JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол демонстрирует изучение патофизиологических эффектов сигаретного дыма (CS) с системой воздействия всего тела (WBI) (WBIS), построенной в доме. Эта система может подвергать животных CS в контролируемых повторяемых условиях для исследования CS-опосредованного воздействия на эмфизему легких и гематопоезии.

Аннотация

Около 14% взрослых в Соединенных Штатах, как сообщается, курят сигареты в 2018 году. Влияние сигаретного дыма (CS) на легкие и сердечно-сосудистые заболевания были широко изучены, однако, влияние CS в других тканях и органах, таких как кровь и костный мозг остаются неполными определены. Поиск соответствующей системы для изучения воздействия CS на грызунов может быть непомерно дорогим и потребовать покупки коммерчески доступных систем. Таким образом, мы приступили к созданию доступной, надежной и универсальной системы для изучения патологических эффектов CS у мышей. Эта система ингаляционного воздействия всего тела (WBIS) имитирует дыхание и пыхтение сигарет путем чередования воздействия CS и чистого воздуха. Здесь мы показываем, что эта сделай сам (DIY) система вызывает воспаление дыхательных путей и эмфиземы легких у мышей после 4-месяцев воздействия сигаретного дыма. Показано также влияние вдыхания всего тела (ВБИ) CS на гематопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники (ГСПК) в костном мозге с помощью этого аппарата.

Введение

Курение сигарет остается одной из основных причин предотвратимых заболеваний в США, несмотря на неуклонное снижение числа курящих сигарет взрослых в последние 50-60 лет1. Широко известно, что курение связано с многочисленными заболеваниями легких икрови,включая хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ), группу заболеваний, которая включает эмфизему и хроническийбронхит 2,3,4. По данным Центра по контролю заболеваний (CDC), в 2014 году ХОБЛ была третьей по счету причиной смерти в Соединенных Штатах с более чем 15 миллионов американцев, страдающих отэтой болезни 5.

CS также недавно был связан с более высоким риском развития клональных гематопоэз (CH)6,7, состояние, при котором одна гематопоэтическая стволовая клетка непропорционально производит большой процент периферической крови человека. Этот вывод указывает на потенциальную связь между курением и функцией костного мозга. Учитывая широко распространенные и весьма значительные последствия для здоровья CS и учитывая, что муриновые модели заболеваний являются краеугольным камнем прогресса в биомедицинских исследованиях, полезно разработать эффективные и доступные системы для моделирования CS у мышей.

Здесь мы предоставляем пошаговое руководство для создания доступной системы для лечения и изучения воздействия in vivo CS на эмфизему легких и гомеостаз костного мозга. Сборка этого оборудования не требует от пользователя специальных знаний и, таким образом, позволяет DIY сборки.

протокол

Все животные, участвующие в экспериментах и разработке этого метода были в соответствии с нашим протоколом использования животных, утвержденных Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) и в Бейлорском медицинском колледже и md Anderson учреждений, которые аккредитованы Ассоциацией по оценке и аккредитации лабораторного ухода за животными (AAALAC).

1. Строительство аппарата

  1. Сборка воздушного компрессора с клапанной системой.
    1. Подключите потокометры (два 15 л/мин с баром Y и 2 силовыми взлетами) к миниатюрной регулятору давления с помощью 1/8-дюймовой резьбовой установки мужского адаптера соска. Убедитесь в том, чтобы использовать ленту уплотнения потока во всех резьбовые концы.
    2. Подключите собранный регулятор давления с flowmeter к медицинскому инструменту компрессора воздуха используя следующее: соск шестиугольного шестиугольки на розетке воздуха компрессора, 1/8 дюйма резьбовая установка соединения, и 1/8 дюйма резьбовой мужской адаптер сосков установки, которая подключается к регулятору давления.
    3. Установите кислородный поворотный колючий разъем на каждом (4) потокометре.
    4. Установите мужской адаптер на верхнюю розетку воздушного компрессора (часть включена в медицинский прибор воздушного компрессора).
  2. Монтаж камер экспозиции (сделать 4 единицы)
    1. Вырезать 3 / 4 дюйма хлорированного поливинилхлорида (CPVC) трубы на восемь 4-дюймовых сегментов.
    2. Вставьте каждый сегмент до одного 3/4 дюйма 90 "локоть CPVC установки и прикрепить установку стороны локтя на 3 / 4 дюйма диаметром CPVC мужской адаптер. Там должно быть восемь сегментов CPVC, каждый прилагается к одной CPVC локоть установки и один CPVC мужской адаптер.
    3. Просверлите два отверстия (диаметр 1 1/4 дюйма) на противоположных сторонах, наиболее удаленных друг от друга герметичного контейнера емкостью 8,5 л (11,25 х 7,75 х 6 дюймов) с крышкой (см. рисунок 1 камеры экспозиции). Позиционирование отверстий должно быть по центру сверху вниз и слева направо.
    4. Вставьте резьбовые стороны мужского адаптера CPVC, собранные ранее, в каждое отверстие в контейнерах.
    5. С внутренней стороны контейнера, приложите 3 / 4 дюйма CPVC крышка с другой стороны (камерный дым вход) и 3 / 4 дюйма CPVC Drip орошения женский адаптер с одной стороны (Камера дыма выход).
    6. Просверлите пять отверстий диаметром 3 мм в верхней части крышки CPVC выходного камерного дыма в узоре quincunx (душевая головка). Это позволит сигаретный дым войти в камеру с более высокой скоростью и гарантирует, что он равномерно распространяется внутри камеры во всех направлениях.
  3. Сборка сигаретных камер (составляет до 4 единиц муриной экспозиции)
    1. Возьмите одноямявую резиновую пробку (размер производителя 8,5) и вставьте 1/4-дюймовый колючий разъем Y на более широкой стороне и прямую колючую установку (8 мм отверстие) на более узкой стороне. Сигарета будет помещена здесь во время процедуры курения (сигаретный пьедестал).
    2. Подключите один конец 12-дюймовой виниловой трубы медицинского класса к одному из колючих разъемов на разъеме Y, прикрепленном к резиновой пробке, а другой конец 1/4-дюймовой фитингу и вставьте противоположную сторону этой установки на одной отверстие резиновой пробки (размер производителя 1).
    3. На другой резиновой пробке (размер производителя 8.5), вставьте один 1/4 дюймовый прямой разъем трубки на более широкой стороне пробки и подключите внешний конец фитинга к 7-футовой медицинской виниловой трубе.
    4. Подключите две резиновые конструкции пробки, собранные ранее в шагах 1.3.1-1.3.3 к 8-дюймовому х 1,75-дюймовому стеклянному цилиндру из лабораторной стеклянной дренажной трубки.
  4. Система управления клапаном
    1. Система управляется ритмичным открытием и закрытием соленоидных клапанов, имитирующих вдыхание (надувку) сигаретного дыма и чистый воздух. Система, ехаемая селеноидными клапанами, была разработана на коммерческой основе (см. таблицу материалов).
  5. Сборка всех компонентов вместе (см. рисунок 1)
    1. Накрепите четыре соленоидных клапана по бокам системы управления клапаном с помощью 1-дюймовых крепежей.
    2. Подключите соленоидные клапаны к системе управления клапаном в соответствии с инструкциями производителя.
    3. Прикрепите 10-32 (M) резьбовой прямой разъем к выхлопной ("EXH") соединение на соленоидный клапан и резьбовой порт адаптер на "IN" и "OUT" соединения того же соленоидного клапана.
    4. Подключите потокометр, прикрепленный к компрессору, к соленоидный клапан через соединение "OUT" с помощью 7-футового медицинского класса виниловых труб.
    5. Подключите 7-футовую виниловую трубку, собранную с резиновой пробкой в шаге 1.3.3. на разъеме "IN" на соленоидном клапане.
    6. Вставьте небольшую резиновую пробку сигаретной камеры на вход камерного дыма.
    7. Подключите соленоидный клапан к второму соединению колючего разъема Y на пьедестале сигарет, собранном в шаге 1.3.1.

figure-protocol-5383
Рисунок 1: Схема связей нашего WBIS для воздействия CS. Эта цифра показывает, как все компоненты собираются для формирования рабочего аппарата. На рисунке показана только одна собранная курительную камеру из четырех, которую машина способна работать. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

2. Воздействие сигаретного дыма

ВНИМАНИЕ: Избегайте воздействия сигаретного дыма с второй и третьей рук. Сигареты и камеры воздействия должны использоваться в шкафах биологической безопасности II типа B2 Laminar Flow. Правильный СИЗ следует носить во время проведения экспериментов воздействия дыма (т.е. маски, перчатки, волосы, платье).

  1. Установка давления и воздушного потока
    1. После того, как все компоненты собраны, как показано на рисунке 1, включите воздушный компрессор и ждать, пока сигнализация безопасности выключится самостоятельно.
    2. Отрегулируйте давление воздушного компрессора до 40-50 пси, повернув ручку на регулятор давления.
    3. Отрегулируйте поток воздуха от воздушного компрессора до 5 л с помощью текутметра.
    4. Включите контроллер клапана.
    5. Отрегулируйте цифровой таймер на контроллере клапана до режима работы PULSE-C (показанный на дисплее как "Pu-c"), нажав клавишу SET/LOCK, удерживая ключ UP на первой цифре таймера. Затем нажмите клавишу UP до тех пор, пока не будет достигнут режим Pu-c. Нажмите клавишу RESET, чтобы настроить отображаемый режим работы (т.е. Pu-C) в качестве рабочего режима.
    6. Нажмите SET/LOCK, чтобы изменить таймер 1 (показанный на дисплее как "T1").
    7. Нажмите клавиши UP или DOWN, чтобы установить T1 до 20 с.
    8. Нажмите SET/LOCK, чтобы изменить таймер 2 (показанный на дисплее как "T2").
    9. Нажмите клавиши UP или DOWN, чтобы установить T2 до 3 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 2.1.5 до 2.1.9 с учетом использования с конкретным таймером (см. таблицу материалов). Дополнительные инструкции по другим использованиям этого продукта можно посмотреть в соответствующем руководстве пользователя.
  2. Обработка сигаретного дыма
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта система позволяет использовать 1-4 камеры воздействия мурина в то же время.
    1. Включите воздушный компрессор и подождите, пока сигнализация безопасности выключится самостоятельно.
    2. Включите контроллер клапана.
    3. Передача 5 мышей в каждой из четырех камер экспозиции с герметичными съемными крышками с объемом 8,5 л. Поместите четыре камеры экспозиции с мышами в классе II типа B2 Laminar Flow Biological Safety Cabinets.
    4. Внутри ламинарного потока биологической безопасности шкаф, зажечь сигарету и вставить сигарету внутри сигаретной камеры. Используйте коммерчески доступные сигареты, которые содержат 15 мг/ cig смолы и 1,1 мг / сигаретникотина 8 по сравнению с Кентукки 3RF4 исследования сигарет (9,5 мг / cig смолы и 0,73 мг / сигарет никотина)9.
    5. Включите клапаны на контроллере клапана, которые соответствуют камерам, которые в настоящее время используются. Экспозиция делится на 2 фазы: (T1) чистый воздух закачивается в камеру экспозиции на 20 с и (T2) воздушный поток вызывает сигарету гореть и дым из сигаретной камеры закачивается в камеру экспозиции в течение 3 с. Разрешить сигарету сгореть полностью, пока не достигнет фильтра.
      1. Отрегулируйте настройки таймера, чтобы выполнить в среднем 10 затяжек/сигареты в течение 4-минутного периода. Обратите внимание, что таймер и система легко настраиваются для повышения или снижения режима дозирования CS в соответствии с исследовательскими потребностями исследователей.
    6. Удалите сигаретный фильтр и утилизировать его, поместив окурок в стеклянный стакан с водой, чтобы потушить пламя и ослабить запах.
    7. Убедитесь, что сигаретная камера снова закрыта и без сигареты. Пусть машина насоса чистый воздух в течение 10 минут. Крайне важно поддерживать постоянный мониторинг позвоночных животных, которые подвергаются воздействию CS. Этот режим разоблачения оптимизирован для 5 самок мышей в течение 9 недель на камеру экспозиции.
    8. Повторите шаги от 2,3,4 до 2,3,7 три раза в общей сложности 4 сигареты на камеру в день. Эта процедура повторяется 5 дней в неделю до тех пор, как исследователь нуждается в их экспериментах.
    9. Удалите мышей из камер экспозиции обратно в соответствующие клетки.
    10. Выключите контроллер клапана и воздушный компрессор.
    11. Удалите экспозицию и сигаретные камеры и мыть водой и мылом, чтобы удалить остатки смолы.
    12. Пусть камеры полностью высохнут, прежде чем использовать их снова.

Результаты

Одной из главных отличительных черт воздействия CS является эмфизема, которая характеризуется повреждением и разрушением воздушных мешков (альвеол) в легких. Таким образом, первоначальные эксперименты сосредоточены на способности системы DIY спровоцировать эмфиземные изменения в легк...

Обсуждение

Здесь мы предоставляем информацию, необходимую для строительства аппарата для WBIS мышей CS. После установки системы крайне важно, чтобы исследователи откалибровали систему на основе дозы никотина или котинина у животных. Аппарат содержит таймер и датчики давления, которые могут быть ис?...

Раскрытие информации

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

AR, XH и PE были поддержаны грантом NIH R01HL140398 и грантом Фонда Гилсона Лонгенбо. DEMM и KK были поддержаны грантами NIH R01HL136333 и R01HL134880 (KYK), а также грантом Фонда медицинских исследований Helis. DEMM также поддерживается Медицинским институтом Говарда Хьюза (HHMI) Гиллиам стипендий для перспективных исследований. PE также поддерживается обучением в области точного экологического здоровья наук NIEHS T32 ES027801 стипендий программы. JC и MF поддерживаются Табачными исследовательскими фондами из Департамента эпигенетики и молекулярного канцерогенеза и Центром эпигенетики (Scholar Award to MF) при докторе Андерсоне. ФК и ЯЗ поддерживаются грантами NIH R01 ES029442-01 и R01 AI135803-01, а также грантом VA Merit CX000104. Этот проект был поддержан Цитометрии и сортировки клеток ядро в Бейлор медицинского колледжа с финансированием от CPRIT Core Facility Support Award (CPRIT-RP180672), NIH (CA125123 и RR024574), а также помощь Джоэл М. Sederstrom.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1 in fastenerLowes756990
1/4 in Barbed Y connectorVWR89093-282
1/4 in straight tubing connectorVWR62866-378
1/8 hex nippleLowes877221
1/8 in threaded coupling fittingLowes877208
1/8 in threaded male adapter nipple fittingLowes877243
10/32 (M) threaded straight connectorBimbaEB60
3/4 in 90-degree elbow CPVC fittingLowes22643
3/4 in chlorinated polyvinyl chloride (CPVC) pipeLowes23814
3/4 in CPVC capLowes23773
3/4 in CPVC Drip irrigation female adapterLowes194629
3/4 in diameter CPVC male adapterLowes23766
8.5 L airtight container with lid (11.25in x 7.75in x 6 in)KomaxN/AListed as "Komax Biokips Large Bread Box | (280-oz) Large Storage Container"
Glass drain tube (1.75 in diameter x 8 in length)KIMAX6500
Isonic Solenoid ValvesBimbaV2A02-AW1
Marlboro Red 100'sMarlboroN/A
Oxygen swivel barbed connectorGlobal Medical SolutionsRES002
Panasonic Timer LT4H-WPanasonicLT4HWItem was built-in the valve controller by Shepherd Controls & Associates
Pressure regulatorAllied Electronics and Automation70600552Also listed as "Norgren R07-100-RGKA"
Rubber stopper # 1 (one hole)VWR59581-163
Rubber stopper # 8.5 (one hole)VWR59581-389
Scireq inExpose systemScireq and Emka TechnologiesN/ACommercial system used for comparison with our DIY WBIS
Straight barbed fitting (8mm opening)VWR10028-872
Thread Sealant tapeLowes1184243
Threaded port adaptorBimbaP1SA1
Timeter Aridyne 2000 Medical Air CompressorMFI MedicalAHC-TE20
Timeter flowmeterAllied Healthcare Products15006-03YP2Also listed as "Puritan Air Meter"
Valve Control systemShepherd Controls and AssociatesN/ACompany custom designed the valve control system for this model.
Vinyl pipesVitality MedicalRES3007

Ссылки

  1. Current Cigarette Smoking Among Adults in the United States. Center for Disease Control and Prevention Available from: https://www.cdc.gov/tobacco/data_statistics/fact_sheets/adult_data/cig_smoking/index.htm (2018)
  2. Salvi, S. Tobacco smoking and evironmental risk factors for chronic obstructive pulmonary disease. Clinics in Chest Medicine. 35, 17-27 (2014).
  3. Sunyer, J., et al. Longitudinal relation between smoking and white blood cells. American Journal of Epidemiology. 144, 734-741 (1996).
  4. Freedman, D. S., Flanders, D., Barboriak, J. J., Malarcher, A. M., Gates, L. Cigarette smoking and leukocyte subpopulations in men. Annals of Epidemiology. 6, 299-306 (1996).
  5. Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD). Center for Disease Control and Prevention Available from: https://www.cdc.gov/copd/basics-about.html (2019)
  6. Genovese, G., et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence. New England Journal of Medicine. , (2014).
  7. Steensma, D. P. Clinical implications of clonal hematopoiesis. Mayo Clinic Proceedings. 93, 1122-1130 (2018).
  8. Tobacco. Federal Trade Comission Available from: https://www.ftc.gov/tips-advice/business-center/selected-industries/tobacco (2020)
  9. 3R4F Cigarettes. University of Kentucky - College of Agriculture Food and Environment Available from: https://ctrp.uky.edu/products/gallery/Reference (2020)
  10. Shan, M., et al. Cigarette smoke induction of osteopontin (SPP1) mediates T H 17 inflammation in human and experimental emphysema. Science Translational Medicine. 4, 1-10 (2012).
  11. Yuan, X., et al. Activation of C3a receptor is required in cigarette smoke-mediated emphysema. Nature Mucosal Immunology. 8, 874-885 (2014).
  12. Yuan, X., et al. Cigarette smoke - induced reduction of C1q promotes emphysema. JCI Insight. 4, 1-17 (2019).
  13. Shan, M., et al. Agonistic induction of PPAR g reverses cigarette smoke - induced emphysema Find the latest version: Agonistic induction of PPAR γ reverses cigarette smoke - induced emphysema. Journal of Clinical Investigation. 124, 1371-1381 (2014).
  14. Hong, M. J., et al. Protective role of gd T cells in cigarette smoke and influenza infection. Nature Mucosal Immunology. 11, 834-908 (2018).
  15. Kim, M., et al. Cigarette smoke induces intestinal inflammation via a Th17 cell-neutrophil axis. Frontiers in Immunology. 10, 1-11 (2019).
  16. Lu, W., et al. The microRNA miR-22 inhibits the histone deacetylase HDAC4 to promote T H 17 cell - dependent emphysema. Nature Immunology. 16, 1185-1194 (2015).
  17. Hendrix, A. Y., Kheradmand, F. . The Role of Matrix Metalloproteinases in Development, Repair, and Destruction of the Lungs. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 148, (2017).
  18. Siggins, R. W., Hossain, F., Rehman, T., Melvan, J. N., Welsh, D. A. Cigarette smoke alters the hematopoietic stem cell niche. Med Sci. 2, 37-50 (2014).
  19. Kheradmand, F., You, R., Gu, B. H., Corry, D. B. Cigarette smoke and DNA cleavage promote lung inflammation and emphysema. Transactions of the American Clinical and Climatological Association. 128, 222-233 (2017).
  20. Ha, M. A., et al. Menthol attenuates respiratory irritation and elevates blood cotinine in cigarette smoke exposed mice. PLoS ONE. , 1-16 (2015).
  21. Moreno-Gonzalez, I., Estrada, L. D., Sanchez-Mejias, E., Soto, C. Smoking exacerbates amyloid pathology in a mouse model of Alzheimer's disease. Nature Communications. 4, 1-10 (2013).
  22. Madison, M. C., et al. Electronic cigarettes disrupt lung lipid homeostasis and innate immunity independent of nicotine. Journal of Clinical Investigation. 129, 4290-4304 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

164

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены