使用全身吸入系统在小鼠中暴露香烟烟雾

摘要

该协议展示了对香烟烟雾（CS）的病理生理影响的研究，内部内建立了全身吸入（WBI）暴露系统（WBIS）。该系统可以在受控的可重复条件下使动物接触CS，用于研究CS介于肺气肿和血细胞瘤的影响。

摘要

据报道，2018年美国有近14%的成年人吸烟。香烟烟雾（CS）对肺部和心血管疾病的影响已得到广泛研究，然而，CS对血液和骨髓等其他组织和器官的影响仍然未完全确定。找到适当的系统来研究CS对啮齿动物的影响可能过于昂贵，需要购买市售系统。因此，我们着手构建一个经济实惠、可靠且多功能的系统，以研究CS在小鼠中的病理影响。这种全身吸入暴露系统 （WBIS） 设置通过交替接触 CS 和清洁空气来模拟香烟的呼吸和吹气。在这里，我们表明，这种自己动手（DIY）系统在接触了4个月的香烟烟雾后，在小鼠身上诱发气道炎症和肺气肿。使用这种仪器，CS的全身吸入（WBI）对造血干细胞和骨髓中的祖细胞（HSPCs）的影响也显示出来。

引言

吸烟仍然是美国可预防疾病的主要原因之一，尽管在过去50-60^年中吸烟的成年人数量持续下降。众所周知，吸烟与肺和血液的多种疾病有关，包括慢性阻塞性肺病（COPD），这是一组疾病，包括肺气肿和慢性支气管炎^2、3、4。根据美国疾病控制中心（CDC）的数据，2014年，慢性阻塞性肺病是美国第三大死因，超过1500万美国人患有^{这种疾病。}

CS最近也与患克隆造血症^{（CH）6、7}的较高风险有关，在这种情况下，单个造血干细胞不成比例地产生一个人的外周血液的很大一部分。这一发现表明吸烟和骨髓功能之间有潜在的联系。鉴于CS对健康的广泛和非常重要的影响，鉴于穆林疾病模型是生物医学研究进步的基石，开发高效且经济实惠的系统来模拟小鼠的CS是有益的。

在这里，我们提供一个分步指南，建立一个负担得起的系统，用于治疗和研究CS对肺肺气肿和骨髓平衡的体内影响。此设备的组装不需要用户具有专业知识，因此允许 DIY 组装。

研究方案

参与实验和开发这项技术的所有动物都根据我们的动物使用协议，由机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 和贝勒医学院和 MD 安德森机构批准，这些机构已获得实验室动物护理评估和认证协会 （AAALAC） 的认证。

1. 建造设备

1. 用阀门系统组装空气压缩机。
   1. 使用 1 / 8 英寸螺纹男性适配器配件将流计（两个 15 L / min 带 Y 条和 2 个电源起飞）连接到微型压力调节器。请确保在所有螺纹端使用螺纹密封胶带。
   2. 使用以下方式将组装的压力调节器与流计连接到医用空气压缩机仪器:压缩机气口上的 1 / 8 英寸六角、 1 / 8 英寸螺纹耦合配件以及连接到压力调节器的 1 / 8 英寸螺纹男性适配器配件。
   3. 在每个 （4） 流表上安装氧气旋转带刺接头。
   4. 在空气压缩机的顶部空气出口上安装男性适配器（部分包含在医用空气压缩机仪器中）。
2. 组装曝光室（制作4个单元）
   1. 将一根 3/4 英寸氯化聚氯乙烯 （CPVC） 管道切成 8 个 4 英寸段。
   2. 将每个段插入一个 3/4 英寸 90° 肘部 CPVC 配件，并将肘部的配件侧连接到直径为 3/4 英寸的 CPVC 男性适配器上。应有八个 CPVC 段，每个部分连接到一个 CPVC 肘部安装和一个 CPVC 男性适配器。
   3. 在距离对方最远的 8.5 L 密封容器（11.25 x 7.75 x 6 英寸）上钻两个孔（直径 1 1/4 英寸），盖子（见图 1 曝光室）。孔的定位是从上到下和从左到右。
   4. 将之前组装的 CPVC 男性适配器的螺纹侧插入容器中的每个孔中。
   5. 从容器内部，在另一侧（室内烟雾输入）上安装一个 3/4 英寸 CPVC 盖，在一侧附加 3/4 英寸 CPVC 滴灌女性适配器（室烟输出）。
   6. 在室内烟雾输出的 CPVC 盖顶部以昆昆克斯（淋浴头）模式钻出五个 3 毫米孔。这将使香烟烟雾以更高的速度进入房间，并确保它均匀地分布在室内的所有方向。
3. 组装卷烟室（最多4个穆林暴露单位）
   1. 采取一个单孔橡胶塞（制造商大小8.5），并在较宽的一侧插入一个1/4英寸的带刺Y连接器和一个直刺配件（8毫米开口）在较窄的一侧。香烟将在吸烟过程中（香烟基座）放置在这里。
   2. 将 12 英寸长医用级乙烯基管的一端连接到连接到橡胶塞的 Y 连接器上的一个带刺连接器，将另一端连接到 1/4 英寸的配件上，并将此配件的对面插入一个单孔橡胶塞子（制造商尺寸 1）。
   3. 在另一个橡胶塞子（制造商尺寸 8.5），插入一个 1/4 英寸直管连接器在塞子的较宽的一侧，并将配件的外端连接到 7 英尺医用级乙烯基管。
   4. 将之前组装的两个橡胶塞件结构（步骤 1.3.1–1.3.3）与实验室玻璃排水管中的 8 英寸 x 1.75 英寸玻璃缸连接起来。
4. 阀门控制系统
   1. 该系统由有节奏的电磁阀打开和关闭控制，这些阀门模拟吸入（吹）香烟烟雾和清洁空气。控制电磁阀的系统是商业设计的（见 材料表）。
5. 将所有组件组装在一起（见 图 1）
   1. 使用 1 英寸紧固件将四个电磁阀安装到阀门控制系统的两侧。
   2. 按照制造商的指示将电磁阀连接到阀门控制系统。
   3. 将 10+32 （M） 螺纹直接器连接到电磁阀上的排气 （"EXH"） 连接，以及同一电磁阀的"IN"和"OUT"连接上的螺纹端口适配器。
   4. 使用 7 英尺医用级乙烯基管通过"OUT"连接将连接到压缩机的流计连接到电磁阀。
   5. 将 7 英尺乙烯基管与第 1.3.3 步的橡胶塞连接起来。在电磁阀上的"IN"连接器上。
   6. 在烟室烟雾输入上插入卷烟室的小橡胶塞。
   7. 将电磁阀连接到香烟基座上按步骤 1.3.1 组装的带刺 Y 连接器的第二个连接。

图1:我们WBIS与CS接触的连接示意图。此图演示了所有组件的组装方式，以形成工作装置。该图仅显示机器能够操作的四个烟室中的一个组装吸烟室。 请单击此处查看此图的较大版本。

2. 香烟烟雾暴露

注意:避免二手和三手接触香烟烟雾。香烟和暴露室应在 II 类 B2 层流生物安全柜中使用。在进行烟雾暴露实验时应佩戴适当的PPE（即口罩、手套、发网、礼服）。

1. 设置压力和气流
   1. 一旦所有部件都按照 图 1的显示进行组装，请打开空气压缩机，等待安全警报自行关闭。
   2. 通过打开压力调节器的旋钮，将空气压缩机的压力调整到 40–50 psi。
   3. 使用流量计将空气压缩机的气流调整到 5 升。
   4. 打开阀门控制器。
   5. 通过按下 SET/LOCK 键，同时按住计时器第一位数字的 UP 键，将阀门控制器上的数字定时器调整为 PULSE-C（显示屏上显示为"Pu-c"）操作模式。然后，按上键，直到达到 Pu-c 模式。按重置键将显示的操作模式（即 Pu-C）设置为工作模式。
   6. 按下 SET/LOCK 更改定时器 1（显示屏上显示为"T1"）。
   7. 按上或向下键设置 T1 到 20 s。
   8. 按下 SET/LOCK 更改定时器 2（显示屏上显示为"T2"）。
   9. 按上或向下键设置T2到3 s。
      注:步骤 2.1.5 到 2.1.9 是定制用于特定定时器（参见 材料表）。有关本产品其他用途的进一步说明，请参阅其相应的用户手册。
2. 香烟烟雾处理
   注意:该系统允许同时使用1–4个穆林暴露室。
   1. 打开空气压缩机，等待安全警报自行关闭。
   2. 打开阀门控制器。
   3. 将 5 只小鼠转移到四个暴露室中，每个暴露室配有气密可拆卸盖，体积为 8.5 L。 将四个暴露室与小鼠放在 II 类 B2 层层流生物安全柜内。
   4. 在层流生物安全柜内，点亮香烟，将香烟插入卷烟室内。使用市售香烟，其中含有15毫克/烟焦油和1.1毫克/西格尼古丁⁸相比，肯塔基州3RF4研究香烟（9.5毫克/西格焦油和0.73毫克/西格尼古丁^）9。
   5. 打开与当前使用的机舱对应的阀门控制器上的阀门。暴露分为两个阶段:（T1）清洁空气被泵入暴露室20s和（T2）气流导致香烟燃烧，从烟室抽到暴露室的烟雾3s。让香烟完全烧坏，直到它到达过滤器。
      1. 调整定时器设置，在~4分钟的时间内平均执行约10次泡芙/香烟。请注意，定时器和系统很容易根据调查人员的研究需要定制，用于增强或降低CS给注方案。
   6. 取下香烟过滤器，将烟头放入玻璃烧杯中，用水灭火并抑制气味。
   7. 确保烟室再次关闭，无需香烟。让机器泵清洁空气10分钟。保持对接触CS的脊椎动物的持续监测至关重要。这种暴露方案针对每个暴露室中9周以上的5只雌性小鼠进行了优化。
   8. 重复步骤 2.3.4 到 2.3.7 三次，每天总共 4 支香烟。只要研究人员需要进行实验，这个程序每周重复5天。
   9. 将小鼠从暴露室中取出，带回相应的笼子里。
   10. 关闭阀门控制器和空气压缩机。
   11. 取出暴露和烟室，用水和肥皂清洗，以去除焦油残留物。
   12. 让房间完全干燥，然后再使用它们。

结果

CS 暴露的主要特征之一是肺气肿，其特征是肺部气囊 （肺囊） 的损伤和破坏。因此，最初的实验侧重于DIY系统在反复接触CS后引起雌性小鼠肺部的肺部变化的能力。CS配药方案是根据我们先前的出版物选择的，我们利用此处描述的DIY系统用CS治疗小鼠，并研究肺气肿10、11、12、13、14、15、16的分子病理生理学。

讨论

在这里，我们提供构建小鼠WBIS到CS的仪器所需的信息。系统安装后，调查人员根据动物中尼古丁或可替宁的交付剂量校准系统至关重要。该仪器包含一个定时器和压力计，可用于调节香烟泡芙量、泡芙频率、合并烟雾暴露期以及动物在每支香烟之间获得的休息间隔。此外，每天服用的香烟的实际数量可能因焦油和尼古丁含量而异。最后，必须定期清洁接触香烟烟雾的任何成分，以确保动物的烟雾?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 in fastener	Lowes	756990
1/4 in Barbed Y connector	VWR	89093-282
1/4 in straight tubing connector	VWR	62866-378
1/8 hex nipple	Lowes	877221
1/8 in threaded coupling fitting	Lowes	877208
1/8 in threaded male adapter nipple fitting	Lowes	877243
10/32 (M) threaded straight connector	Bimba	EB60
3/4 in 90-degree elbow CPVC fitting	Lowes	22643
3/4 in chlorinated polyvinyl chloride (CPVC) pipe	Lowes	23814
3/4 in CPVC cap	Lowes	23773
3/4 in CPVC Drip irrigation female adapter	Lowes	194629
3/4 in diameter CPVC male adapter	Lowes	23766
8.5 L airtight container with lid (11.25in x 7.75in x 6 in)	Komax	N/A	Listed as "Komax Biokips Large Bread Box | (280-oz) Large Storage Container"
Glass drain tube (1.75 in diameter x 8 in length)	KIMAX	6500
Isonic Solenoid Valves	Bimba	V2A02-AW1
Marlboro Red 100's	Marlboro	N/A
Oxygen swivel barbed connector	Global Medical Solutions	RES002
Panasonic Timer LT4H-W	Panasonic	LT4HW	Item was built-in the valve controller by Shepherd Controls & Associates
Pressure regulator	Allied Electronics and Automation	70600552	Also listed as "Norgren R07-100-RGKA"
Rubber stopper # 1 (one hole)	VWR	59581-163
Rubber stopper # 8.5 (one hole)	VWR	59581-389
Scireq inExpose system	Scireq and Emka Technologies	N/A	Commercial system used for comparison with our DIY WBIS
Straight barbed fitting (8mm opening)	VWR	10028-872
Thread Sealant tape	Lowes	1184243
Threaded port adaptor	Bimba	P1SA1
Timeter Aridyne 2000 Medical Air Compressor	MFI Medical	AHC-TE20
Timeter flowmeter	Allied Healthcare Products	15006-03YP2	Also listed as "Puritan Air Meter"
Valve Control system	Shepherd Controls and Associates	N/A	Company custom designed the valve control system for this model.
Vinyl pipes	Vitality Medical	RES3007