز أو خفض نظام الجرعات CS وفقا لاحتياجات البحث للمحققين.
6. قم بإزالة فلتر السجائر والتخلص منه عن طريق وضع عقب السجائر في كوب زجاجي بالماء لإطفاء اللهب وترطيب الرائحة.
7. تأكد من إغلاق غرفة السجائر مرة أخرى وبدون سيجارة. دع الجهاز يضخ الهواء النقي لمدة 10 دقائق. ومن الأهمية بمكان الحفاظ على الرصد المستمر للحيوانات الفقارية التي تتعرض ل CS. تم تحسين نظام التعريض هذا ل 5 فئران أنثى عمرها أكثر من 9 أسابيع لكل غرفة تعرض.
8. كرر الخطوات من 2.3.4 إلى 2.3.7 ثلاث مرات لما مجموعه 4 سجائر لكل غرفة يوميا. يتكرر هذا الإجراء 5 أيام في الأسبوع طالما يحتاج الباحث لتجاربهم.
9. إزالة الفئران من غرف التعرض مرة أخرى إلى أقفاص المقابلة لها.
10. قم بإيقاف تشغيل وحدة تحكم الصمام وضاغط الهواء.
11. إزالة التعرض وغرف السجائر وغسل بالماء والصابون لإزالة أي بقايا القطران.
12. دع الغرف تجف تماما قبل استخدامها مرة أخرى.

النتائج

واحدة من السمات الرئيسية للتعرض CS هو انتفاخ الرئة التي تتميز الضرر وتدمير الحويصلات الهوائية (الحويصلات الهوائية) في الرئة. وهكذا، ركزت التجارب الأولية على قدرة نظام DIY على إثارة تغييرات انتفاخية في رئتي الفئران الإناث عند التعرض المتكرر لكامل الجسم ل CS. تم اختيار نظام الجرعات CS على أساس م...

Discussion

هنا نقدم المعلومات اللازمة لبناء جهاز لWBIS من الفئران إلى CS. بعد تركيب النظام، من المهم للغاية أن يقوم المحققون بمعايرة النظام على أساس الجرعة المسلمة من النيكوتين أو الكوتينين في الحيوانات. يحتوي الجهاز على جهاز توقيت ومقاييس ضغط يمكن استخدامها لضبط حجم نفخة السجائر ، وتكرار النفخة ، وفت?...

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

تم دعم AR و XH و PE من قبل منحة NIH R01HL140398 ومنحة مؤسسة جيلسون لونغنباو. تم دعم DEMM وKK من قبل المعاهد القومية للصحة منح R01HL136333 و R01HL134880 (KYK) ، ومنحة من مؤسسة هيليس للبحوث الطبية. كما يدعم DEMM من قبل معهد هوارد هيوز الطبي (HHMI) زمالة جيليام للدراسة المتقدمة. ويدعم PE أيضا من خلال التدريب في علوم الصحة البيئية الدقيقة NIEHS T32 ES027801 برنامج الزمالة. يتم دعم JC وMF من قبل صناديق أبحاث التبغ من قسم علم الوراثة اللاجينية والمواد المسرطنة الجزيئية ومركز علم الوراثة اللاجينية (جائزة الباحث إلى MF) في MD Anderson. يتم دعم FK و YZ من قبل المعاهد القومية للصحة منح R01 ES029442-01 وR01 AI135803-01 وكذلك منحة الجدارة VA CX000104. تم دعم هذا المشروع من قبل نواة قياس الخلايا وفرز الخلايا في كلية بايلور للطب بتمويل من جائزة دعم مرفق CPRIT الأساسي (CPRIT-RP180672) والمعاهد القومية للصحة (CA125123 و RR024574) ومساعدة جويل م. سيدرستروم.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 in fastener	Lowes	756990
1/4 in Barbed Y connector	VWR	89093-282
1/4 in straight tubing connector	VWR	62866-378
1/8 hex nipple	Lowes	877221
1/8 in threaded coupling fitting	Lowes	877208
1/8 in threaded male adapter nipple fitting	Lowes	877243
10/32 (M) threaded straight connector	Bimba	EB60
3/4 in 90-degree elbow CPVC fitting	Lowes	22643
3/4 in chlorinated polyvinyl chloride (CPVC) pipe	Lowes	23814
3/4 in CPVC cap	Lowes	23773
3/4 in CPVC Drip irrigation female adapter	Lowes	194629
3/4 in diameter CPVC male adapter	Lowes	23766
8.5 L airtight container with lid (11.25in x 7.75in x 6 in)	Komax	N/A	Listed as "Komax Biokips Large Bread Box \| (280-oz) Large Storage Container"
Glass drain tube (1.75 in diameter x 8 in length)	KIMAX	6500
Isonic Solenoid Valves	Bimba	V2A02-AW1
Marlboro Red 100's	Marlboro	N/A
Oxygen swivel barbed connector	Global Medical Solutions	RES002
Panasonic Timer LT4H-W	Panasonic	LT4HW	Item was built-in the valve controller by Shepherd Controls & Associates
Pressure regulator	Allied Electronics and Automation	70600552	Also listed as "Norgren R07-100-RGKA"
Rubber stopper # 1 (one hole)	VWR	59581-163
Rubber stopper # 8.5 (one hole)	VWR	59581-389
Scireq inExpose system	Scireq and Emka Technologies	N/A	Commercial system used for comparison with our DIY WBIS
Straight barbed fitting (8mm opening)	VWR	10028-872
Thread Sealant tape	Lowes	1184243
Threaded port adaptor	Bimba	P1SA1
Timeter Aridyne 2000 Medical Air Compressor	MFI Medical	AHC-TE20
Timeter flowmeter	Allied Healthcare Products	15006-03YP2	Also listed as "Puritan Air Meter"
Valve Control system	Shepherd Controls and Associates	N/A	Company custom designed the valve control system for this model.
Vinyl pipes	Vitality Medical	RES3007

References

Current Cigarette Smoking Among Adults in the United States. Center for Disease Control and Prevention Available from: https://www.cdc.gov/tobacco/data_statistics/fact_sheets/adult_data/cig_smoking/index.htm (2018)
Salvi, S. Tobacco smoking and evironmental risk factors for chronic obstructive pulmonary disease. Clinics in Chest Medicine. 35, 17-27 (2014).
Sunyer, J., et al. Longitudinal relation between smoking and white blood cells. American Journal of Epidemiology. 144, 734-741 (1996).
Freedman, D. S., Flanders, D., Barboriak, J. J., Malarcher, A. M., Gates, L. Cigarette smoking and leukocyte subpopulations in men. Annals of Epidemiology. 6, 299-306 (1996).
Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD). Center for Disease Control and Prevention Available from: https://www.cdc.gov/copd/basics-about.html (2019)
Genovese, G., et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence. New England Journal of Medicine. , (2014).
Steensma, D. P. Clinical implications of clonal hematopoiesis. Mayo Clinic Proceedings. 93, 1122-1130 (2018).
Tobacco. Federal Trade Comission Available from: https://www.ftc.gov/tips-advice/business-center/selected-industries/tobacco (2020)
3R4F Cigarettes. University of Kentucky - College of Agriculture Food and Environment Available from: https://ctrp.uky.edu/products/gallery/Reference (2020)
Shan, M., et al. Cigarette smoke induction of osteopontin (SPP1) mediates T H 17 inflammation in human and experimental emphysema. Science Translational Medicine. 4, 1-10 (2012).
Yuan, X., et al. Activation of C3a receptor is required in cigarette smoke-mediated emphysema. Nature Mucosal Immunology. 8, 874-885 (2014).
Yuan, X., et al. Cigarette smoke - induced reduction of C1q promotes emphysema. JCI Insight. 4, 1-17 (2019).
Shan, M., et al. Agonistic induction of PPAR g reverses cigarette smoke - induced emphysema Find the latest version: Agonistic induction of PPAR γ reverses cigarette smoke - induced emphysema. Journal of Clinical Investigation. 124, 1371-1381 (2014).
Hong, M. J., et al. Protective role of gd T cells in cigarette smoke and influenza infection. Nature Mucosal Immunology. 11, 834-908 (2018).
Kim, M., et al. Cigarette smoke induces intestinal inflammation via a Th17 cell-neutrophil axis. Frontiers in Immunology. 10, 1-11 (2019).
Lu, W., et al. The microRNA miR-22 inhibits the histone deacetylase HDAC4 to promote T H 17 cell - dependent emphysema. Nature Immunology. 16, 1185-1194 (2015).
Hendrix, A. Y., Kheradmand, F. . The Role of Matrix Metalloproteinases in Development, Repair, and Destruction of the Lungs. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 148, (2017).
Siggins, R. W., Hossain, F., Rehman, T., Melvan, J. N., Welsh, D. A. Cigarette smoke alters the hematopoietic stem cell niche. Med Sci. 2, 37-50 (2014).
Kheradmand, F., You, R., Gu, B. H., Corry, D. B. Cigarette smoke and DNA cleavage promote lung inflammation and emphysema. Transactions of the American Clinical and Climatological Association. 128, 222-233 (2017).
Ha, M. A., et al. Menthol attenuates respiratory irritation and elevates blood cotinine in cigarette smoke exposed mice. PLoS ONE. , 1-16 (2015).
Moreno-Gonzalez, I., Estrada, L. D., Sanchez-Mejias, E., Soto, C. Smoking exacerbates amyloid pathology in a mouse model of Alzheimer's disease. Nature Communications. 4, 1-10 (2013).
Madison, M. C., et al. Electronic cigarettes disrupt lung lipid homeostasis and innate immunity independent of nicotine. Journal of Clinical Investigation. 129, 4290-4304 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

164

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: