חשיפה לעשן סיגריות בעכברים באמצעות מערכת שאיפה לכל הגוף

Daniel E. Morales-Mantilla; Xinyan Huang; Philip Erice; Paul Porter; Yun Zhang; Mary Figueroa; Joya Chandra; Katherine Y. King; Farrah Kheradmand; Antony Rodríguez

doi:10.3791/61793

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

פרוטוקול זה מדגים את המחקר של ההשפעות הפתופיסיולוגיות של עשן סיגריות (CS) עם מערכת חשיפה לכל הגוף (WBIS) (WBIS) מובנית בתוך הבית. מערכת זו יכולה לחשוף בעלי חיים CS בתנאים חוזרים מבוקרים למחקר של השפעות בתיווך CS על אמפיזמה ריאות hematopoiesis.

Abstract

בשנת 2018 דווח כי קרוב ל-14% מהמבוגרים בארצות הברית מעשנים סיגריות. ההשפעות של עשן סיגריות (CS) על ריאות ומחלות לב וכלי דם נחקרו באופן נרחב, עם זאת, ההשפעה של CS ברקמות ואיברים אחרים כגון דם ומח עצם נשארים מוגדרים לחלוטין. מציאת המערכת המתאימה כדי ללמוד את ההשפעות של CS במכרסמים יכול להיות יקר באופן אוסרני ודורש רכישה של מערכות זמינות מסחרית. לכן, יצאנו לבנות מערכת סבירה, אמינה ורב-תכליתית כדי לחקור את ההשפעות הפתולוגיות של CS בעכברים. מערך זה של חשיפה לשאיפה בכל הגוף (WBIS) מחקה את הנשימה והנפיחות של סיגריות על ידי חשיפה לסירוגין ל- CS ואוויר נקי. כאן אנו מראים כי מערכת עשה זאת בעצמך (DIY) זו גורם דלקת בדרכי הנשימה ואמפיזמה ריאות בעכברים לאחר 4 חודשים של חשיפה לעשן סיגריות. ההשפעות של שאיפת כל הגוף (WBI) של CS על גזע hematopoietic ותאי אב (HSPCs) במח העצם באמצעות מנגנון זה מוצגים גם.

Introduction

עישון סיגריות נותר אחד הגורמים העיקריים למחלות הניתנות למניעה בארה"ב למרות הירידה המתמדת במספר המבוגרים המעשנים סיגריות ב -50-60 השנים^{האחרונות 1}. זה ידוע כי עישון קשור למחלות מרובות של הריאות והדם כולל מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), קבוצה של מחלות הכוללת נפחת ברונכיטיס כרונית²^,³^,⁴. על פי המרכז לבקרת מחלות (CDC), בשנת 2014, COPD היה הגורם השלישי המוביל למוות בארצות הברית עם מעל 15 מיליון אמריקאים הסובלים ממחלה זו⁵.

CS גם נקשר לאחרונה עם סיכון גבוה יותר לפתח hematopoiesis שיבוט (CH)⁶^,⁷, מצב שבו תא גזע hematopoietic יחיד מייצר באופן לא פרופורציונלי אחוז גדול של הדם ההיקפי של אדם. ממצא זה מצביע על קשר פוטנציאלי בין עישון לתפקוד מח עצם. בהתחשב בהשלכות הבריאותיות הנרחבות והמשמעותיות ביותר של CS ובהתחשב בכך שמודלים מוריניים של מחלות הם אבן יסוד בהתקדמות במחקר הביו-רפואי, כדאי לפתח מערכות יעילות ובמחיר סביר לדגם CS בעכברים.

כאן, אנו מספקים מדריך צעד אחר צעד לבניית מערכת סבירה לטיפול וללמוד את ההשפעות in vivo של CS על אמפיזמה ריאות והומאוסטזיס מח עצם. ההרכבה של ציוד זה אינו דורש מהמשתמש ידע מיוחד ובכך מאפשר הרכבה DIY.

