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要約

このプロトコルは、体内に構築された全身吸入(WBI)暴露システム(WBI)を用いたタバコの煙(CS)の病態生理学的影響の研究を示す。このシステムは、肺気腫および造血液に対するCS媒介効果の研究のために、制御された反復可能な条件下で動物をCSにさらす可能性がある。

要約

米国の成人の14%近くが2018年にタバコを吸ったと報告されています。タバコの煙(CS)が肺や心血管疾患に及ぼす影響は広く研究されているが、血液や骨髄などの他の組織や器官におけるCSの影響は未だ完全に定義されていない。げっ歯類のCSの効果を研究するための適切なシステムを見つけることは非常に高価であり、市販のシステムの購入を必要とします。このように、我々は、マウスにおけるCSの病理学的影響を研究するための手頃な価格で信頼性の高い、汎用性の高いシステムを構築することに着手しました。この全身吸入暴露システム(WBIS)のセットアップは、CSときれいな空気への露出を交互にすることによってタバコの呼吸とふくらみを模倣する。ここでは、この日曜大工(DIY)システムが4ヶ月間のタバコの煙暴露の後にマウスの気道炎症および肺気腫を誘発することを示す。この装置を用いた骨髄における造血幹細胞および前駆細胞(HSPCs)に対するCSの全身吸入(WBI)の影響も示されている。

概要

タバコの喫煙は、過去50〜60年の間にタバコを吸う成人の数が着実に減少しているにもかかわらず、米国の予防可能な疾患の主な原因の1つです。喫煙は、慢性閉塞性肺疾患(COPD)を含む肺および血液の複数の疾患に関連していることが広く知られている、肺気腫および慢性気管支炎2、3、4を含む疾患のグループ。米国疾病管理センター(CDC)によると、2014年、COPDは米国で3番目に主要な死因であり、1,500万人以上のアメリカ人がこの病気に苦しんでいました5。

CSはまた最近、クローン造血(CH)6、7、単一の造血幹細胞が不釣り合いに人の末梢血の大部分を産生する状態を発症するリスクが高いと関連している。この知見は、喫煙と骨髄機能との間の潜在的な関係を示す。CSの広範かつ非常に重要な健康への影響を考えると、病気のマウスモデルが生物医学研究の進歩の基礎であることを考えると、マウスのCSをモデル化するための効率的で手頃な価格のシステムを開発することは有用である。

ここでは、肺気腫や骨髄恒常症に対するCSの生体内効果を治療し、研究するための手頃なシステムを構築するためのステップバイステップガイドを提供します。この装置のアセンブリは、ユーザーが専門的な知識を持っている必要はありませんので、DIYアセンブリを可能にします。

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プロトコル

実験とこの技術の開発に関与するすべての動物は、機関動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認された私たちの動物使用プロトコルの下にあり、ベイラー医科大学とMDアンダーソン機関の下で、検査動物ケアの評価と認定協会(AAALAC)によって認定されています。

1. 装置の構築

  1. バルブシステムでエアコンプレッサを組み立てます。
    1. 1/8インチのネジ式男性アダプタニップルフィッティングを使用して、流量計(Yバー付き2つの15 L /分と2つのパワーテイクオフ)をミニチュア圧力レギュレータに接続します。スレッド・シール・テープを、すべてのスレッド・エンドで使用してください。
    2. コンプレッサエアの1/8インチの1/8インチの16進数のニップル、1/8インチのネジ式カップリングフィッティング、圧力レギュレータに接続する1/8インチのスレッド式オスアダプタニップルフィッティングを使用して、組み立てられた圧力レギュレータをフローメーターと医療用エアコンプレッサー機器に接続します。
    3. 酸素スイベル有刺鉄コネクタを各(4)流量計に取り付けます。
    4. エアコンプレッサの上部エアアウトレット(医療用エアコンプレッサー機器に付属の部品)に男性用アダプターを取り付けます。
  2. 露出チャンバの組み立て(4ユニットを作る)
    1. 3/4インチ塩素化ポリ塩化ビニル(CPVC)パイプを8つの4インチセグメントに切ります。
    2. 1つの3/4インチ90°エルボCPVC継手に各セグメントを挿入し、3/4インチの直径CPVCオスアダプターに肘のフィッティング側を取り付けます。8 つの CPVC セグメントがあり、それぞれに 1 つの CPVC エルボ フィッティングと 1 つの CPVC 男性アダプターが取り付けられている必要があります。
    3. 8.5 L気密容器(11.25 x 7.75 x 6インチ)の反対側に2つの穴(1 1/4インチの直径)を蓋付きにドリルします( 図1 露光室を参照)。穴の位置は、上から下、左から右に中央に配置されます。
    4. 前に組み立てられたCPVCオスアダプタのネジ面をコンテナの各穴に挿入します。
    5. 容器の内側から、反対側に3/4インチのCPVCキャップ(チェンバースモーク入力)と3/4インチCPVC点滴灌漑女性アダプタを片側に取り付けます(チェンバースモーク出力)。
    6. チャンバーの煙出力のCPVCキャップの上部に5つの3mmの穴をクインキュックス(シャワーヘッド)パターンでドリルします。これにより、タバコの煙がより速くチャンバーに入り、チャンバー内を全方向に均等に広がるようにします。
  3. タバコ室の組み立て(最大4つのマウス暴露ユニットを構成)
    1. 1ホールのゴム栓(メーカーサイズ8.5)を取り、広い側に1/4インチの有刺鉄線Yコネクタを挿入し、狭い側にストレート有刺鉄線のフィッティング(8mm開口部)を挿入します。喫煙手続き(タバコ台座)の間に、タバコはここに置かれます。
    2. 長さ12インチの医療グレードのビニールパイプの一方の端を、ゴム栓に取り付けられたYコネクタの有刺鉄線コネクタの1つに接続し、もう一方の端を1/4インチのフィッティングに接続し、このフィッティングの反対側を1穴ゴムストッパー(メーカーサイズ1)に挿入します。
    3. 別のゴム製ストッパー(メーカーサイズ8.5)に、ストッパーの広い側に1/4インチのストレートチューブコネクタを1つ挿入し、フィッティングの外側の端を7フィートの医療グレードのビニールパイプに接続します。
    4. 前に組み立てた2つのゴム製ストッパー構造を、実験室用ガラス製のドレインチューブから8インチx 1.75インチのガラスシリンダーに接続します。
  4. バルブ制御システム
    1. システムはタバコの煙およびきれいな空気の吸入(膨らむ)を模倣するソレノイド弁のリズミカルな開閉によって制御される。ソレノイドバルブを制御するシステムは、商業的に設計されました ( 材料表を参照)。
  5. すべてのコンポーネントをまとめて組み立てる( 図1を参照)
    1. 1インチファスナーを使用して、バルブ制御システムの側面に4つのソレノイドバルブを取り付けます。
    2. ソレノイドバルブを、メーカーの指示に従ってバルブ制御システムに接続します。
    3. ソレノイドバルブの排気(EXH)接続に10-32(M)ネジストレートコネクタを接続し、同じソレノイドバルブの「IN」接続と「OUT」接続にネジポートアダプタを接続します。
    4. 7フィートの医療グレードのビニールチューブを使用して、「OUT」接続を介してソレノイドバルブにコンプレッサーに取り付けられた流量計を接続します。
    5. ステップ1.3.3でゴム栓で組み立てられた7フィートのビニール管を接続します。ソレノイドバルブの「IN」コネクタに接続します。
    6. チャンバーの煙の入力にタバコの部屋の小さいゴム栓を挿入します。
    7. 手順1.3.1で組み立てられたタバコ台の有刺鉄線Yコネクタの2番目の接続にソレノイドバルブを接続します。

figure-protocol-2695
図1:CSへの暴露のためのWBISの接続の概略図。この図は、すべてのコンポーネントがどのように組み立てられ、作業装置を形成するかを示しています。図は機械が作動することができる4つの1つの組み立てられた喫煙室だけを示している。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

2. タバコの煙の暴露

注意:タバコの煙への第二および第三の手の暴露を避けてください。タバコおよび露出室はクラスIIタイプB2の層流生物安全キャビネットの中で使用されるべきである。適切なPPEは、煙露実験(マスク、手袋、ヘアネット、ガウン)を実施しながら着用する必要があります。

  1. 圧力と気流の設定
    1. すべてのコンポーネントが 図 1のように組み立てられると、空気圧縮機の電源を入れ、安全アラームが単独でオフになるまで待ちます。
    2. 圧力調整器のノブを回して、空気圧縮機の圧力を40~50 psiに調整します。
    3. 空気圧縮機からの気流を、流量計を使用して5 Lに調整します。
    4. バルブコントローラの電源を入れます。
    5. タイマーの最初の桁で UP キーを押しながら SET/LOCK キーを押して、バルブ コントローラのデジタル タイマーを PULSE-C (画面に「Pu-c」と表示)動作モードに調整します。次に、PU-c モードに達するまで UP キーを押します。RESET キーを押して、表示される動作モード(つまり Pu-C)を作業モードとして設定します。
    6. SET/LOCK を押してタイマー 1 を変更します(画面に「T1」と表示されます)。
    7. 上または下のキーを押して T1 を 20 s に設定します。
    8. SET/LOCK を押してタイマー 2 を変更します(画面に「T2」と表示されます)。
    9. 上または下のキーを押して T2 を 3 s に設定します。
      注: ステップ 2.1.5 ~ 2.1.9 は、特定のタイマーで使用するように調整されています ( 資料一覧を参照)。この製品の他の用途の詳細については、対応するユーザーマニュアルを参照してください。
  2. タバコの煙の治療
    注:このシステムは1-4マウスの露出の部屋の同時使用を可能にする。
    1. エアコンプレッサの電源を入れ、安全アラームが自らオフになるまで待ちます。
    2. バルブコントローラの電源を入れます。
    3. 8.5 Lの容積の気密な取り外し可能なふたを備えた4つの露出室のそれぞれに5匹のマウスを移す。
    4. ラミナーフロー生物学的安全キャビネットの中で、タバコを点灯し、タバコ室の中にタバコを挿入します。ケンタッキー州3RF4研究用タバコ(9.5 mg/cigタールおよび0.73 mg/cigニコチン)9と比較して、15mg/cigタールおよび1.1 mg/cigニコチン8を含む市販のタバコを使用してください。
    5. 現在使用中のチャンバーに対応するバルブコントローラのバルブをオンにします。露出は2段階に分けられる:(T1)きれいな空気が20 sのために暴露室にポンプで送られ、(T2)空気の流れはタバコの部屋からの燃焼および煙を3sの露出室にポンプで送り出す。タバコがフィルターに達するまで完全に燃え尽きるようにします。
      1. タイマー設定を調整して、約 4 分の期間で平均 10 個のパフ/タバコを実行します。タイマーとシステムは、研究者の研究ニーズに応じてCS投与レジメンを強化または下げるために簡単にカスタマイズ可能であることに注意してください。
    6. タバコフィルターを取り外し、火炎を消火し、臭いを弱めるために水でガラスビーカーにタバコの吸殻を入れることによってそれを処分します。
    7. タバコ室がタバコなしで再び閉じられていることを確認してください。機械は10分間きれいな空気をポンプでくむ。CSに曝露される脊椎動物の常時モニタリングを維持することが最も重要である。この暴露レジメンは、曝露チャンバあたり9週間以上生後5匹の雌マウスに最適化されている。
    8. 1室あたり1日に合計4本のタバコについて、ステップ2.3.4~2.3.7を3回繰り返します。この手順は、研究者が実験に必要な限り、週5日繰り返されます。
    9. マウスを露出チャンバーから取り外し、対応するケージに戻します。
    10. バルブコントローラとエアコンプレッサーの電源を切ります。
    11. 露出とタバコの部屋を取り除き、タールの残留物を取り除くために水と石鹸で洗います。
    12. チャンバーを完全に乾燥させてから再び使用してください。

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結果

CS曝露の主な特徴の1つは肺の空気嚢(肺胞)の損傷および破壊によって特徴付けられる肺気腫である。したがって、最初の実験は、CSへの全身暴露を繰り返した際に、雌マウスの肺の肺の肺の変化を引き起こすDIYシステムの能力に焦点を当てた。CS投与レジメンは、CSを用いたマウスを治療し、肺気腫10、11、12、13、14、15、16の分子病態生理を研究するために...

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ディスカッション

ここでは、マウスのWBIS用装置の構築に必要な情報をCSに提供する。システムの設置後、研究者が動物のニコチンまたはコチニンの送達用量に基づいてシステムを較正することが非常に重要である。装置は、タバコのパフのボリューム、パフ周波数、組み合わせた煙の暴露期間、および動物が各タバコの間に受け取る休息間隔を調整するために使用できるタイマーと圧力計が含まれています。?...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

AR、XH、PEはNIH助成金R01HL140398とギルソンロンゲボー財団助成金によって支援されました。DEMMとKKは、NIH助成金R01HL136333とR01HL134880(KYK)、およびヘリス医学研究財団からの助成金によって支援されました。DEMMはまた、ハワードヒューズ医学研究所(HHMI)のギリアム・フェローシップによって支援されています。PEは、精密環境衛生学研修による支援も受けています NIEHS T32 ES027801 フェローシッププログラム。JCとMFは、エピジェネティクス・分子発がん学科のタバコ研究基金とMDアンダーソンのエピジェネティクスセンター(MF賞)によって支援されています。FKおよびYZは、NIH助成金R01 ES029442-01およびR01 AI135803-01ならびにVAメリット助成金CX000104によってサポートされています。このプロジェクトは、ベイラー医科大学のサイトメトリーとセルソーティングコアによって、CPRITコア施設支援賞(CPRIT-RP180672)、NIH(CA125123およびRR024574)、ジョエル・M・セダーストロームの支援を受けて支援されました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1 in fastenerLowes756990
1/4 in Barbed Y connectorVWR89093-282
1/4 in straight tubing connectorVWR62866-378
1/8 hex nippleLowes877221
1/8 in threaded coupling fittingLowes877208
1/8 in threaded male adapter nipple fittingLowes877243
10/32 (M) threaded straight connectorBimbaEB60
3/4 in 90-degree elbow CPVC fittingLowes22643
3/4 in chlorinated polyvinyl chloride (CPVC) pipeLowes23814
3/4 in CPVC capLowes23773
3/4 in CPVC Drip irrigation female adapterLowes194629
3/4 in diameter CPVC male adapterLowes23766
8.5 L airtight container with lid (11.25in x 7.75in x 6 in)KomaxN/AListed as "Komax Biokips Large Bread Box | (280-oz) Large Storage Container"
Glass drain tube (1.75 in diameter x 8 in length)KIMAX6500
Isonic Solenoid ValvesBimbaV2A02-AW1
Marlboro Red 100'sMarlboroN/A
Oxygen swivel barbed connectorGlobal Medical SolutionsRES002
Panasonic Timer LT4H-WPanasonicLT4HWItem was built-in the valve controller by Shepherd Controls & Associates
Pressure regulatorAllied Electronics and Automation70600552Also listed as "Norgren R07-100-RGKA"
Rubber stopper # 1 (one hole)VWR59581-163
Rubber stopper # 8.5 (one hole)VWR59581-389
Scireq inExpose systemScireq and Emka TechnologiesN/ACommercial system used for comparison with our DIY WBIS
Straight barbed fitting (8mm opening)VWR10028-872
Thread Sealant tapeLowes1184243
Threaded port adaptorBimbaP1SA1
Timeter Aridyne 2000 Medical Air CompressorMFI MedicalAHC-TE20
Timeter flowmeterAllied Healthcare Products15006-03YP2Also listed as "Puritan Air Meter"
Valve Control systemShepherd Controls and AssociatesN/ACompany custom designed the valve control system for this model.
Vinyl pipesVitality MedicalRES3007

参考文献

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