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Resumo

Este protocolo demonstra o estudo dos efeitos fisiofisiológicos da fumaça do cigarro (SC) com um sistema de exposição de inalação total (WBI) construído internamente. Este sistema pode expor animais a CS sob condições repetíveis controladas para pesquisa de efeitos mediados pela CS em enfisema pulmonar e hematopoiese.

Resumo

Cerca de 14% dos adultos nos Estados Unidos foram reportados a fumar cigarros em 2018. Os efeitos da fumaça do cigarro (SC) nos pulmões e nas doenças cardiovasculares têm sido amplamente estudados, no entanto, o impacto da SS em outros tecidos e órgãos, como sangue e medula óssea, permanece incompletamente definido. Encontrar o sistema apropriado para estudar os efeitos da CS em roedores pode ser proibitivamente caro e exigir a compra de sistemas disponíveis comercialmente. Assim, pretendemos construir um sistema acessível, confiável e versátil para estudar os efeitos patológicos da CS em camundongos. Esta configuração de exposição à inalação do corpo inteiro (WBIS) imita a respiração e o inchaço dos cigarros, alternando a exposição ao CS e ao ar limpo. Aqui mostramos que este sistema "faça você mesmo" (DIY) induz inflamação das vias aéreas e enfisema pulmonar em camundongos após 4 meses de exposição à fumaça de cigarro. Os efeitos da inalação do corpo inteiro (AIC) da CS sobre as células hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs) na medula óssea usando este aparelho também são mostrados.

Introdução

O tabagismo continua sendo uma das principais causas de doenças evitáveis nos EUA, apesar do declínio constante do número de adultos fumantes de cigarros nos últimos 50-60 anos1. É amplamente conhecido que o tabagismo está ligado a múltiplas doenças dos pulmões e do sangue, incluindo doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), um grupo de doenças que inclui enfisema e bronquite crônica2,3,4. De acordo com o Center for Disease Control (CDC), em 2014, a DPOC foi a terceira principal causa de morte nos Estados Unidos, com mais de 15 milhões de americanos sofrendo dessa doença5.

CS também tem sido recentemente associado a um maior risco de desenvolver hematopoiese clonal (CH)6,7, uma condição na qual uma única célula-tronco hematopoiética produz desproporcionalmente uma grande porcentagem do sangue periférico de uma pessoa. Este achado indica uma conexão potencial entre o tabagismo e a função da medula óssea. Dadas as implicações de saúde generalizadas e altamente significativas da CS e dado que os modelos murinos de doenças são uma pedra angular do progresso na pesquisa biomédica, é útil desenvolver sistemas eficientes e acessíveis para o modelo CS em camundongos.

Aqui, fornecemos um guia passo-a-passo para a construção de um sistema acessível para o tratamento e estudo dos efeitos in vivo da SC sobre enfisema pulmonar e homeostase de medula óssea. A montagem deste equipamento não exige que o usuário tenha conhecimento especializado e, portanto, permite a montagem DIY.

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Protocolo

Todos os animais envolvidos nos experimentos e no desenvolvimento dessa técnica estão sob nosso protocolo de uso animal aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) e pelas instituições Baylor College of Medicine e MD Anderson que são credenciadas pela Associação de Avaliação e Acreditação de Cuidados Com Animais Laboratoriais (AAALAC).

1. Construção do aparelho

  1. Montagem do compressor de ar com o sistema da válvula.
    1. Conecte os medidores de fluxo (dois 15 L/min com barra Y e 2 decolagens de energia) ao regulador de pressão em miniatura usando um encaixe de mamilo adaptador masculino de 1/8 polegada. Certifique-se de usar a fita de vedação do fio em todas as extremidades roscadas.
    2. Conecte o regulador de pressão montado com o medidor de fluxo ao instrumento médico do compressor de ar usando o seguinte: um mamilo hexaxado de 1/8 polegada na saída de ar do compressor, um encaixe de acoplamento rosqueado de 1/8 polegadas e um encaixe de mamilo adaptador masculino de 1/8 polegada que se conecta ao regulador de pressão.
    3. Instale o conector farpado giratório de oxigênio em cada (4) medidor de fluxo.
    4. Instale um adaptador masculino na saída de ar superior do compressor de ar (peça incluída com o instrumento médico do compressor de ar).
  2. Montagem de câmaras de exposição (fazer 4 unidades)
    1. Corte um tubo de cloreto de polivinil clorado de 3/4 polegadas (CPVC) em oito segmentos de 4 polegadas.
    2. Insira cada segmento em um encaixe CPVC de cotovelo de 3/4 polegadas 90° e conecte o lado de encaixe do cotovelo a um adaptador masculino CPVC de 3/4 polegadas de diâmetro. Deve haver oito segmentos de CPVC, cada um ligado a um encaixe de cotovelo CPVC e um adaptador masculino CPVC.
    3. Faça dois furos (1 1/4 polegada de diâmetro) em lados opostos mais distantes um do outro de um recipiente hermético de 8,5 L (11,25 x 7,75 x 6 polegadas) com uma tampa (ver Câmara de exposição Figura 1). O posicionamento dos orifícios deve ser centrado de cima para baixo e da esquerda para a direita.
    4. Insira as laterais roscadas do adaptador masculino CPVC montado antes em cada orifício nos recipientes.
    5. Do interior do recipiente, conecte uma tampa CPVC de 3/4 polegadas do outro lado (entrada de fumaça de câmara) e um adaptador feminino de irrigação de gotejamento CPVC de 3/4 polegadas de um lado (saída de fumaça da câmara).
    6. Faça cinco furos de 3 mm na parte superior da tampa CPVC da saída de fumaça da câmara em um padrão de quincunx (chuveiro). Isso permitirá que a fumaça do cigarro entre na câmara com maior velocidade e garante que ela se espalhe uniformemente dentro da câmara em todas as direções.
  3. Montagem de câmaras de cigarro (compõe até 4 unidades de exposição murina)
    1. Pegue uma rolha de borracha de um orifício (tamanho do fabricante 8,5) e insira um conector Y farpado de 1/4 polegada no lado mais largo e um encaixe reto de barbeado (abertura de 8 mm) no lado mais estreito. O cigarro será colocado aqui durante o procedimento de fumar (pedestal de cigarro).
    2. Conecte uma extremidade de um tubo de vinil de grau médico de 12 polegadas a um dos conectores farpados no conector Y ligado à rolha de borracha e a outra extremidade a um encaixe de 1/4 polegada e insira o lado oposto deste encaixe em uma rolha de borracha de um orifício (tamanho do fabricante 1).
    3. Em outra rolha de borracha (tamanho do fabricante 8,5), insira um conector de tubo reto de 1/4 polegada no lado mais largo da rolha e conecte a extremidade externa do encaixe a um tubo de vinil de grau médico de 7 pés.
    4. Conecte as duas estruturas de rolha de borracha montadas antes nas etapas 1.3.1-1.3.3 a um cilindro de vidro de 8 polegadas x 1,75 polegadas de um tubo de drenagem de vidro de laboratório.
  4. Sistema de controle da válvula
    1. O sistema é controlado por uma abertura rítmica e fechamento de válvulas solenoides que simulam a inalação (puffing) de fumaça de cigarro e ar limpo. O sistema que controla as válvulas solenoides foi projetado comercialmente (ver Tabela de Materiais).
  5. Montando todos os componentes juntos (ver Figura 1)
    1. Monte quatro válvulas solenoides nas laterais do sistema de controle da válvula usando fixadores de 1 polegada.
    2. Conecte as válvulas solenoides ao sistema de controle da válvula seguindo as instruções do fabricante.
    3. Conecte um conector reto roscado de 10 a 32 (M) ao escape ("EXH") na válvula solenoide e um adaptador de porta rosqueado nas conexões "IN" e "OUT" da mesma válvula solenoide.
    4. Conecte o medidor de fluxo ligado ao compressor à válvula solenoide através da conexão "OUT" usando uma tubulação de vinil de grau médico de 7 pés.
    5. Conecte o tubo de vinil de 7 pés montado com a rolha de borracha na etapa 1.3.3. no conector "IN" na válvula solenoide.
    6. Insira a pequena rolha de borracha da câmara de cigarro na entrada de fumaça da câmara.
    7. Conecte a válvula solenoide à segunda conexão do conector Y farpado no pedestal de cigarro montado na etapa 1.3.1.

figure-protocol-5524
Figura 1: Esquema das conexões do nosso WBIS para exposição à CS. Esta figura demonstra como todos os componentes são montados para formar um aparelho de trabalho. A figura mostra apenas uma câmara de fumantes montada dos quatro que a máquina é capaz de operar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Exposição à fumaça do cigarro

ATENÇÃO: Evite a exposição em segunda e terceira mão à fumaça do cigarro. As câmaras de cigarro e exposição devem ser usadas dentro de um Gabinete de Segurança Biológica de Fluxo De Fluxo De Fluxo Classe II B2. Epi adequado deve ser usado durante a realização dos experimentos de exposição à fumaça (ou seja, máscaras, luvas, rede de cabelo, vestido).

  1. Definição de pressão e fluxo de ar
    1. Uma vez que todos os componentes sejam montados como mostrado na Figura 1,ligue o compressor de ar e espere que o alarme de segurança seja desligado por conta própria.
    2. Ajuste a pressão do compressor de ar para 40-50 psi girando o botão sobre o regulador de pressão.
    3. Ajuste o fluxo de ar do compressor de ar para 5 L usando o medidor de fluxo.
    4. Ligue o controlador da válvula.
    5. Ajuste o temporizador digital no controlador da válvula para o modo operacional PULSE-C (mostrado no display como "Pu-c") pressionando a tecla SET/LOCK enquanto segura a tecla UP no primeiro dígito do temporizador. Em seguida, pressione a tecla UP até que o modo Pu-c seja atingido. Pressione a tecla RESET para definir o modo de operação exibido (ou seja, Pu-C) como o modo de trabalho.
    6. Pressione o SET/LOCK para alterar o temporizador 1 (mostrado no visor como "T1").
    7. Pressione as teclas para cima ou para baixo para definir T1 a 20 s.
    8. Pressione o SET/LOCK para alterar o temporizador 2 (mostrado no visor como "T2").
    9. Pressione as teclas para cima ou para baixo para definir T2 a 3 s.
      NOTA: As etapas 2.1.5 a 2.1.9 são adaptadas para serem usadas com o temporizador específico (ver Tabela de Materiais). Para obter instruções adicionais sobre outros usos para este produto, consulte o manual do usuário correspondente.
  2. Tratamento de fumaça de cigarro
    NOTA: Este sistema permite o uso de 1-4 câmaras de exposição murina ao mesmo tempo.
    1. Ligue o compressor de ar e espere o alarme de segurança desligar sozinho.
    2. Ligue o controlador da válvula.
    3. Transfira 5 camundongos para cada uma das quatro câmaras de exposição com tampas removíveis herméticas com um volume de 8,5 L. Coloque as quatro câmaras de exposição com ratos dentro de um Gabinete de Segurança Biológica de Fluxo De Fluxo Classe II Tipo B2.
    4. Dentro do armário de segurança biológica de fluxo laminar, acenda um cigarro e insira o cigarro dentro da câmara de cigarros. Use cigarros comercialmente disponíveis que contenham 15 mg/cig tar e 1,1 mg/cig nicotina8 em comparação com os cigarros de pesquisa Kentucky 3RF4 (9,5 mg/cig tar e 0,73 mg/cig nicotina)9.
    5. Ligue as válvulas do controlador da válvula que correspondem às câmaras que estão atualmente em uso. A exposição é dividida em 2 fases: (T1) o ar limpo é bombeado para a câmara de exposição por 20 s e (T2) o fluxo de ar faz com que o cigarro queime e a fumaça da câmara de cigarro seja bombeada para a câmara de exposição por 3 s. Deixe o cigarro queimar completamente até chegar ao filtro.
      1. Ajuste as configurações do temporizador para executar uma média de ~10 puffs/cigarro durante um período de ~4 minutos. Observe que o temporizador e o sistema são facilmente personalizáveis para melhorar ou diminuir o regime de dosagem de CS de acordo com as necessidades de pesquisa dos pesquisadores.
    6. Remova o filtro de cigarro e descarte-o colocando a bituca de cigarro em um copo de vidro com água para apagar a chama e umedecer o odor.
    7. Certifique-se de que a câmara de cigarros está fechada novamente e sem um cigarro. Deixe a máquina bombear ar limpo por 10 minutos. É de extrema importância manter o monitoramento constante dos animais vertebrados expostos à SC. Este regime de exposição é otimizado para 5 camundongos fêmeas com mais de 9 semanas de idade por câmara de exposição.
    8. Repita os passos 2.3.4 a 2.3.7 três vezes para um total de 4 cigarros por câmara por dia. Esse procedimento se repete 5 dias por semana enquanto o pesquisador precisar de seus experimentos.
    9. Remova os camundongos das câmaras de exposição de volta às suas gaiolas correspondentes.
    10. Desligue o controlador da válvula e o compressor de ar.
    11. Remova a exposição e as câmaras de cigarro e lave com água e sabão para remover qualquer resíduo de piche.
    12. Deixe as câmaras secarem completamente antes de usá-las novamente.

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Resultados

Uma das principais marcas da exposição à CS é o enfisema que é caracterizado pelos danos e destruição de sacos de ar (alvéolos) no pulmão. Assim, os experimentos iniciais se concentraram na capacidade do sistema DIY de provocar alterações enfisemasas nos pulmões de camundongos fêmeas após repetida exposição do corpo inteiro à SC. O regime de dosagem de CS foi escolhido com base em nossas publicações anteriores em que utilizamos o sistema DIY descrito aqui para tratar camundongos com CS e estudar a fisi...

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Discussão

Aqui fornecemos as informações necessárias para a construção de um aparelho para WBIS de ratos para CS. Após a instalação do sistema, é extremamente importante que os pesquisadores calibram o sistema com base na dose entregue de nicotina ou cotinina em animais. O aparelho contém um temporizador e medidores de pressão que podem ser usados para ajustar o volume do puff de cigarro, a frequência do puff, o período combinado de exposição à fumaça e os intervalos de descanso que os animais recebem entre cada c...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

AR, XH e PE foram apoiados pela concessão do NIH R01HL140398 e uma bolsa da Fundação Gilson Longenbaugh. A DEMM e a KK foram apoiadas pelas bolsas DO NIH R01HL136333 e R01HL134880 (KYK), e uma bolsa da Helis Medical Research Foundation. A DEMM também é apoiada pela Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Gilliam Fellowship for Advanced Study. A PE também conta com o apoio do Programa de Bolsas de Pesquisa em Ciências da Saúde Ambiental de Precisão NIEHS T32 ES027801. O JC e o MF são apoiados pelo Tobacco Research Funds do Departamento de Epigenética e Carcinogênese Molecular e pelo Centro de Epigenética (Prêmio Acadêmico para MF) da MD Anderson. FK e YZ são apoiados pelas bolsas NIH R01 ES029442-01 e R01 AI135803-01, bem como a concessão do Mérito VA CX000104. Este projeto foi apoiado pelo Núcleo de Citometria e Triagem Celular da Baylor College of Medicine com financiamento do CPRIT Core Facility Support Award (CPRIT-RP180672), do NIH (CA125123 e RR024574), e da assistência de Joel M. Sederstrom.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1 in fastenerLowes756990
1/4 in Barbed Y connectorVWR89093-282
1/4 in straight tubing connectorVWR62866-378
1/8 hex nippleLowes877221
1/8 in threaded coupling fittingLowes877208
1/8 in threaded male adapter nipple fittingLowes877243
10/32 (M) threaded straight connectorBimbaEB60
3/4 in 90-degree elbow CPVC fittingLowes22643
3/4 in chlorinated polyvinyl chloride (CPVC) pipeLowes23814
3/4 in CPVC capLowes23773
3/4 in CPVC Drip irrigation female adapterLowes194629
3/4 in diameter CPVC male adapterLowes23766
8.5 L airtight container with lid (11.25in x 7.75in x 6 in)KomaxN/AListed as "Komax Biokips Large Bread Box | (280-oz) Large Storage Container"
Glass drain tube (1.75 in diameter x 8 in length)KIMAX6500
Isonic Solenoid ValvesBimbaV2A02-AW1
Marlboro Red 100'sMarlboroN/A
Oxygen swivel barbed connectorGlobal Medical SolutionsRES002
Panasonic Timer LT4H-WPanasonicLT4HWItem was built-in the valve controller by Shepherd Controls & Associates
Pressure regulatorAllied Electronics and Automation70600552Also listed as "Norgren R07-100-RGKA"
Rubber stopper # 1 (one hole)VWR59581-163
Rubber stopper # 8.5 (one hole)VWR59581-389
Scireq inExpose systemScireq and Emka TechnologiesN/ACommercial system used for comparison with our DIY WBIS
Straight barbed fitting (8mm opening)VWR10028-872
Thread Sealant tapeLowes1184243
Threaded port adaptorBimbaP1SA1
Timeter Aridyne 2000 Medical Air CompressorMFI MedicalAHC-TE20
Timeter flowmeterAllied Healthcare Products15006-03YP2Also listed as "Puritan Air Meter"
Valve Control systemShepherd Controls and AssociatesN/ACompany custom designed the valve control system for this model.
Vinyl pipesVitality MedicalRES3007

Referências

  1. Current Cigarette Smoking Among Adults in the United States. Center for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/tobacco/data_statistics/fact_sheets/adult_data/cig_smoking/index.htm (2018).
  2. Salvi, S. Tobacco smoking and evironmental risk factors for chronic obstructive pulmonary disease. Clinics in Chest Medicine. 35, 17-27 (2014).
  3. Sunyer, J., et al. Longitudinal relation between smoking and white blood cells. American Journal of Epidemiology. 144, 734-741 (1996).
  4. Freedman, D. S., Flanders, D., Barboriak, J. J., Malarcher, A. M., Gates, L. Cigarette smoking and leukocyte subpopulations in men. Annals of Epidemiology. 6, 299-306 (1996).
  5. Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD). Center for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/copd/basics-about.html (2019).
  6. Genovese, G., et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence. New England Journal of Medicine. , (2014).
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  22. Madison, M. C., et al. Electronic cigarettes disrupt lung lipid homeostasis and innate immunity independent of nicotine. Journal of Clinical Investigation. 129, 4290-4304 (2019).

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