JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا نقدم مفصلة، بروتوكول خطوة بخطوة لهندسة الجينوم CRISPR/Cas9 القائم على الخلايا B البشرية الأولية لضربة قاضية الجينات (KO) وضرب في (KI) لدراسة الوظائف البيولوجية للجينات في الخلايا B وتطوير العلاجات B-الخلية.

Abstract

الخلايا البائية هي خلايا لمفاوية مشتقة من الخلايا الجذعية المكونة للدم وهي مكون رئيسي في الذراع الفكاهي للجهاز المناعي التكيفي. أنها تجعل المرشحين جذابة للعلاجات القائمة على الخلايا بسبب سهولة عزلها عن الدم المحيطي، وقدرتها على التوسع في المختبر، وطول عمرها في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام وظيفتها البيولوجية الطبيعية - لإنتاج كميات كبيرة من الأجسام المضادة - للتعبير عن كميات كبيرة جدا من البروتين العلاجي ، مثل جسم مضاد مؤتلف لمكافحة العدوى ، أو إنزيم لعلاج أمراض الأنزيموباث. هنا، نقدم أساليب مفصلة لعزل الخلايا B البشرية الأولية من خلايا الدم الأحادية الطرفية (PBMCs) وتفعيل / توسيع الخلايا B المعزولة في المختبر. ثم نقوم بإظهار الخطوات التي ينطوي عليها استخدام نظام CRISPR/Cas9 ل KO الخاص بالموقع للجينات الذاتية في الخلايا B. هذه الطريقة تسمح لكو كفاءة الجينات المختلفة، والتي يمكن استخدامها لدراسة الوظائف البيولوجية للجينات ذات الأهمية. ثم نقوم بإظهار خطوات استخدام نظام CRISPR/Cas9 جنبا إلى جنب مع ناقل فيروسي (rAAV) مرتبط بال أدينو للتكامل الفعال لكل موقع من كاسيت التعبير المتحول في الخلايا B. يوفر هذا البروتوكول معا منصة هندسية خطوة بخطوة يمكن استخدامها في الخلايا B البشرية الأولية لدراسة الوظائف البيولوجية للجينات وكذلك لتطوير علاجات الخلايا B.

Introduction

الخلايا B هي مجموعة فرعية من سلالة الخلايا الليمفاوية المستمدة من الخلايا الجذعية الدموية. أنها تؤدي دورا حاسما في الجهاز المناعي الفكاهي التكيفية من خلال إنتاج كميات كبيرة من الأجسام المضادة استجابة للتحديات المناعية1. الخلايا B هي أيضا سلائف خلايا الذاكرة B وخلايا البلازما المتمايزة بشكل نهائي وطويلة العمر ، وبالتالي توفير مناعة فكاهة دائمة2. خلايا البلازما، على وجه الخصوص، هي فريدة من نوعها بين الخلايا المناعية في قدرتها على إنتاج كميات كبيرة من الأجسام المضادة محددة أثناء البقاء على قيد الحياة لسنوات أو عقود3. بالإضافة إلى ذلك ، فإن سهولة العزلة عن الدم المحيطي تجعل نسب الخلية B مرشحا ممتازا للعلاجات الجديدة القائمة على الخلايا4.

في السابق ، تم استخدام طرق التكامل العشوائي ، مثل تلك التي تستخدم ناقلات العدسية أو جهاز الإرسال والاستقبال الجمال النائم ، لهندسة الخلايا B لتسليم المتحولين والتعبير5و6و7و8. ومع ذلك ، فإن الطبيعة غير المحددة لهذه النهج تجعل من الصعب دراسة الوظائف البيولوجية لجين معين في الخلايا B وتحمل خطرا متأصلا من تكوين الغرز والتعبير المتحول المتغير و / أو إسكات في الإعداد العلاجي.

نظام CRISPR/Cas9 هو أداة قوية لهندسة الجينوم تسمح للباحثين بتحرير جينوم الخلايا المختلفة بدقة في العديد من الأنواع. في الآونة الأخيرة، وقد وضعت مجموعتين، بما في ذلك منطقتنا، بنجاح أساليب لتوسيع الجسم الحي السابق وهندسة الجينوم المستهدفة من الخلايا B البشريةالأولية 9،10. سوف نصف عملية تنقية الخلايا B البشرية الأولية من عينة leukaphoresis. بعد ذلك، سنصف بروتوكولنا المحدث لتوسيع الخلية B وتنشيط الخلايا B المعزولة. سنقوم بعد ذلك بوصف عملية لضرب مجموعة من التمايز 19 (CD19) ، وهي مستقبلات خلية B محددة وسمة مميزة للخلايا B ، عن طريق الكهرومporation لإدخال CRISPR / Cas9 mRNA جنبا إلى جنب مع CD19 sgRNA في الخلايا B المنشطة.

يحصل على ترجمة Cas9 ميرنا ويربط إلى SgRNA CD19 لتشكيل مجمع CRISPR/Cas9-sgRNA ريبونوكليوبروتين (RNP). في وقت لاحق، SgRNA في المجمع يؤدي Cas9 لخلق كسر حبلا مزدوجة (DSB) في التسلسل المستهدف على exon 2 من الجين. ستقوم الخلايا بإصلاح DSB عن طريق "الانضمام إلى نهاية غير متجانسة" عن طريق إدخال أو حذف النيوكليوتيدات ، مما يؤدي إلى طفرة frameshift والتسبب في خروج الجين. سنقوم بعد ذلك بقياس فقدان CD19 عن طريق قياس التدفق الخلوي وتحليل تشكيل indel عن طريق تتبع indels عن طريق تحليل التحلل (TIDE).

سنقوم بعد ذلك بوصف عملية استخدام CRISPR/Cas9 جنبا إلى جنب مع ناقل AAV6 المؤتلف (rAAV6 ، وهو قالب مانح للإصلاح الموجه بالهومولوجيا (HDR)) للتوسط في إدخال موقع محدد للبروتين الفلوري الأخضر المعزز(EGFP) في جين موقع تكامل الفيروسات المرتبط بال أدينو 1 (AAVS1). الجين AAVS1 هو مكان نشط دون وظائف بيولوجية معروفة وموقع التكامل الفيروسي AAV على الجينوم البشري. ولذلك، فإنه يعتبر "ملاذا آمنا" لهندسة الجينوم. هنا، ونحن التقرير أن التوسع وتنشيط الخلايا B يسمح للتوسع تصل إلى 44 أضعاف في 7 أيام من الثقافة (الشكل 1). وأظهر الكهرومporation من الخلايا B انخفاضا طفيفا في صحة الخلايا العامة (الشكل 2A) في 24 ساعة بعد العدوى. أظهر تحليل مخطط مبعثر لعلامة CD19 (الشكل 2B) انخفاضا يصل إلى 83٪ في الخلايا المحررة (الشكل 2C).

كشف تحليل TIDE للكروماتوغرافيات(الشكل 3A)أن النسبة المئوية لل indels كانت مشابهة لنسبة فقدان البروتين عن طريق قياس التدفق الخلوي(الشكل 3B). أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي لتجربة KI أن الخلايا التي تلقت متجه AAV(الشكل 4)، جنبا إلى جنب مع RNP ، عبرت عن ما يصل إلى 64٪ من الخلايا الإيجابية EGFP(الشكل 5A)وعرضت في وقت لاحق التكامل الناجح عن طريق تفاعل سلسلة البوليميراز التقاطعي (PCR) (الشكل 5B). وأظهرت تعدادات الخلايا أن جميع العينات سرعان ما تم استردادها في غضون 3 أيام بعد الهندسة(الشكل 5C).

Protocol

تم الحصول على عينات من المتبرعين الأصحاء من بنك دم محلي. تم تحديد جميع التجارب الموصوفة هنا لتكون معفاة للبحوث من قبل مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) ووافقت عليها لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية (IBC) في جامعة مينيسوتا.

ملاحظة: أجريت جميع التجارب امتثالا للاحتياطات العالمية لمسببات الأمراض المنقولة بالدم، باستخدام تقنيات معقمة/مطهرة ومعدات مناسبة للسلامة البيولوجية من المستوى 2.

1. إعداد ملاحق لB-الخلية توسيع المتوسطة

  1. إعادة تشكيل CpG oligonucleotide إلى تركيز 1 ملغ / مل.
  2. إعادة تشكيل CD40 ligand (CD40L) إلى تركيز 100 ميكروغرام / مل.
  3. إعادة تشكيل الإنسان المؤتلف IL-10 (rhIL-10) إلى تركيز 50 ميكروغرام / مل.
  4. إعادة تشكيل الإنسان المؤتلف IL-15 (rhIL-15) إلى تركيز 10 ميكروغرام / مل.
    ملاحظة: حافظ على كل ملحق في aliquots صغيرة في -20 درجة مئوية إلى -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.

2. إعداد المتوسط القاعدي

  1. الجمع بين المتوسط القاعدي B-الخلية مع 5٪ (v/v) ملحق وسائل الإعلام لتوسيع الخلايا المناعية في المختبر (على سبيل المثال، CTS الخلية المناعية SR) و 1٪ (v/v) البنسلين والستريبتوميسين.
  2. تصفية تعقيم الوسط القاعدي باستخدام محول مرشح 0.22 ميكرومتر في زجاجة معقمة.
  3. احتفظ بالوسط القاعدي عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.

3. إعداد B-الخلية توسيع المتوسطة

  1. نقل الكمية المطلوبة من الوسط القاعدي إلى حاوية معقمة لثقافة الخلايا B في 5 × 105 خلايا / مل.
  2. تكملة المتوسط القاعدي مع 1 ميكروغرام / مل CpG، 100 نانوغرام / مل CD40L، 50 نانوغرام / مل rhIL-10، و 10 نانوغرام / مل rhIL-15.
  3. تصفية متوسط توسيع الخلية B باستخدام عامل تصفية 0.22 ميكرومتر.
  4. موازنة متوسط توسع الخلية B في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 مع الرطوبة لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام.
    ملاحظة: إعداد جديدة B-الخلية توسيع المتوسطة للاستخدام ليوم واحد. لا تقم بإعداد متوسط توسيع الخلية B للاستخدام لعدة أيام. تشجع هذه الوصفة الإعلامية على انتشار خلايا الذاكرة B والخلايا B البشرية الأساسية المنشطة.

4. تنقية الخلايا B البشرية والتوسع

ملاحظة: إضافة الكحول isopropyl 99-100٪ إلى حاوية التجميد التي تسيطر عليها درجة الحرارة، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة، وتبريد حاوية التجميد في 4 درجة مئوية قبل البدء الخطوة 4.1.