Protocol

כל בעלי החיים המעורבים בניסויים ובפיתוח טכניקה זו היו תחת פרוטוקול השימוש בבעלי חיים שלנו שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש בבעלי חיים (IACUC) ותחת מכללת ביילור לרפואה ומוסדות MD Anderson המוכרים על ידי האגודה להערכה והסמכה של טיפול בבעלי חיים במעבדה (AAALAC).

1. בניית המנגנון

הרכבת מדחס האוויר עם מערכת השסתום.
1. חבר את מד הזרימה (שני 15 L / min עם בר Y ו 2 המראות כוח) לווסת הלחץ הזעיר באמצעות התאמת פטמה מתאם זכר 1/8 אינץ'. הקפד להשתמש בקלטת חותם הליך המשנה בכל הקצוות המשורשרים.
2. חבר את וסת הלחץ המורכב עם מד הזרימה למכשיר מדחס האוויר הרפואי באמצעות הדברים הבאים: פטמה משושה בגודל 1/8 אינץ' בשקע האוויר של המדחס, התאמת צימוד חוטים בגודל 1/8 אינץ', והתאמת פטמה של מתאם גברי באורך 1/8 אינץ' המתחברת לווסת הלחץ.
3. התקן את מחבר התיל המסתובב בחמצן בכל (4) מד זרימה.
4. התקן מתאם זכר על שקע האוויר העליון של מדחס האוויר (חלק כלול במכשיר מדחס האוויר הרפואי).
הרכבת תאי חשיפה (לעשות 4 יחידות)
1. חותכים צינור פוליוויניל כלוריד (CPVC) בגודל 3/4 אינץ' לשמונה מקטעים בגודל 4 אינץ'.
2. הכנס כל מקטע אחד 3/4 אינץ ' 90° מרפק CPVC הולם ולחבר את הצד המתאים של המרפק למתאם זכר CPVC בקוטר 3/4 אינץ'. אמורים להיות שמונה מקטעי CPVC, שכל אחד מהם מחובר להתאמת מרפק CPVC אחת ומתאם זכר CPVC אחד.
3. מקדחים שני חורים (קוטר 1/4 אינץ') משני הצדדים הרחוקים ביותר זה מזה של מיכל אטום ב-8.5 ל' (11.25 x 7.75 x 6 אינץ') עם מכסה (ראו איור 1 תא חשיפה). מיקום החורים הוא להיות ממורכז מלמעלה למטה ומשמאל לימין.
4. הכנס את הצדדים המשורשרים של המתאם הזכר CPVC שהורכב לפני כל חור במיכלים.
5. מבפנים של המיכל, לצרף כובע CPVC 3/4 אינץ ' בצד השני (קלט עשן קאמרי) ו 3/4 אינץ CPVC טפטוף השקיה מתאם נקבה בצד אחד (פלט עשן קאמרי).
6. לקדוח חמישה חורים 3 מ"מ בחלק העליון של כובע CPVC של פלט עשן התא בתבנית quincunx (ראש מקלחת). זה יאפשר לעשן הסיגריות להיכנס לתא במהירות גבוהה יותר ויבטיח שהוא יתפשט באופן שווה בתוך התא לכל הכיוונים.
הרכבת תאי סיגריות (מהווה עד 4 יחידות חשיפה למורין)
1. קח פקק גומי של חור אחד (גודל יצרן 8.5) והכנס מחבר Y דוקרני בגודל 1/4 אינץ' בצד הרחב יותר והתאמת דוקרני ישר (פתיחה של 8 מ"מ) בצד הצר יותר. הסיגריה תונח כאן במהלך הליך העישון (עשן סיגריות).
2. חבר קצה אחד של צינור ויניל כיתה רפואית באורך 12 אינץ' לאחד המחברים דוקרני על מחבר Y מחובר פקק הגומי ואת הקצה השני להתאמה 1/4 אינץ 'ולהכניס את הצד הנגדי של התאמה זו על פקק גומי חור אחד (גודל היצרן 1).
3. על פקק גומי אחר (גודל היצרן 8.5), הכנס מחבר צינורות ישר אחד בגודל 1/4 אינץ' בצד הרחב יותר של העצירה וחבר את הקצה החיצוני של ההתאמה לצינור ויניל ברמה רפואית של 7 רגל.
4. חבר את שני מבני פקק הגומי שהורכבו לפני בשלבים 1.3.1-1.3.3 לצילינדר זכוכית בגודל 8 אינץ' x 1.75 אינץ' מצינור ניקוז זכוכית במעבדה.
מערכת בקרת שסתום
1. המערכת נשלטת על ידי פתיחה וסגירה קצבית של שסתומים סולנואידים המדמים שאיפה (נשיפה) של עשן סיגריות ואוויר נקי. המערכת השולטת שסתומים סולנואיד תוכנן מסחרית (ראה טבלה של חומרים).
הרכבת כל הרכיבים יחד (ראו איור 1)
1. הר ארבעה שסתומים סולנואידים לצדדים של מערכת בקרת שסתום באמצעות מהדקים 1 אינץ '.
2. חבר את שסתומי סולנואיד למערכת בקרת שסתום בעקבות הוראות היצרן.
3. חבר מחבר ישר משועבד 10-32 (M) לחיבור הפליטה ("EXH") בשסתום הסולנואיד ומתאם יציאות משורשר בחיבורי "IN" ו- "OUT" של אותו שסתום סולנואיד.
4. חבר את מד הזרימה המחובר למדחס לשסתום סולנואיד באמצעות חיבור "OUT" באמצעות צינורות ויניל ברמה רפואית של 7 רגל.
5. חבר את צינור ויניל 7 רגל התאספו עם פקק הגומי בשלב 1.3.3. על מחבר "IN" על שסתום סולנואיד.
6. הכנס את פקק הגומי הקטן של תא הסיגריות על קלט עשן התא.
7. חבר את שסתום סולנואיד לחיבור השני של מחבר Y דוקרני על הדוכן סיגריה התאספו בשלב 1.3.1.

figure-protocol-3989
איור 1: סכמטי של החיבורים של WBIS שלנו לחשיפה ל- CS. נתון זה מדגים כיצד כל הרכיבים מורכבים כדי ליצור מנגנון עבודה. האיור מראה רק תא עישון אחד מתוך הארבעה שהמכונה מסוגלת להפעיל. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

2. חשיפה לעשן סיגריות

התראה: יש להימנע מחשיפה יד שנייה ושלישית לעשן סיגריות. יש להשתמש בתאי סיגריות וחשיפה בתוך ארונות בטיחות ביולוגיים מסוג B2 Laminar Flow מסוג B2. PPE הנכון צריך להיות משוחק בעת ביצוע ניסויים חשיפה לעשן (כלומר, מסכות, כפפות, רשת שיער, שמלה).

הגדרת לחץ וזרימת אוויר
1. לאחר שכל הרכיבים מורכבים כפי שמוצג באיור 1, הפעילו את מדחס האוויר והמתינו עד שאזעקת הבטיחות תכבה מעצמה.
2. כוונן את הלחץ של מדחס האוויר ל- 40-50 psi על-ידי סיבוב הידית על וסת הלחץ.
3. כוונן את זרימת האוויר ממדחס האוויר ל- 5 L באמצעות מד הזרימה.
4. הפעל את בקר השסתום.
5. התאם את שעון העצר הדיגיטלי בבקר השסתום למצב הפעולה PULSE-C (המוצג בתצוגה כ- "Pu-c") על-ידי הקשה על מקש SET/LOCK תוך החזקת מקש UP לחוץ בספרה הראשונה של שעון העצר. לאחר מכן, הקש על מקש UP עד להגענות למצב Pu-c. הקש על מקש RESET כדי להגדיר את מצב ההפעלה המוצג (כלומר, Pu-C) כמצב העבודה.
6. הקש על SET/LOCK כדי לשנות את שעון העצר 1 (מוצג בצג כ- "T1").
7. הקש על המקשים למעלה או למטה כדי להגדיר T1 עד 20 שניות.
8. הקש על SET/LOCK כדי לשנות את שעון העצר 2 (מוצג בצג כ- "T2").
9. הקש על המקשים למעלה או למטה כדי להגדיר T2 עד 3 שניות.
  הערה: שלבים 2.1.5 עד 2.1.9 מותאמים לשימוש עם שעון העצר הספציפי (ראה טבלת חומרים). לקבלת הוראות נוספות לשימושים אחרים עבור מוצר זה, עיין במדריך למשתמש המתאים לו.
טיפול עשן סיגריות
הערה: מערכת זו מאפשרת שימוש ב-1-4 תאי חשיפה למורין בו זמנית.
1. הפעל את מדחס האוויר ולחכות אזעקת הבטיחות לכבות בכוחות עצמו.
2. הפעל את בקר השסתום.
3. העבר 5 עכברים לתוך כל אחד מארבעת תאי החשיפה עם מכסים נשלפים אטומים עם נפח של 8.5 L. מקם את ארבעת תאי החשיפה בעכברים בתוך ארונות בטיחות ביולוגיים מסוג B2 Laminar Flow מסוג B2.
