Exposición al humo del cigarrillo en ratones usando un sistema de inhalación de todo el cuerpo

Resumen

Este protocolo demuestra el estudio de los efectos patofisiológicos del humo de cigarrillo (CS) con un sistema de la exposición de la inhalación del entero-cuerpo (WBI) (WBIS) construido internamente. Este sistema puede exponer a los animales al CS bajo condiciones repetibles controladas para la investigación de efectos CS-mediados sobre enfisema y hematopoyesis del pulmón.

Resumen

Cerca del 14% de los adultos en los Estados Unidos fueron reportados fumando cigarrillos en 2018. Los efectos del humo del cigarrillo (CS) sobre pulmones y enfermedades cardiovasculares se han estudiado extensamente, sin embargo, el impacto del CS en otros tejidos y órganos tales como sangre y médula permanece incompleto definido. Encontrar el sistema apropiado para estudiar los efectos de la CS en roedores puede ser prohibitivamente costoso y requerir la compra de sistemas disponibles comercialmente. Por lo tanto, nos propusimos construir un sistema asequible, confiable y versátil para estudiar los efectos patológicos del CS en ratones. Esta configuración del sistema de exposición por inhalación de cuerpo entero (WBIS) imita la respiración y el soplo de los cigarrillos mediante la exposición alterna a CS y aire limpio. Aquí mostramos que este sistema hágalo usted mismo (BRICOLAJE) induce la inflamación de las vías respiratorias y el enfisema pulmonar en ratones después de 4 meses de exposición al humo del cigarrillo. También se muestran los efectos de la inhalación de cuerpo entero (WBI) de CS sobre células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPCs) en la médula ósea utilizando este aparato.

Introducción

Fumar cigarrillos sigue siendo una de las principales causas de enfermedades prevenibles en los Estados Unidos a pesar de la disminución constante en el número de adultos fumadores de cigarrillos en los últimos 50-60 años¹. Es ampliamente conocido que fumar está relacionado con múltiples enfermedades de los pulmones y la sangre, incluida la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), un grupo de enfermedades que incluye enfisema y bronquitis crónica^2,3,4. Según el Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC), en 2014, la EPOC fue la tercera causa principal de muerte en los Estados Unidos con más de 15 millones de estadounidenses que sufren de esta enfermedad⁵.

El CS también se ha asociado recientemente a un riesgo más alto de desarrollar la hematopoyesis clónica (CH)^6,7,una condición en la cual una sola célula de vástago hematopoyética produce desproporcionado un porcentaje grande de la sangre periférica de una persona. Esto que encuentra indica una conexión potencial entre fumar y la función de la médula. Dadas las implicaciones generalizadas y altamente significativas para la salud de la CS y dado que los modelos murinos de enfermedades son una piedra angular del progreso en la investigación biomédica, es útil desarrollar sistemas eficientes y asequibles para modelar la CS en ratones.

Aquí, proporcionamos una guía paso a paso para construir un sistema asequible para tratar y estudiar los efectos in vivo del CS sobre el enfisema pulmonar y la homeostasis de la médula ósea. El montaje de este equipo no requiere que el usuario tenga conocimientos especializados y por lo tanto permite el montaje de bricolaje.

Protocolo

Todos los animales involucrados en los experimentos y el desarrollo de esta técnica han estado bajo nuestro protocolo de uso animal aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) y bajo baylor College of Medicine y MD Anderson instituciones que están acreditadas por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC).

1. Construcción del aparato

1. Montaje del compresor de aire con el sistema de válvulas.
   1. Conecte los caudalímetros (dos de 15 L/min con barra Y y 2 tomas de corriente) al regulador de presión en miniatura utilizando un accesorio de pezón adaptador macho roscado de 1/8 de pulgada. Asegúrese de utilizar la cinta de sellado de rosca en todos los extremos roscados.
   2. Conecte el regulador de presión montado con el caudalímetro al instrumento del compresor de aire médico utilizando lo siguiente: un pezón hexagonal de 1/8 de pulgada en la salida de aire del compresor, un accesorio de acoplamiento roscado de 1/8 de pulgada y un accesorio de pezón adaptador macho roscado de 1/8 de pulgada que se conecta al regulador de presión.
   3. Monte el conector de púas giratorias de oxígeno en cada (4) caudalímetro.
   4. Instale un adaptador macho en la salida de aire superior del compresor de aire (parte incluida con el instrumento del compresor de aire médico).
2. Montaje de cámaras de exposición (hacer 4 unidades)
   1. Corte una tubería de cloruro de polivinilo clorada (CPVC) de 3/4 de pulgada en ocho segmentos de 4 pulgadas.
   2. Inserte cada segmento en un accesorio CPVC de codo de 3/4 de pulgada y 90° y conecte el lado del codo a un adaptador macho CPVC de 3/4 de pulgada de diámetro. Debe haber ocho segmentos de CPVC, cada uno conectado a un accesorio de codo de CPVC y un adaptador macho de CPVC.
   3. Perfore dos agujeros (1 1/4 de pulgada de diámetro) en lados opuestos más distantes entre sí de un contenedor hermético de 8,5 L (11,25 x 7,75 x 6 pulgadas) con una tapa (consulte la Figura 1 cámara de exposición). La colocación de los agujeros debe centrarse de arriba a abajo y de izquierda a derecha.
   4. Inserte los lados roscados del adaptador macho CPVC montado antes en cada orificio de los contenedores.
   5. Desde el interior del contenedor, coloque una tapa de CPVC de 3/4 de pulgada en el otro lado (entrada de humo de cámara) y un adaptador hembra de riego por goteo de CPVC de 3/4 de pulgada en un lado (salida de humo de cámara).
   6. Perfore cinco orificios de 3 mm en la parte superior de la tapa de CPVC de la salida de humo de la cámara en un patrón de quincunx (cabezal de ducha). Esto permitirá que el humo del cigarrillo entre en la cámara con mayor velocidad y asegura que se extienda uniformemente dentro de la cámara en todas las direcciones.
3. Montaje de cámaras de cigarrillos (constituye hasta 4 unidades de exposición murinas)
   1. Tome un tapón de goma de un solo orificio (tamaño del fabricante 8.5) e inserte un conector Y de púas de 1/4 de pulgada en el lado más ancho y un accesorio de púas recto (apertura de 8 mm) en el lado más estrecho. El cigarrillo se colocará aquí durante el procedimiento de fumar (pedestal de cigarrillo).
   2. Conecte un extremo de un tubo de vinilo de grado médico de 12 pulgadas de largo a uno de los conectores de púas en el conector Y conectado al tapón de goma y el otro extremo a un accesorio de 1/4 de pulgada e inserte el lado opuesto de este accesorio en un tapón de goma de un agujero (tamaño del fabricante 1).
   3. En otro tapón de goma (tamaño del fabricante 8.5), inserte un conector de tubería recta de 1/4 de pulgada en el lado más ancho del tapón y conecte el extremo exterior del accesorio a un tubo de vinilo de grado médico de 7 pies.
   4. Conecte las dos estructuras de tapón de goma ensambladas antes en los pasos 1.3.1–1.3.3 a un cilindro de vidrio de 8 pulgadas x 1.75 pulgadas de un tubo de drenaje de vidrio de laboratorio.
4. Sistema de control de válvulas
   1. El sistema es controlado por una apertura rítmica y cierre de válvulas solenoides que simulan la inhalación (inhalación) de humo de cigarrillo y aire limpio. El sistema que controla las válvulas solenoides fue diseñado comercialmente (ver Tabla de Materiales).
5. Ensamblar todos los componentes juntos (ver Figura 1)
   1. Monte cuatro válvulas solenoides a los lados del sistema de control de válvulas utilizando sujetadores de 1 pulgada.
   2. Conecte las válvulas solenoides al sistema de control de válvulas siguiendo las instrucciones del fabricante.
   3. Acople un conector recto roscado de 10 a 32 (M) a la conexión de escape ("EXH") en la válvula solenoide y un adaptador de puerto roscado en las conexiones "IN" y "OUT" de la misma válvula solenoide.
   4. Conecte el caudalímetro conectado al compresor a la válvula solenoide a través de la conexión "OUT" utilizando un tubo de vinilo de grado médico de 7 pies.
   5. Conecte el tubo de vinilo de 7 pies montado con el tapón de goma en el paso 1.3.3. en el conector "IN" de la válvula solenoide.
   6. Inserte el pequeño tapón de goma de la cámara de cigarrillos en la entrada de humo de la cámara.
   7. Conecte la válvula solenoide a la segunda conexión del conector Y de púas del pedestal de cigarrillo montado en el paso 1.3.1.

Figura 1: Esquema de las conexiones de nuestro WBIS para la exposición a CS. Esta figura demuestra cómo se ensamblan todos los componentes para formar un aparato de trabajo. La figura muestra sólo una cámara de fumar ensamblada de las cuatro que la máquina es capaz de operar. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

2. Exposición al humo del cigarrillo

PRECAUCIÓN: Evite la exposición de segunda y tercera mano al humo del cigarrillo. Las cámaras de cigarrillos y exposición deben usarse dentro de los gabinetes de seguridad biológica de flujo laminar tipo B2 de clase II. Se debe usar el EPP adecuado mientras se llevan a cabo los experimentos de exposición al humo (es decir, máscaras, guantes, red para el cabello, bata).

1. Ajuste de la presión y el flujo de aire
   1. Una vez que todos los componentes estén montados, como se muestra en la Figura 1,encienda el compresor de aire y espere a que la alarma de seguridad se apague por sí sola.
   2. Ajuste la presión del compresor de aire a 40-50 psi girando la perilla en el regulador de presión.
   3. Ajuste el flujo de aire del compresor de aire a 5 L utilizando el caudalímetro.
   4. Encienda el controlador de válvulas.
   5. Ajuste el temporizador digital del controlador de válvulas al modo de funcionamiento PULSE-C (que se muestra en la pantalla como "Pu-c") pulsando la tecla SET/LOCK mientras mantiene pulsada la tecla ARRIBA en el primer dígito del temporizador. A continuación, presione la tecla ARRIBA hasta que se alcance el modo Pu-c. Pulse la tecla RESET para configurar el modo de funcionamiento mostrado (es decir, Pu-C) como modo de trabajo.
   6. Pulse el set/lock para cambiar el temporizador 1 (se muestra en la pantalla como "T1").
   7. Presione las teclas ARRIBA o ABAJO para establecer T1 a 20 s.
   8. Pulse el set/lock para cambiar el temporizador 2 (se muestra en la pantalla como "T2").
   9. Presione las teclas ARRIBA o ABAJO para establecer T2 a 3 s.
      NOTA: Los pasos 2.1.5 a 2.1.9 están diseñados para ser utilizados con el temporizador específico (consulte la Tabla de materiales). Para obtener más instrucciones sobre otros usos de este producto, consulte su manual de usuario correspondiente.
2. Tratamiento del humo del cigarrillo
   NOTA: Este sistema permite el uso de 1-4 cámaras de exposición murinas al mismo tiempo.
   1. Encienda el compresor de aire y espere a que la alarma de seguridad se apague por sí sola.
   2. Encienda el controlador de válvulas.
   3. Transfiera 5 ratones a cada una de las cuatro cámaras de exposición con tapas extraíbles herméticas con un volumen de 8.5 L. Coloque las cuatro cámaras de exposición con ratones dentro de un Gabinete de Seguridad Biológica de Flujo Laminar Tipo B2 clase II.
   4. Dentro del gabinete de seguridad biológica de flujo laminar, encienda un cigarrillo e inserte el cigarrillo dentro de la cámara de cigarrillos. Use cigarrillos disponibles comercialmente que contengan 15 mg/cig de alquitrán y 1,1 mg/cig de nicotina⁸ en comparación con los cigarrillos de investigación Kentucky 3RF4 (9,5 mg/cig de alquitrán y 0,73 mg/cig de nicotina)⁹.
   5. Encienda las válvulas del controlador de válvulas que corresponden a las cámaras que están actualmente en uso. La exposición se divide en 2 fases: (T1) el aire limpio se bombea en la cámara de exposición durante 20 s y (T2) el flujo de aire hace que el cigarrillo se queme y el humo de la cámara de cigarrillos se bombea a la cámara de exposición durante 3 s. Deje que el cigarrillo se queme por completo hasta que llegue al filtro.
      1. Ajuste la configuración del temporizador para realizar un promedio de ~ 10 bocanadas / cigarrillo durante un período de ~ 4 minutos. Tenga en cuenta que el temporizador y el sistema son fácilmente personalizables para mejorar o reducir el régimen de dosificación de CS de acuerdo con las necesidades de investigación de los investigadores.
   6. Retire el filtro de cigarrillos y deséchelo colocando la colilla de cigarrillos en un vaso de vaso con agua para apagar la llama y amortiguar el olor.
   7. Asegúrese de que la cámara de cigarrillos esté cerrada de nuevo y sin cigarrillo. Deje que la máquina bombee aire limpio durante 10 min. Es de suma importancia mantener un monitoreo constante de los animales vertebrados que están expuestos al CS. Este régimen de exposición está optimizado para 5 ratones hembra de más de 9 semanas de edad por cámara de exposición.
   8. Repita los pasos 2.3.4 a 2.3.7 tres veces para un total de 4 cigarrillos por cámara al día. Este procedimiento se repite 5 días a la semana durante el tiempo que el investigador necesite para sus experimentos.
   9. Retire los ratones de las cámaras de exposición de nuevo en sus jaulas correspondientes.
   10. Apague el controlador de válvulas y el compresor de aire.
   11. Retire la exposición y las cámaras de cigarrillos y lave con agua y jabón para eliminar cualquier residuo de alquitrán.
   12. Deje que las cámaras se sequen completamente antes de usarlas de nuevo.

Resultados

Uno de los principales sellos de la exposición al CS es el enfisema que se caracteriza por el daño y la destrucción de los sacos de aire (alvéolos) en el pulmón. Por lo tanto, los experimentos iniciales se centraron en la capacidad del sistema de bricolaje para provocar cambios enfisematosos en los pulmones de ratones hembra sobre la exposición repetida de todo el cuerpo a CS. El régimen de dosificación de CS fue elegido en base a nuestras publicaciones anteriores en las que utilizamos el sistema de bricolaje des...

Discusión

Aquí proporcionamos la información requerida para la construcción de un aparato para WBIS de ratones a CS. Después de la instalación del sistema, es de vital importancia que los investigadores calibren el sistema en función de la dosis administrada de nicotina o cotinina en animales. El aparato contiene un temporizador y manómetros que se pueden utilizar para ajustar el volumen de la bocanada del cigarrillo, la frecuencia del manguito, el período combinado de exposición al humo y los intervalos de descanso que l...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 in fastener	Lowes	756990
1/4 in Barbed Y connector	VWR	89093-282
1/4 in straight tubing connector	VWR	62866-378
1/8 hex nipple	Lowes	877221
1/8 in threaded coupling fitting	Lowes	877208
1/8 in threaded male adapter nipple fitting	Lowes	877243
10/32 (M) threaded straight connector	Bimba	EB60
3/4 in 90-degree elbow CPVC fitting	Lowes	22643
3/4 in chlorinated polyvinyl chloride (CPVC) pipe	Lowes	23814
3/4 in CPVC cap	Lowes	23773
3/4 in CPVC Drip irrigation female adapter	Lowes	194629
3/4 in diameter CPVC male adapter	Lowes	23766
8.5 L airtight container with lid (11.25in x 7.75in x 6 in)	Komax	N/A	Listed as "Komax Biokips Large Bread Box | (280-oz) Large Storage Container"
Glass drain tube (1.75 in diameter x 8 in length)	KIMAX	6500
Isonic Solenoid Valves	Bimba	V2A02-AW1
Marlboro Red 100's	Marlboro	N/A
Oxygen swivel barbed connector	Global Medical Solutions	RES002
Panasonic Timer LT4H-W	Panasonic	LT4HW	Item was built-in the valve controller by Shepherd Controls & Associates
Pressure regulator	Allied Electronics and Automation	70600552	Also listed as "Norgren R07-100-RGKA"
Rubber stopper # 1 (one hole)	VWR	59581-163
Rubber stopper # 8.5 (one hole)	VWR	59581-389
Scireq inExpose system	Scireq and Emka Technologies	N/A	Commercial system used for comparison with our DIY WBIS
Straight barbed fitting (8mm opening)	VWR	10028-872
Thread Sealant tape	Lowes	1184243
Threaded port adaptor	Bimba	P1SA1
Timeter Aridyne 2000 Medical Air Compressor	MFI Medical	AHC-TE20
Timeter flowmeter	Allied Healthcare Products	15006-03YP2	Also listed as "Puritan Air Meter"
Valve Control system	Shepherd Controls and Associates	N/A	Company custom designed the valve control system for this model.
Vinyl pipes	Vitality Medical	RES3007