  1. عزل PBMCs من عينة leukaphoresis
    1. نقل عينة leukaphoresis (حوالي 8-10 مل) إلى أنبوب مخروطي معقم 50 مل.
    2. رفع مستوى الصوت إلى 35 مل مع المحلول الملحي المعقم العازل بالفوسفات (PBS).
    3. طبقة بعناية عينة leukaphoresis 35 مل على 15 مل من متوسط الكثافة التدرج.
    4. الطرد المركزي في 500 × غرام لمدة 25 دقيقة دون فرامل، وإزالة طبقة البلازما دون إزعاج معطف بافي (طبقة PBMC)، وجمع PBMCs من واجهة، ونقل إلى أنبوب مخروطي عقيم جديد 50 مل.
    5. طرح PBMCs إلى 50 مل مع برنامج تلفزيوني 1x.
    6. جهاز الطرد المركزي في 500 × غرام لمدة 5 دقائق دون الفرامل. إزالة supernatant دون إزعاج بيليه PBMC، والتي قد تبدو حمراء.
    7. إضافة 7 مل من العازلة تحلل الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم، ماصة 3 مرات لخلط جيدا، واحتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 3 دقائق.
    8. رفع مستوى الصوت إلى 50 مل مع برنامج تلفزيوني 1x.
    9. جهاز الطرد المركزي في 400 × غرام لمدة 5 دقائق مع الفرامل منخفضة المقاومة. إزالة supernatant دون إزعاج بيليه. يجب أن تبدو بيليه وردي أو أبيض.
      ملاحظة: لمواصلة الثقافة الخلايا B المعزولة حديثا، قم بإعداد متوسط توسيع الخلية B قبل بدء عزل الخلية B (الخطوة 4.2).
  2. عزل الخلية B من PBMCs باستخدام مجموعة العزل السلبية للخلية B الأساسية البشرية
    1. إعادة إنفاق PBMCs في العازلة العزل إلى تركيز 5 × 107 خلايا / مل.
      ملاحظة: إذا كان العدد الإجمالي ل PBMCs أقل من 5 × 107 خلايا، خفض حجم المخزن المؤقت العزل للحفاظ على 5 × 107 خلايا/مل. الحد الأدنى والحد الأقصى لأحجام تعليق الخلية هي 0.25 مل و 8 مل، على التوالي.
    2. نقل ما يصل إلى 8 مل (5 × 107 خلايا / مل) إلى العقيمة، البولي بروبلين، أنبوب الجولة القاع مع غطاء.
    3. إضافة 50 ميكرولتر / مل من محسن كوكتيل إلى PBMCs.
    4. إضافة 50 ميكرولتر / مل من كوكتيل العزلة إلى PBMCs، سقف الأنبوب، وعكس 2-3 مرات لخلط.
    5. احتضان في RT لمدة 5 دقائق؛ فيالدقيقة 4 من الحضانة ، دوامة الميكروبات المغناطيسية لمدة 30 ق على الأقل.
    6. نقل 50 ميكرولتر من الميكروبات المغناطيسية لكل 1 مل من PBMCs، سقف الأنبوب، وعكس 2-3 مرات لخلط.
    7. أعلى ما يصل إلى 10 مل مع العزل العازلة وماصة بلطف صعودا وهبوطا 2-3 مرات.
    8. ضع الأنبوب في محطة مغناطيسية واحتضنه في RT لمدة 3 دقائق.
    9. عقد المغناطيس وأنبوب معا، وفي حركة واحدة، عكس المغناطيس وأنبوب معا لصب تعليق الخلية في أنبوب جديد. تجاهل الأنبوب القديم.
    10. كرر الخطوة 4.2.8 (تقليل وقت الحضانة إلى 2 دقيقة) وصب تعليق الخلية B في أنبوب مخروطي نظيف.
    11. خلايا B المخصب جاهزة للاستخدام. إذا تم استخدام الخلايا على الفور، فاستمر في القسم 4.3 (توسيع الخلية B البشرية). تحقق من نقاء الخلايا B المعزولة عن طريق قياس التدفق الخلوي (اختياري). إذا كان سيتم تجميد الخلايا قبل الاستخدام، تابع الخطوة 4.2.12.
    12. لتجميد الخلايا B، والطرد المركزي في 400 × غرام لمدة 5 دقائق، والتخلص من supernatant دون إزعاج بيليه.
    13. Resuspend الخلايا في تجميد المتوسطة في 107 خلايا / مل ، وaliquot 1 مل / cryovial.
    14. وضع cryovial في حاوية التجميد المبردة، وتخزينها في -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها؛ ثم، نقل cryovial المجمدة إلى خزان النيتروجين السائل. الحفاظ على الخلايا المجمدة تصل إلى 1 سنة.
      ملاحظة: العائد المتوقع للخلايا B المعزولة هو 2٪-8٪ من إجمالي PBMCs، مع 95٪ -99٪ من الجدوى.
  3. توسيع الخلية B البشرية
    ملاحظة: إذا كنت تستخدم خلايا B المعزولة حديثا، تخطي الخطوات 4.3.1-4.3.5. عد الخلايا ونقل العدد المطلوب من الخلايا إلى أنبوب مخروطي معقم والاستمرار في الخطوة 4.3.6.
    1. مصل الأبقار الجنيني قبل الدفء (FBS) في حمام مائي قبل إذابة الخلايا B. إعداد 20 مل من متوسط توسيع الخلية B، ونقل إلى قارورة T25، وقبل equilibrate المتوسطة في حاضنة الأنسجة والثقافة (في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2،مع الرطوبة) على الأقل 15 دقيقة قبل الاستخدام.
    2. تذوب الخلايا B في حمام مائي 37 درجة مئوية. أثناء الانتظار، نقل 2 مل من FBS قبل الحارة في أنبوب مخروطي معقم 15 مل.
    3. بعد إذابة الخلايا B تماما ، أضف على الفور 1 مل من FBS الدافئ مسبقا ، من الحكمة المنسدلة ، إلى العينة. احتضان في RT لمدة 1 دقيقة.
    4. ماصة بلطف لإعادة إنفاق العينة ونقل وحدة التخزين بأكملها، دروبوايز، في أنبوب مخروطي يحتوي على 2 مل من FBS الدافئة مسبقا.
    5. رفع مستوى الصوت إلى 15 مل مع عقيمة 1x برنامج تلفزيوني, غطاء, وعكس أنبوب بلطف 2-3 مرات.
    6. أجهزة الطرد المركزي في 400 × غرام لمدة 5 دقائق.
    7. تجاهل supernatant دون إزعاج بيليه الخلية، resuspend بيليه الخلية مع 1 مل من المتوسط توسيع الخلية B-متوازنة مسبقا، والعد الخلايا. يجب أن يكون إجمالي عدد الخلايا حوالي 107 خلايا.
    8. نقل الخلايا إلى قارورة تحتوي على 20 مل من المتوسط توسيع الخلية B-متساوية مسبقا. يجب أن يكون التركيز النهائي للخلايا حوالي 5 × 105 خلايا / مل.
    9. احتضان القارورة عموديا في حاضنة زراعة الأنسجة.
    10. قم بتحديث وسيط التوسعة بالكامل كل يومين عن طريق نقل الحجم الكامل للخلايا B إلى أنبوب مخروطي معقم وكرر الخطوات 4.3.6-4.3.9.
      ملاحظة: قارورة T25 يمكن أن تعقد 10-20 مل من المتوسط; قارورة T75 يمكن أن تعقد ما يصل إلى 20-60 مل من المتوسطة.

5. هندسة الخلية B البشرية الأولية

  1. مهندس الخلايا B في 48 ± 2 ساعة بعد التوسع / التنشيط للحصول على أفضل النتائج. إعداد المتوسطة توسيع الخلية B، aliquot 1 مل من المتوسطة في لوحة 48 جيدا الأنسجة والثقافة، وقبل equilibrate في حاضنة الأنسجة والثقافة على الأقل 15 دقيقة قبل الاستخدام.
    ملاحظة: عند تصميم SgRNA CRISPR/Cas9 لجين الفائدة اتبع الخطوات الموضحة أدناه.
    - تصميم sgRNAs باستخدام أداة على الانترنت11.
    - تصميم sgRNAs على exon التي هي مشتركة بين جميع isoforms من البروتين.
    - طلب sgRNA المعدلة كيميائيا من الشركات ذات السمعة الطيبة.
    - sgRNA عادة ما يأتي في شكل lyophilized. إعادة تشكيل SgRNA في العقيمة DNase / RNase خالية من تريس EDTA (TE) العازلة إلى تركيز 1 ميكروغرام / ميكرولتر.
  2. إعداد CRISPR/Cas9 transfecting الركيزة عن طريق خلط 1 ميكرولتر (1 ميكروغرام / ميكرولتر) من sgRNA المعدلة كيميائيا مع 1.5 ميكرولتر (1 ميكروغرام / ميكرولتر) من المكورات العقدية المعدلة كيميائيا pyogenes كاس 9 (S.p. Cas9) النيوكليز لكل تفاعل العدوى. للتحكم، استخدم 1 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE بدلا من sgRNA.
    ملاحظة: عندما يتم استخدام CD19 sgRNA لتجربة KO الجينات، راجع الشكل 2 للحصول على النتائج. عندما يتم استخدام AAVS1 sgRNA لتجربة KI الجينات، راجع الشكل 5 للحصول على النتائج.
    • الحفاظ على جميع المكونات على الجليد.
  3. مزيج بلطف ونقل 2.5 ميكرولتر من CRISPR/Cas9 الركيزة التغوط لكل رد فعل في أنبوب من 0.2 مل 8 أنبوب الشريط; جانبا في RT.
  4. تشغيل النوى (كهربائي)، وإعداد الكواشف transfection كما هو مبين في الجدول 1.
    ملاحظة: هذه خطوة جيدة للتوقف، إذا لزم الأمر، عن طريق وضع جميع الكواشف على الجليد. إزالة جميع الكواشف من الجليد عندما تكون جاهزة لاستئناف التجربة. عند استخدام بروتين S.p. Cas9 ، يجب على المحقق ما قبل معقدة CRISPR / Cas9 - sgRNA ribonucleoprotein عن طريق خلط 1 ميكروغرام sgRNA مع 5 ميكروغرام من بروتين S.p. Cas9 ، وتجنب أي فقاعات ، واحتضان الخليط في RT لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام للحصول على أفضل النتائج.
  5. عد ونقل 106 خلايا B لكل تفاعل العدوى في أنبوب مخروطي معقم.
  6. رفع مستوى الصوت إلى 15 مل مع برنامج تلفزيوني 1x معقمة، والطرد المركزي في 400 × غرام لمدة 5 دقائق. أثناء الانتظار، قم بإعداد كاشف نقل الخلايا الأساسي(الجدول 2)ووضعها جانبا في RT.
  7. تجاهل supernatant دون إزعاج بيليه الخلية.
  8. Resuspend بيليه الخلية مع 10 مل من برنامج تلفزيوني 1x عقيمة والطرد المركزي في 400 × غرام لمدة 5 دقائق.
  9. تجاهل supernatant تماما دون إزعاج بيليه الخلية.
  10. نقل 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي GFP المعدل كيميائيا (كمراسل transfection) لكل 106 خلايا B إلى بيليه الخلية (اختياري).
  11. إعادة إنفاق بيليه الخلية مع 20 ميكرولتر من كاشف نقل الخلايا الأولية لكل 106 خلايا B; مزيج بلطف عن طريق الأنابيب 5-6 مرات. نقل 20.5 ميكرولتر لكل تفاعل مع العدوى في أنبوب 0.2 مل من الشريط 8 أنبوب يحتوي على 2.5 ميكرولتر من ركيزة انتقال CRISPR/Cas9.
  12. ماصة صعودا وهبوطا مرة واحدة لخلط ونقل وحدة التخزين بأكملها (23 ميكرولتر) في cuvette transfection. كاب واضغط على cuvette على مقاعد البدلاء بلطف لضمان أن السائل يغطي الجزء السفلي من cuvette.
  13. استخدام بروتوكول الخلية B الأساسية البشرية على النوى لtransfection.
    ملاحظة: يمكن وضع النوى (الكهربائي) واستخدامها خارج غطاء محرك السيارة الأنسجة والثقافة. قم بوضع غطاء للكوفيت لضمان العقم.
  14. بقية الخلايا الكهربائية في cuvette في RT لمدة 15 دقيقة.
  15. نقل 80 ميكرولتر من وسيط توسعة الخلية B قبل الموازى من لوحة زراعة الأنسجة إلى تفاعل العدوى في الكوفيت. ضع الكوفيت في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 30 دقيقة.
  16. ماصة بلطف بضع مرات لخلط ونقل الحجم الكامل للعينة من cuvette إلى بئر مناسبة من لوحة 48 جيدا الأنسجة والثقافة التي تحتوي على 1 مل من المتوسط توسيع الخلية B. يجب أن يكون التركيز النهائي للخلايا 106 خلايا / مل.
  17. في حالة إجراء تجربة KI الجينات، نقل ناقلات rAAV6 في 500،000 تعدد العدوى في البئر المناسبة التي تحتوي على الخلايا الكهربائية (حوالي 45 دقيقة بعد الكهرومغناطيسية). انظر المثال rAAV6 ناقلات بناء في الشكل 4A.
    ملاحظة: على سبيل المثال: سيتم إجراء اختبار كهربي لعينة تحكم بدون CRISPR/Cas9 أو متجه rAAV6. سيتم كهربية عينة متجه فقط بدون CRISPR/Cas9 ومن ثم يتم تحويلها مع متجه rAAV6. سيتم تزويد عينة KI بالكهرباء باستخدام CRISPR/Cas9 ثم يتم تحويلها باستخدام ناقل rAAV6. يجب أن يحتوي rAAV6 على أذرع homology صعودا وهبوطا لموقع DSB المستهدف لتقرير التنمية البشرية.
  18. ضع اللوحة في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية و5٪ CO2 مع الرطوبة.
  19. عد الخلايا وسجل قابلية البقاء في اليوم 1 ما بعد الهندسة.
  20. قم بتحديث وسيط توسعة الخلية B كل يومين عن طريق عد الخلايا ثم نقل الحجم الكامل للخلايا إلى أنبوب طرد دقيق نظيف سعة 1.5 مل. الطرد المركزي في 400 × غرام لمدة 5 دقائق، والتخلص من supernatant دون إزعاج بيليه. Resuspend الخلايا مع 100 ميكروغرام من الطازجة B-الخلية توسيع المتوسطة، ونقلها إلى بئر من لوحة زراعة الأنسجة 24 جيدا. طرح حجم المتوسطة لتحقيق تركيز الخلية النهائية في 5 × 105 خلايا / مل.
    ملاحظة: لوحة 48 جيدا يمكن أن تعقد ما يصل إلى 1 مل المتوسطة / جيدا; لوحة 24 جيدا يمكن أن تعقد ما يصل إلى 2 مل المتوسطة / جيدا; لوحة 12 جيدا يمكن أن تعقد ما يصل إلى 4 مل المتوسطة / جيدا، ولوحة 6-جيدا يمكن أن تعقد ما يصل إلى 8 مل المتوسطة / جيدا.
  21. السماح للخلايا المهندسة بالتوسع لمدة 5 أيام على الأقل قبل إجراء تحليلات المصب مثل تحليل قياس التدفق الخلوي وتحليل المد والجزر وتقاطع PCR.

النتائج

مكن بروتوكول التوسع والتنشيط المحدث من التوسع السريع للخلايا B حتى 44 ضعفا في 7 أيام(الشكل 1؛ n = 3 الجهات المانحة). في تجربة KO، أظهر عدد الخلايا B باستخدام تلطيخ تريبان الأزرق أكثر من 80٪ خلايا قابلة للحياة مع انخفاض طفيف في استعادة الخلايا في كل من التحكم وعينات CD19 KO عند 24 ساعة ب?...

Discussion

وقد تم هندسة الجينوم دقيقة في الخلايا B البشرية الأولية تحديا حتى وقت قريب9،10. كنا قد نشرت سابقا بروتوكولات باستخدام CRISPR / Cas9 لهندسة الخلايا B البشريةالأولية 9. هنا ، نوضح البروتوكولات المحسنة لعزل الخلايا B ، والتوسع ، والهندسة للسماح بكفاءة KO من...

Disclosures

تم إيداع براءة اختراع حول طرق صنع واستخدام خلايا B المحررة من الجينوم مع M.J.J. و K.L. و B.S.M كمخترعين. B.S.M هو مستشار ويملك الأسهم في شركة Immusoft شركة Immusoft رعت البحوث في مختبر B.S.M.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من قبل صندوق أبحاث سرطان الأطفال (CCRF) والمعاهد الوطنية للصحة R01 AI146009 إلى B.S.M.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ugIDT1081059smaller size is also available
Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT)LonzaV4XP-3032
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing bufferQuality Biological118-156-101
CleanCap chemically modified Cas9 mRNATrilink BiotechnologyL-7206-1000
CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mgInvivogenTLRL-2006-5different sizes available
Cryostor CS10, 100 mLSTEMCELL Technology7930
CTS Immune Cell SRThermo Fisher ScientificA2596101
EasySep human B cells isolation kitSTEMCELL Technology17954
eBioscience fixable viability dye eFlour 780eBiosciences65-0865-14
Excellerate B cell media, Xeno-freeR&D SystemsCCM031B-cell basal medium
Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom TubeCorning352059
Fetal Bovine Serum (FBS)R&D SystemsS11550For thawing B cells only
Ficoll-Paque PlusGE Healthcare17-1440-03
GeneMate SnapStrip® 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome CapsBioExpressT-3035-1 / 490003-692
Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBSGE lifesciencesSH30256.01
Lonza 4D Nucleofector core unitLonzaAAF-1002B
Lonza 4D Nucleofector X unitLonzaAAF-1002X
Mega CD40 LigandEnzo Life SciencesALX-522-110-C010
Mr. FrostySigma-AldrichC1562-1EAFor freezing cells
Pen/Strep 100XSigma-AldrichTMS-AB2-C
PerCP anti-human CD19 clone HIB19biolegend302228smaller size is also available
rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.)Vigene BiosciencesN/Alarge scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL
Recombinant human IL-10 protein 250 ugR&D Systems217-IL-250different sizes available
Recombinant human IL-15 protein 25 ugR&D Systems247-ILB-025different sizes available
The Big Easy EasySep MagnetSTEMCELL Technology18001different sizes available
Tris-EDTA (TE) bufferFisher ScientificBP2476100

References

  1. LeBien, T. W., Thomas, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
  2. Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15, 160-171 (2015).
  3. Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. Humoral immunity due to long-lived plasma cells. Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).
  4. Spriggs, M. K., et al. Recombinant human CD40 ligand stimulates B cell proliferation and immunoglobulin E secretion. Journal of Experimental Medicines. 176 (6), 1543-1550 (1992).
  5. Fusil, F., et al. A lentiviral vector allowing physiologically regulated membrane-anchored and secreted antibody expression depending on B-cell maturation status. Molecular Therapy. 23 (11), 1734-1747 (2015).
  6. Luo, X. M., et al. Engineering human hematopoietic stem/progenitor cells to produce a broadly neutralizing anti-HIV antibody after in vitro maturation to human B lymphocytes. Blood. 113 (7), 1422-1431 (2008).
  7. Mock, U., Thiele, R., Uhde, A., Fehse, B., Horn, S. Efficient lentiviral transduction and transgene expression in primary human B cells. Human Gene Therapy Methods. 23 (6), 408-415 (2012).
  8. Heltemes-Harris, L. M., et al. Sleeping Beauty transposon screen identifies signaling modules that cooperate with STAT5 activation to induce B-cell acute lymphoblastic leukemia. Oncogene. 35 (26), 3454-3464 (2016).
  9. Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease. Scientific Reports. 8, 12144 (2018).
  10. Hung, K. L., et al. Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells. Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).
  11. Cui, Y., Xu, J., Cheng, M., Liao, X., Peng, S. Review of CRISPR/Cas9 sgRNA design tools. Interdisciplinary Sciences. 10 (2), 455-465 (2018).
  12. Rees, H. A., Liu, D. R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).
  13. Spiegel, A., Bachmann, M., Jurado Jiménez, G., Sarov, M. CRISPR/Cas9-based knockout pipeline for reverse genetics in mammalian cell culture. Methods. 164-165, 49-58 (2019).
  14. Suzuki, T., Kazuki, Y., Oshimura, M., Hara, T. A novel system for simultaneous or sequential integration of multiple gene-loading vectors into a defined site of a human artificial chromosome. PLoS One. 9, 110404 (2014).
  15. Bak, R. O., Porteus, M. H. CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors. Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).
  16. Shirley, J. L., de Jong, Y. P., Terhorst, C., Herzog, R. W. Immune responses to viral gene therapy vectors. Molecular Therapy. 28 (3), 709-722 (2020).
  17. Martino, A. T., Markusic, D. M. Immune response mechanisms against AAV vectors in animal models. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 198-208 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

165 CRISPR Cas9 AAV B

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved