CRISPR/Cas9を用いた初等ヒトB細胞のゲノム工学

要約

ここでは、遺伝子ノックアウト(KO)およびノックイン(KI)のプライマリヒトB細胞のCRISPR/Cas9ベースのゲノム工学に関する詳細なステップバイステッププロトコルを提供し、B細胞における遺伝子の生物学的機能とB細胞治療薬の開発を研究します。

要約

B細胞は造血幹細胞由来のリンパ球であり、適応免疫系の体液性アームの重要な構成要素である。彼らは、末梢血からの隔離の容易さ、インビトロでの拡大能力、および生体内での長寿のために、細胞ベースの治療法の魅力的な候補を作ります。また、その通常の生物学的機能は、大量の抗体を産生する—感染と闘う組換え抗体や、エンジモパシーの治療のための酵素など、非常に大量の治療タンパク質を発現するために利用することができる。ここでは、末梢血単核細胞(PBMC)から初代ヒトB細胞を単離し、インビトロで単離されたB細胞を活性化/拡大するための詳細な方法を提供する。次に、B細胞内因性遺伝子の部位特異的KOにCRISPR/Cas9システムを用いたステップを実証する。この方法は、様々な遺伝子の効率的なKOを可能にし、目的の遺伝子の生物学的機能を研究するために使用することができる。次に、B細胞におけるトランスジーン発現カセットの効率的な部位特異的な統合のための組換え、アデノ関連ウイルス(rAAV)ベクターと共にCRISPR/Cas9システムを使用するためのステップを示す。このプロトコルは、遺伝子の生物学的機能を研究し、B細胞治療薬の開発のために、一次ヒトB細胞で使用できるステップバイステップのエンジニアリングプラットフォームを提供します。

概要

B細胞は造血幹細胞由来のリンパ球系統のサブグループである。彼らは免疫課題に応答して大量の抗体を産生することによって適応体性免疫系において重要な役割を果たす¹.B細胞はまた、メモリB細胞および末期分化された、長命の形質細胞の前駆体であり、それによって持続性の液性免疫²を提供する。特に、形質細胞は、何年も何十年も生存しながら特定の抗体を大量に産生する能力において、免疫細胞の中でユニーク^{である3。}さらに、末梢血からの分離の容易さは、B細胞系統を新しい細胞ベース療法の優れた候補^にする4.

これまで、レンチウイルスベクターや眠れる森の美女トランスポゾンを用いたようなランダムな統合方法は、トランスジーン送達および発現^{5、6、7、8}のB細胞を設計するために使用されてきた。しかし、これらのアプローチの非特異的な性質は、B細胞における特定の遺伝子の生物学的機能を研究することを困難にし、治療環境における挿入突然変異誘発および可変トランスジーン発現および/またはサイレンシングの固有のリスクを伴う。

CRISPR/Cas9システムは、研究者が多くの種の様々な細胞のゲノムを正確に編集することを可能にする強力なゲノム工学ツールです。最近、我々を含む2つのグループは、初原ヒトB細胞^9,10のex vivo拡張および標的ゲノム工学の方法の開発に成功している。白血病サンプルから初等ヒトB細胞を精製するプロセスについて説明する。その後、B細胞拡張および単離されたB細胞の活性化のための我々の更新されたプロトコルを説明する。次に、特異的B細胞受容体およびB細胞の特徴である分化19(CD19)のクラスターをノックアウトするプロセスを、活性化B細胞にCRISPR/Cas9 mRNAと共に導入するエレクトロポレーションによって説明する。

Cas9 mRNAは翻訳され、CD19 sgRNAに結合してCRISPR/Cas9-sgRNAリボヌクレオタンパク質複合体(RNP)を形成します。続いて、複合体中のsgRNAはCas9を導き、遺伝子のエキソン2上の標的配列で二本鎖破断(DSB)を作成する。細胞はヌクレオチドを導入または削除することによって「非相同端結合」によってDSBを修復し、フレームシフト突然変異を引き起こし、遺伝子をノックアウトさせる。次に、フローサイトメトリーによるCD19の損失を測定し、分解(TIDE)解析によるインデルの追跡によりインデル形成を解析します。

次に、CRISPR/Cas9を組換えAAV6ベクター(相同性特異的修復(HDR)のドナーテンプレート)と共に使用し、アデノ関連ウイルスインテグレーションサイト1(AAVS1)遺伝子で強化された緑色蛍光タンパク質(EGFP)の部位特異的挿入を仲介するプロセスについて説明する。AAVS1遺伝子は、既知の生物学的機能を持たない活性な遺伝子であり、ヒトゲノム上のAAVウイルス集積部位である。したがって、ゲノム工学の「安全な港」と考えられています。ここでは、B細胞の拡張と活性化により、培養7日間で最大44倍の拡張が可能であることを報告する(図1)。B細胞のエレクトロポレーションは、トランスフェクション後24時間で全体的な細胞健康(図2A)のわずかな減少を示した。CD19マーカーの散布図分析(図2B)は、編集されたセルの83%の減少を示した(図2C)。

クロマトグラフのTIDE分析(図3A)は、インデル%がフローサイトメトリーによる%タンパク質損失と類似していることを明らかにした(図3B)。KI実験のフローサイトメトリー分析は、AAVベクターを受けた細胞(図4)をRNPとともに、最大64%のEGFP陽性細胞(図5A)まで発現し、後に接合ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による積分化に成功したことを示した(図5B)。細胞数は、すべてのサンプルがエンジニアリング後3日以内に迅速に回復したことを示した(図5C)。

プロトコル

健康なドナーからの白血病サンプルは、地元の血液銀行から得られた。ここで説明したすべての実験は、機関審査委員会(IRB)によって研究のために免除されると判断され、ミネソタ大学の機関バイオセーフティ委員会(IBC)によって承認されました。

注:すべての実験は、無菌/無菌技術と適切なバイオセーフティレベル2機器で、血液媒介病原体のための普遍的な予防措置に従って行われました。

1. B細胞拡張培地用サプリメントを準備する

1. 1 mg/mLの濃度にCpGオリゴヌクレオチドを再構成する。
2. CD40リガンド(CD40L)を100μg/mLの濃度に再構成します。
3. 組換えヒトIL-10(rhIL-10)を50μg/mLの濃度に再構成する。
4. 組換えヒトIL-15(rhIL-15)を10μg/mLの濃度に再構成する。
   注:各サプリメントを-20°C~-80°Cで6ヶ月間小さなアリコートに保管してください。

2. 基底培地の準備

1. B細胞基底培地と5%(v/v)インビトロ免疫細胞拡張用の培地サプリメント(例えば、CTS免疫細胞SR)および1%(v/v)ペニシリンおよびストレプトマイシンを組み合わせます。
2. 0.22 μmフィルターアダプターを使用して、基底媒体を殺菌ボトルに入れます。
3. 基底培地を4°Cで1ヶ月以内に保管してください。

3. B細胞拡張培地の準備

1. 必要量の基底培地を無菌容器に移し、5×10^個 の細胞/mLでB細胞を培養する。
2. 基礎培地に1 μg/mL CPG、100 ng/mL CD40L、50 ng/mL rhIL-10、および10 ng/mL rhIL-15を添加します。
3. 0.22 μmフィルターを使用して、B細胞拡張培地をフィルター処理します。
4. B細胞拡張培地を37°Cで組織培養インキュベーターに平衡化し、使用前に少なくとも30分間湿度を有する5%CO2を用いた。
   注意:1日使用する新鮮なB細胞拡張培地を準備してください。B細胞拡張培地を複数日使用する準備 をしないでください 。このメディアレシピは、メモリB細胞および活性化された原発ヒトB細胞の増殖を促進する。

4. ヒトB細胞の精製と拡張

注:温度制御冷凍容器に99~100%のイソプロピルアルコールを加え、メーカーの指示に従い、凍結容器を4°Cで冷やしてからステップ4.1を開始します。

1. 白血病サンプルからPBMCsを分離する
   1. 白血病サンプル(およそ8〜10 mL)を無菌50 mL円錐管に移します。
   2. 滅菌1xリン酸緩衝生理食塩分(PBS)で体積を35 mLに上げる。
   3. 密度勾配培地の15 mLに35 mLの白血病サンプルを慎重に重ねてください。
   4. ブレーキなしで25分間500×gで遠心分離機、バフィーコート(PBMC層)を邪魔することなくプラズマ層を取り外し、界面からPBMCsを収集し、新しい無菌50 mL円錐形チューブに移します。
   5. 1x PBS で PBMCs を 50 mL まで持ち出します。
   6. ブレーキなしで5分間500×gで遠心分離機。PBMCペレットを邪魔することなく上清を除去し、赤色に見えることがあります。
   7. 7 mLの塩化アンモニウム - カリウムリシスバッファーを加え、ピペットを3回よく混合し、室温(RT)で3分間インキュベートします。
   8. 1x PBSでボリュームを50 mLに上げてください。
   9. 400×gで遠心分離機を5分間低抵抗ブレーキで。ペレットを邪魔することなく上清を除去します。ペレットはピンクがかったか白く見えるはずです。
      注:分離したばかりのB細胞を培養し続けるには、B細胞の分離を開始する前にB細胞拡張培地を準備します(ステップ4.2)。
2. ヒトの一次B細胞陰性分離キットを用いたPBMCsからのB細胞分離
   1. 分離バッファー内の PBMC を 5 × 10⁷ セル/mL の濃度まで再中断します。
      注: PBMCs の総数が 5 × 10^{7 セル} 未満の場合は、分離バッファーのボリュームをスケールダウンして、5 × 10⁷ セル/mL を維持します。細胞懸濁液の最小容積および最大容積はそれぞれ0.25 mLおよび8 mLである。
   2. 最大8 mL(5×10^個の7 セル/mL)を、キャップ付きの無菌、ポリプロピレン、ラウンドボトムチューブに移します。
   3. 50 μL/mL のカクテルエンハンサーを PBMC に追加します。
   4. 50 μL/mLのアイソレーションカクテルをPBMCに加え、チューブをキャップし、2~3回反転して混ぜます。
   5. RTで5分間インキュベートします。インキュベーションの4^分目 に、少なくとも30sの渦磁気マイクロビーズ。
   6. PBMCsの1 mLあたり50μLの磁気マイクロビーズを移し、管をキャップし、2〜3回反転して混合します。
   7. 分離バッファーで最大 10 mL を上に置き、ピペットを 2 ~3 回上下に緩やかにします。
   8. チューブを磁性ステーションに置き、RTで3分間インキュベートします。
   9. 磁石とチューブを一緒に持ち、1つの動きで磁石とチューブを反転させ、セルの懸濁液を新しいチューブに注ぎます。古いチューブを破棄します。
   10. ステップ 4.2.8 (2 分にインキュベーション時間を短縮) を繰り返し、B 細胞懸濁液をクリーンな円錐形チューブに注ぎます。
   11. 濃縮された B 細胞を使用する準備が整いました。セルがすぐに使用される場合は、セクション 4.3 (ヒト B 細胞拡張) に進みます。フローサイトメトリー(任意)により単離されたB細胞の純度を確認する。セルを使用する前に凍結する場合は、ステップ 4.2.12 に進みます。
   12. B細胞を凍結させるために、遠心分離機を400×gで5分間、ペレットを乱すことなく上清を捨てる。
   13. 凍結培地中の細胞を10⁷ 個の細胞/mLで再懸濁し、アリコート1 mL/cryovialを再懸濁する。
   14. 冷蔵冷凍容器にクライオビシャルを入れ、一晩で-80°Cで保管します。その後、液体窒素タンクに凍結性の凍結を移します。1年まで凍結細胞を保ちます。
       注: 単離された B 細胞の期待収量は、PBMCs 全体の 2%~8% であり、生存率は 95% ~99% です。
3. ヒトB細胞拡張
   注: 分離された新しい B セルを使用する場合は、手順 4.3.1 ~ 4.3.5 を省略してください。細胞を数え、必要な数の細胞を無菌の円錐形チューブに移し、ステップ4.3.6に進みます。
   1. B細胞を解凍する前に、水浴中の胎児胎児血清(FBS)を前温め。B細胞拡張培地20mLを調製し、T25フラスコに移し、使用前に少なくとも15分前に組織培養インキュベーター(37°C、5%CO2、湿度で)で培地を事前平衡化します。
   2. 37°Cの水浴でB細胞を解凍する。待っている間、2 mLの予温されたFBSを無菌15 mL円錐形管に移す。
   3. B細胞が完全に解凍された後、すぐにサンプルに1mLの予め温めたFBSを滴下して加えます。RTで1分間インキュベートします。
   4. ピペットを静かにピペットを使用してサンプルを再中断し、ボリューム全体を、2 mLの予め温めたFBSを含む円錐管にドロップして移動させます。
   5. 滅菌1x PBS、キャップで体積を15 mLに持ち上げ、チューブを2~3回緩やかに反転します。
   6. 400×gで5分間遠心分離機。
   7. 上清を細胞ペレットを乱さずに捨て、あらかじめ平衡化されたB細胞増殖培地の1mLで細胞ペレットを再懸濁し、細胞をカウントする。セルの総数は約 10⁷ 個のセルである必要があります。
   8. 細胞を事前平衡化されたB細胞拡張培地の20mLを含むフラスコに移す。細胞の最終的な濃度はおよそ5 x 10⁵ 細胞/mLでなければならない。
   9. フラスコを組織培養インキュベーターで縦にインキュベートします。
   10. B細胞の全容を無菌の円錐管に移し、ステップ4.3.6~4.3.9を繰り返して、2日ごとに膨張培地を完全にリフレッシュします。
       注:T25フラスコは、培地の10〜20 mLを保持することができます。T75フラスコは、最大20~60mLの培地を保持できます。

5. 初発ヒトB細胞工学

1. B細胞を48±2時間で拡張/活性化して最適な結果を得ます。B細胞膨張培地を調製し、48ウェル組織培養プレートに培地のアリコート1mLを調製し、使用前に少なくとも15分前に組織培養インキュベーターで事前平衡化する。
   注: 目的の遺伝子に対応する CRISPR/Cas9 sgRNA を設計する場合は、以下の手順に従ってください。
   - オンラインツール¹¹を使用してsgRNAを設計する。
   - タンパク質のすべてのアイソフォームに共通のエキソン上にsgRNAを設計します。
   - 評判の良い企業から化学修飾sgRNAを注文します。
   - sgRNAは通常凍結乾燥した形で来る;滅菌DNase/RNaseフリートリスEDTA(TE)バッファー内のsgRNAを1μg/μLの濃度に再構成します。
2. 化学修飾されたsgRNAの1 μL(1 μg/μL)を化学修飾 されたレンサ球菌のpyogenes Cas 9(S.p.Cas9)の1回のトランスフェクション反応のヌクレアーゼと混合して、CRISPR/Cas9トランスフェクション基板を調製します。制御のために、sgRNAの代わりに1 μLのTEバッファを使用してください。
   注: CD19 sgRNA を遺伝子 KO 実験に使用する場合、結果については 図 2 を参照してください。AAVS1 sgRNAを遺伝子KI実験に使用する場合、結果については 図5 を参照してください。
   • すべてのコンポーネントを氷の上に保管してください。
3. 穏やかに混合し、0.2 mL 8管ストリップのチューブに反応ごとにCRISPR / Cas9トランスフェクション基板の2.5 μLを転送します。RTで脇に置きます。
4. 核の核(エレクトロポレーター)をオンにし、 表1に示すようにトランスフェクション試薬を調製する。
   注:これは、必要に応じて、氷の上にすべての試薬を置くことによって、一時停止のための良いステップです。実験を再開する準備ができたら、氷からすべての試薬を取り除きます。S.p. Cas9タンパク質を使用する場合、研究者は、1 μg sgRNAと5 μgのS.P.Cas9タンパク質を混合し、気泡を避け、最適な結果を得る前に少なくとも20分間RTで混合物をインキュベートすることによって、CRISPR/Cas9-sgRNAリボヌクレオタンパク質を事前に複合体化する 必要があります 。
5. トランスフェクション反応ごとに^106B 細胞を無菌の円錐管に数え、移送する。
6. 滅菌1x PBSで体積を15 mLに、遠心分離機を400×gで5分間持ち上げる。待ちながら、一次細胞トランスフェクション試薬を準備し(表2)、RTに置いておく。
7. 細胞ペレットを乱さずに上清を捨てます。
8. 細胞ペレットを10 mLの無菌1x PBSと遠心分離機を400×gで5分間再懸濁します。
9. 細胞ペレットを乱さずに上清を完全に捨てます。
10. 10⁶ B細胞当たり0.5μgの化学修飾GFP mRNA(トランスフェクションレポーターとして)を細胞ペレットに移します(任意)。
11. 10⁶ B細胞当たり20μL一次細胞トランスフェクション試薬で細胞ペレットを再懸濁する。5~6回ピペットで軽く混ぜます。トランスフェクション反応ごとに20.5 μLを、CRISPR/Cas9トランスフェクション基板の2.5 μLを含む8チューブストリップの0.2 mLチューブに移します。
12. ピペットを 1回 上下にして、全ボリューム(23 μL)をトランスフェクションキュベットに混合して転送します。ベンチのキュベットをキャップして軽くタップして、液体がキュベットの底部を覆っていることを確認します。
13. トランスフェクターの核形成にヒトの一次B細胞プロトコルを使用する。
    注意:核の核(エレクトロポレーター)は、組織培養フードの外側に配置して使用することができます。キュベットをキャップして、滅菌を確実にします。
14. RTでキュベットの電気ポレートされた細胞を15分間休まします。
15. 前平衡化されたB細胞拡張培地の80μLを、キュベット内のトランスフェクション反応に組織培養板から移す。キュベットを組織培養インキュベーターに30分間入れる。
16. ピペットを数回軽くピペットし、サンプルの全容をキュベットから混合し、B細胞膨張培地の1mLを含む48ウェル組織培養プレートの適切なウェルに移した。細胞の最終的な濃度は10⁶ 細胞/mLでなければなりません。
17. 遺伝子KI実験を行う場合 、rAAV6ベクターを500,000の感染多重度で、エレクトロポレートされた細胞を含む適切なウェル(約45分後エレクトロポレーション)に移す。 図 4Aの rAAV6 ベクトル・コンストラクトの例を参照してください。
    注:例: コントロールサンプルはCRISPR/Cas9またはrAAV6ベクトルなしでエレクトロポレートされます。ベクトルのみのサンプルはCRISPR/Cas9なしで電気ポレートされ、rAAV6ベクターで伝達されます。KIサンプルはCRISPR/Cas9でエレクトロポレートされ、rAAV6ベクターでトランスデューシングされます。rAAV6 は、HDR のターゲット DSB サイトの上および下流に相同性アームを含んでいる必要があります。
18. プレートを37°Cの組織培養インキュベーターに入れ、湿度が5%の_CO2 を入れる。
19. 1日目のポストエンジニアリングで細胞を数え、生存率を記録します。
20. 細胞を数え、きれいな1.5 mLのマイクロ遠心管に細胞の全体の容積を移すことによって、2日ごとにB細胞の膨張媒体をリフレッシュしなさい。400×gで5分間遠心し、ペレットを乱さずに上清を捨てます。100 μLの新鮮な B 細胞拡張培地で細胞を再懸濁し、24 ウェル組織培養プレートのウェルに移します。培地容量を上げて、5×10^個の5細胞/mLで最終的な細胞濃度を達成します。
    注:48ウェルプレートは、最大1 mLの媒体/ウェルを保持することができます。24ウェルプレートは、最大2 mL培地/ウェルを保持することができます。12ウェルプレートは最大4 mL培地/ウェルを保持でき、6ウェルプレートは最大8 mL培地/ウェルを保持できます。
21. 流量サイトメトリー解析、TIDE分析、および接合PCRなどのダウンストリーム解析を実行する前に、少なくとも5日間は、操作した細胞を拡張できます。

結果

更新された拡張および活性化プロトコルにより、7日間でB細胞の急速な拡張が最大44倍になりました(図1;n =3ドナー)。KO実験では、トリパンブルー染色を用いたB細胞数は、24時間のポストエレクトロポレーションでの対照およびCD19 KOサンプルの両方で細胞回収のわずかな減少を伴う80%以上の生存細胞を示した(図2A;p≥0.05、n=3ドナー)。この結果は、エ...

ディスカッション

原発ヒトB細胞における精密ゲノム工学は最近^9,10まで挑戦されてきた。我々は以前にCRISPR /Cas9を使用して主要なヒトB細胞⁹を設計するプロトコルを公開していた。ここでは、CD19の効率的なKOまたはノックインEGFPを可能にするB細胞の分離、拡張、およびエンジニアリングのための改良されたプロトコルの概要を説明します。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug	IDT	1081059	smaller size is also available
Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT)	Lonza	V4XP-3032
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer	Quality Biological	118-156-101
CleanCap chemically modified Cas9 mRNA	Trilink Biotechnology	L-7206-1000
CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg	Invivogen	TLRL-2006-5	different sizes available
Cryostor CS10, 100 mL	STEMCELL Technology	7930
CTS Immune Cell SR	Thermo Fisher Scientific	A2596101
EasySep human B cells isolation kit	STEMCELL Technology	17954
eBioscience fixable viability dye eFlour 780	eBiosciences	65-0865-14
Excellerate B cell media, Xeno-free	R&D Systems	CCM031	B-cell basal medium
Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube	Corning	352059
Fetal Bovine Serum (FBS)	R&D Systems	S11550	For thawing B cells only
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03
GeneMate SnapStrip® 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps	BioExpress	T-3035-1 / 490003-692
Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS	GE lifesciences	SH30256.01
Lonza 4D Nucleofector core unit	Lonza	AAF-1002B
Lonza 4D Nucleofector X unit	Lonza	AAF-1002X
Mega CD40 Ligand	Enzo Life Sciences	ALX-522-110-C010
Mr. Frosty	Sigma-Aldrich	C1562-1EA	For freezing cells
Pen/Strep 100X	Sigma-Aldrich	TMS-AB2-C
PerCP anti-human CD19 clone HIB19	biolegend	302228	smaller size is also available
rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.)	Vigene Biosciences	N/A	large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL
Recombinant human IL-10 protein 250 ug	R&D Systems	217-IL-250	different sizes available
Recombinant human IL-15 protein 25 ug	R&D Systems	247-ILB-025	different sizes available
The Big Easy EasySep Magnet	STEMCELL Technology	18001	different sizes available
Tris-EDTA (TE) buffer	Fisher Scientific	BP2476100