4. בתוך ארון הבטיחות הביולוגי של זרימת הלמינארי, הדליקו סיגריה והכניסו את הסיגריה לתוך תא הסיגריות. השתמש בסיגריות הזמינות מסחרית המכילות 15 זפת מ"ג/סיג ו-1.1 מ"ג/סיג ניקוטין⁸ בהשוואה לסיגריות מחקר קנטאקי 3RF4 (9.5 מ"ג/סיג זפת ו-0.73 מ"ג/סיג ניקוטין)⁹.
5. הפעל את השסתומים בבקר השסתום התואמים לתאים הנמצאים כעת בשימוש. החשיפה מחולקת לשני שלבים: (T1) אוויר נקי נשאב לתא החשיפה למשך 20 שניות וזרימת האוויר (T2) גורמת לסיגריה לבעור ועשן מתא הסיגריות נשאב לתא החשיפה למשך 3 שניות. אפשר לסיגריה להישרף לחלוטין עד שהיא מגיעה למסנן.
  1. התאם את הגדרות שעון העצר כדי לבצע בממוצע ~ 10 פחזניות / סיגריה על פני תקופה של ~ 4 דקות. שים לב כי טיימר ומערכת ניתנים להתאמה אישית בקלות לשיפור או הנמכה של משטר מינון CS בהתאם לצרכי המחקר של החוקרים.
6. מוציאים את מסנן הסיגריות ונפטרים ממנו על ידי הנחת בדל הסיגריה בשק זכוכית עם מים כדי לכבות את הלהבה ולהפחית את הריח.
7. ודאו שתא הסיגריות סגור שוב וללא סיגריה. תן למכונה לשאוב אוויר נקי במשך 10 דקות. יש חשיבות עליונה לשמירה על ניטור מתמיד של בעלי החוליות החשופים ל- CS. משטר חשיפה זה מותאם ל-5 עכברים נקביים מעל בני 9 שבועות לכל תא חשיפה.
8. חזור על שלבים 2.3.4 עד 2.3.7 שלוש פעמים בסך הכל 4 סיגריות לחדר ביום. הליך זה חוזר על עצמו 5 ימים בשבוע כל עוד החוקר צריך לניסויים שלהם.
9. הסר את העכברים מתאי החשיפה בחזרה לכלובים המתאימים להם.
10. כבה את בקר השסתום ואת מדחס האוויר.
11. הסר את החשיפה ואת תאי הסיגריות ולשטוף עם מים וסבון כדי להסיר כל שאריות של זפת.
12. תן לתאים להתייבש לחלוטין לפני השימוש בהם שוב.

תוצאות

אחד מסימני ההיכר העיקריים של חשיפה ל- CS הוא נפחת המאופיינת בנזק והרס של שקים אוויר (alveoli) בריאה. לכן, הניסויים הראשוניים התמקדו ביכולתה של מערכת עשה זאת בעצמך לעורר שינויים אמפיזמטיים בריאות של עכברים נקביים על חשיפה חוזרת ונשנית של כל הגוף ל- CS. משטר המינון של CS נבחר על סמך הפרסומים הקודמים ?...

Discussion

כאן אנו מספקים את המידע הדרוש לבניית מנגנון עבור WBIS של עכברים ל- CS. לאחר התקנת המערכת, חשוב מאוד שהחוקרים יתכוילו את המערכת על סמך המינון המועבר של ניקוטין או קוטינין בבעלי חיים. המנגנון מכיל טיימר ומדדי לחץ שניתן להשתמש בהם להתאמת נפח נשיפת הסיגריות, תדירות נשיפה, תקופת חשיפה משולבת לעשן ו?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

AR, XH ו- PE נתמכו על ידי מענק NIH R01HL140398 ומענק קרן גילסון לונגנבאו. DEMM ו- KK נתמכו על ידי מענקי NIH R01HL136333 ו- R01HL134880 (KYK), ומענק מקרן המחקר הרפואי הליס. DEMM נתמכת גם על ידי המכון הרפואי ע"ש הווארד יוז (HHMI) גיליאם למחקר מתקדם. PE נתמך גם על ידי הכשרה במדעי בריאות הסביבה דיוק NIEHS T32 ES027801 תוכנית מלגות. JC ו- MF נתמכים על ידי קרנות מחקר טבק מהמחלקה לאפיגנטיקה ומסרטן מולקולרי ועל ידי המרכז לאפיגנטיקה (פרס חוקר ל- MF) ב MD אנדרסון. FK ו- YZ נתמכים על ידי מענקי NIH R01 ES029442-01 ו- R01 AI135803-01 וכן מענק הצטיינות VA CX000104. פרויקט זה נתמך על ידי בסיס Cytometry וליבת מיון תאים במכללת ביילור לרפואה במימון פרס התמיכה במתקן הליבה של CPRIT (CPRIT-RP180672), ה- NIH (CA125123 ו- RR024574), וסיועו של יואל מ. סדרסטרום.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 in fastener	Lowes	756990
1/4 in Barbed Y connector	VWR	89093-282
1/4 in straight tubing connector	VWR	62866-378
1/8 hex nipple	Lowes	877221
1/8 in threaded coupling fitting	Lowes	877208
1/8 in threaded male adapter nipple fitting	Lowes	877243
10/32 (M) threaded straight connector	Bimba	EB60
3/4 in 90-degree elbow CPVC fitting	Lowes	22643
3/4 in chlorinated polyvinyl chloride (CPVC) pipe	Lowes	23814
3/4 in CPVC cap	Lowes	23773
3/4 in CPVC Drip irrigation female adapter	Lowes	194629
3/4 in diameter CPVC male adapter	Lowes	23766
8.5 L airtight container with lid (11.25in x 7.75in x 6 in)	Komax	N/A	Listed as "Komax Biokips Large Bread Box \| (280-oz) Large Storage Container"
Glass drain tube (1.75 in diameter x 8 in length)	KIMAX	6500
Isonic Solenoid Valves	Bimba	V2A02-AW1
Marlboro Red 100's	Marlboro	N/A
Oxygen swivel barbed connector	Global Medical Solutions	RES002
Panasonic Timer LT4H-W	Panasonic	LT4HW	Item was built-in the valve controller by Shepherd Controls & Associates
Pressure regulator	Allied Electronics and Automation	70600552	Also listed as "Norgren R07-100-RGKA"
Rubber stopper # 1 (one hole)	VWR	59581-163
Rubber stopper # 8.5 (one hole)	VWR	59581-389
Scireq inExpose system	Scireq and Emka Technologies	N/A	Commercial system used for comparison with our DIY WBIS
Straight barbed fitting (8mm opening)	VWR	10028-872
Thread Sealant tape	Lowes	1184243
Threaded port adaptor	Bimba	P1SA1
Timeter Aridyne 2000 Medical Air Compressor	MFI Medical	AHC-TE20
Timeter flowmeter	Allied Healthcare Products	15006-03YP2	Also listed as "Puritan Air Meter"
Valve Control system	Shepherd Controls and Associates	N/A	Company custom designed the valve control system for this model.
Vinyl pipes	Vitality Medical	RES3007

References

Current Cigarette Smoking Among Adults in the United States. Center for Disease Control and Prevention Available from: https://www.cdc.gov/tobacco/data_statistics/fact_sheets/adult_data/cig_smoking/index.htm (2018)
Salvi, S. Tobacco smoking and evironmental risk factors for chronic obstructive pulmonary disease. Clinics in Chest Medicine. 35, 17-27 (2014).
Sunyer, J., et al. Longitudinal relation between smoking and white blood cells. American Journal of Epidemiology. 144, 734-741 (1996).
Freedman, D. S., Flanders, D., Barboriak, J. J., Malarcher, A. M., Gates, L. Cigarette smoking and leukocyte subpopulations in men. Annals of Epidemiology. 6, 299-306 (1996).
Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD). Center for Disease Control and Prevention Available from: https://www.cdc.gov/copd/basics-about.html (2019)
Genovese, G., et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence. New England Journal of Medicine. , (2014).
Steensma, D. P. Clinical implications of clonal hematopoiesis. Mayo Clinic Proceedings. 93, 1122-1130 (2018).
Tobacco. Federal Trade Comission Available from: https://www.ftc.gov/tips-advice/business-center/selected-industries/tobacco (2020)
3R4F Cigarettes. University of Kentucky - College of Agriculture Food and Environment Available from: https://ctrp.uky.edu/products/gallery/Reference (2020)
Shan, M., et al. Cigarette smoke induction of osteopontin (SPP1) mediates T H 17 inflammation in human and experimental emphysema. Science Translational Medicine. 4, 1-10 (2012).
Yuan, X., et al. Activation of C3a receptor is required in cigarette smoke-mediated emphysema. Nature Mucosal Immunology. 8, 874-885 (2014).
Yuan, X., et al. Cigarette smoke - induced reduction of C1q promotes emphysema. JCI Insight. 4, 1-17 (2019).
Shan, M., et al. Agonistic induction of PPAR g reverses cigarette smoke - induced emphysema Find the latest version: Agonistic induction of PPAR γ reverses cigarette smoke - induced emphysema. Journal of Clinical Investigation. 124, 1371-1381 (2014).
Hong, M. J., et al. Protective role of gd T cells in cigarette smoke and influenza infection. Nature Mucosal Immunology. 11, 834-908 (2018).
Kim, M., et al. Cigarette smoke induces intestinal inflammation via a Th17 cell-neutrophil axis. Frontiers in Immunology. 10, 1-11 (2019).
Lu, W., et al. The microRNA miR-22 inhibits the histone deacetylase HDAC4 to promote T H 17 cell - dependent emphysema. Nature Immunology. 16, 1185-1194 (2015).
Hendrix, A. Y., Kheradmand, F. . The Role of Matrix Metalloproteinases in Development, Repair, and Destruction of the Lungs. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 148, (2017).
Siggins, R. W., Hossain, F., Rehman, T., Melvan, J. N., Welsh, D. A. Cigarette smoke alters the hematopoietic stem cell niche. Med Sci. 2, 37-50 (2014).
Kheradmand, F., You, R., Gu, B. H., Corry, D. B. Cigarette smoke and DNA cleavage promote lung inflammation and emphysema. Transactions of the American Clinical and Climatological Association. 128, 222-233 (2017).
Ha, M. A., et al. Menthol attenuates respiratory irritation and elevates blood cotinine in cigarette smoke exposed mice. PLoS ONE. , 1-16 (2015).
Moreno-Gonzalez, I., Estrada, L. D., Sanchez-Mejias, E., Soto, C. Smoking exacerbates amyloid pathology in a mouse model of Alzheimer's disease. Nature Communications. 4, 1-10 (2013).
Madison, M. C., et al. Electronic cigarettes disrupt lung lipid homeostasis and innate immunity independent of nicotine. Journal of Clinical Investigation. 129, 4290-4304 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

164 hematopoiesis hematopoietic COPD

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: