Геномная инженерия первичных клеток человека B с использованием CRISPR/Cas9

Резюме

Здесь мы предоставляем подробный, шаг за шагом протокол для CRISPR / Cas9 основе генома инженерных первичных клеток человека B для гена нокаут (KO) и стук-в (KI) для изучения биологических функций генов в клетках В и развитие В-клеточной терапии.

Аннотация

В-клетки являются лимфоцитами, полученными из гематопоэтических стволовых клеток и являются ключевым компонентом гуморальной руки адаптивной иммунной системы. Они делают привлекательных кандидатов для клеточной терапии из-за их легкости изоляции от периферической крови, их способность расширяться в пробирке, и их долговечность in vivo. Кроме того, их нормальная биологическая функция – производить большое количество антител – может быть использована для выражения очень большого количества терапевтического белка, такого как рекомбинантное антитело для борьбы с инфекцией, или фермент для лечения энзимопатий. Здесь мы предоставляем подробные методы для изоляции первичных клеток человека B от периферических моноядерных клеток крови (PBMCs) и активации / расширения изолированных В-клеток in vitro. Затем мы демонстрируем шаги, связанные с использованием системы CRISPR/Cas9 для конкретного участка KO эндогенных генов в клетках группы В. Этот метод позволяет эффективно кОК различных генов, которые могут быть использованы для изучения биологических функций генов, представляющих интерес. Затем мы демонстрируем шаги по использованию системы CRISPR/Cas9 вместе с рекомбинантным, адено-ассоциированным, вирусным (rAAV) вектором для эффективной интеграции трансгенной экспресс-кассеты в B-клетках. Вместе этот протокол обеспечивает пошаговую инженерную платформу, которая может быть использована в первичных клетках В человека для изучения биологических функций генов, а также для развития В-клеточной терапии.

Введение

В-клетки являются подгруппой линии лимфоцитов, полученных из гематопоэтических стволовых клеток. Они выполняют важную роль в адаптивной гуморальной иммунной системе, производя большое количество антител в ответ на иммунные проблемы¹. В-клетки также являются предшественниками клеток памяти В и неизлечимо дифференцированных, долгоиговых плазменных клеток, обеспечивая тем самым прочный гуморальный^{иммунитет 2.} Плазменные клетки, в частности, уникальны среди иммунных клеток в их способности производить большое количество конкретных антител, выживая в течение многих лет или^{десятилетий 3}. Кроме того, легкость изоляции от периферической крови делает линию B-клеток отличным кандидатом для новых клеточных методов^{лечения 4.}

Ранее методы случайной интеграции, такие как использование лентивирусных векторов или транспосона Спящей Красавицы, использовались для разработки В-клеток для доставки^{и выражения трансгенов 5,6,7,8.} Однако неспецифический характер этих подходов затрудняет изучение биологических функций конкретного гена в клетках группы В и несет в себе риск вставки мутагенеза и переменной трансгенной экспрессии и/или замалчивания в терапевтической обстановке.

Система CRISPR/Cas9 является мощным инструментом инженерии генома, который позволяет исследователям точно редактировать геном различных клеток различных видов. В последнее время две группы, в том числе наши собственные, успешно разработали методы расширения ex vivo и целенаправленной инженерии генома первичных^{клеток человека B 9,10}. Мы опишем процесс очистки первичных клеток человека B из образца лейкофореза. После этого мы опишем наш обновленный протокол расширения B-клеток и активации изолированных В-клеток. Затем мы опишем процесс выбивания кластера дифференциации 19 (CD19), специфического В-клеточного рецептора и отличительной чертой В-клеток, путем электропорации для введения CRISPR/Cas9 mRNA вместе с CD19 sgRNA в активированные B-клетки.

Cas9 мРНК переводится и связывается с CD19 sgRNA, чтобы сформировать CRISPR/Cas9-sgRNA рибонуклеопротеин комплекс (RNP). Впоследствии, sgRNA в комплексе приводит Cas9 к созданию двухцепочего разрыва (DSB) в целевой последовательности на exon 2 гена. Клетки будут ремонтировать DSB путем "не-гомологичный конец присоединения" путем введения или удаления нуклеотидов, что приводит к мутации кадров и вызывая ген будет выбит. Затем мы измерим потерю CD19 по цитометрии потока и проанализируем образование индрета путем отслеживания иделей путем анализа разложения (TIDE).

Затем мы опишем процесс использования CRISPR/Cas9 вместе с рекомбинантным вектором AAV6 (rAAV6, донорским шаблоном для гомологического ремонта (HDR)) для опоставки вставки расширенного зеленого флуоресцентного белка(EGFP) на адено-ассоциированном вирусе интеграционного сайта 1 (AAVS1). Ген AAVS1 является активным локусом без известных биологических функций и местом вирусной интеграции AAV в геноме человека; поэтому он считается «безопасной гаванью» для геномной инженерии. Здесь мы сообщаем, что расширение и активация В-клеток позволили до 44-кратного расширения в 7 дней культуры(рисунок 1). Электропорация В-клеток показала небольшое снижение общего здоровья клеток(рисунок 2A) при 24 ч после трансфекции. Рассеянный анализ участка маркера CD19(рисунок 2B) показал до 83% сокращения отредактированных ячеек(рисунок 2C).

Анализ TIDE хроматографов (рисунок3A) показал, что % indels был похож на % потери белка по цитометрии потока(рисунок 3B). Цитометрия потока анализа эксперимента KI показала, что клетки, получившие вектор AAV(рисунок 4),вместе с RNP, выразили до 64% EGFP-положительных клеток(рисунок 5A),а затем показали успешную интеграцию путем соединения полимеразной цепной реакции (PCR) (Рисунок 5B). Количество ячеек показало, что все образцы быстро восстанавливаются в течение 3 дней после инженерии(рисунок 5C).

протокол

Образцы лейкафереза у здоровых доноров были получены в местном банке крови. Все эксперименты, описанные здесь, были определены как освобождаемые от исследований Институциональным советом по обзору (IRB) и были одобрены Институциональным комитетом по биобезопасности (МКБ) в Университете Миннесоты.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты проводились в соответствии с универсальной мерой предосторожности для патогенных микроорганизмов, передающихся через кровь, с стерильными/асептическими методами и надлежащим оборудованием уровня биобезопасности-2.

1. Подготовка добавок для B-клеток расширения среды

1. Восстановить cpG олигонуклеотид до концентрации 1 мг/мл.
2. Восстановить лиганд CD40 (CD40L) до концентрации 100 мкг/мл.
3. Восстановлен рекомбинантный человек ИЛ-10 (RHIL-10) с концентрацией 50 мкг/мл.
4. Реконститующий рекомбинантный человеческий Ил-15 (RHIL-15) с концентрацией 10 мкг/мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите каждое дополнение в небольших aliquots при -20 градусов по Цельсию до -80 градусов по Цельсию на срок до 6 месяцев.

2. Подготовка базальной среды

1. Объедините B-клеточную базальную среду с 5% (v/v) медиа дополнением для расширения иммунных клеток in vitro (например, CTS Immune Cell SR) и 1% (v/v) пенициллин и стрептомицин.
2. Фильтр-стерилизовать базальной среде с помощью фильтра 0,22 мкм адаптер в стерилизованную бутылку.
3. Держите базально-подкольную среду при 4 градусах Цельсия на срок до 1 месяца.

3. Подготовка среды расширения B-клеток

1. Передача необходимого количества базальной среды в стерильный контейнер для культуры В-клеток на 5 ×^{10 5} клеток/мл.
2. Дополните базальную среду 1 мкг/мл CpG, 100 нг/мл CD40L, 50 ng/mL rhIL-10 и 10 ng/mL rhIL-15.
3. Фильтруйте среду расширения B-клеток с помощью фильтра 0,22 мкм.
4. Equilibrate B-клеток расширения среды в инкубаторе культуры тканей при 37 градусов по Цельсию, 5% CO₂ с влажностью, по крайней мере 30 минут перед использованием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка свежих B-клеток расширения среды для использования в течение одного дня. Не подготовьтесь к использованию среды расширения B-клеток в течение нескольких дней. Этот рецепт средств массовой информации поощряет распространение клеток памяти В и активированных первичных клеток человека B.

4. Очистка и расширение В-клеток человека

ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте 99-100% изопропиловый спирт в контролируемый температурой замораживающий контейнер, следуя указанию производителя, и охладите замораживающий контейнер при температуре 4 градусов по Цельсию перед началом шага 4.1.

1. Изолировать ПХМ От образца лейкофореза
   1. Перенесите образец лейкофореза (приблизительно 8-10 мл) в стерильную коническую трубку 50 мл.
   2. Довести громкость до 35 мл с стерильным 1x фосфат-буферным солевым раствором (PBS).
   3. Тщательно слой 35 мл лейкафорез образца на 15 мл плотности градиента среды.
   4. Центрифуга при 500 × г в течение 25 мин без тормоза, удалите плазменный слой, не нарушая баффи пальто (слой PBMC), соберите ПБК из интерфейса и перенесите в новую стерильную коническую трубку 50 мл.
   5. Довять ПМГ до 50 мл с 1x PBS.
   6. Центрифуга при 500 × 5 мин без тормозов. Удалите супернатант, не нарушая гранулы PBMC, которые могут показаться красными.
   7. Добавьте 7 мл буфера лиза аммония-хлорида калия, пипетку 3 раза, чтобы хорошо перемешать, и инкубировать при комнатной температуре (RT) в течение 3 минут.
   8. Доветь громкость до 50 мл с 1x PBS.
   9. Центрифуга при 400 × г в течение 5 мин с тормозом низкого сопротивления. Удалите супернатант, не нарушая гранулы. Гранулы должны выглядеть розовато или белыми.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы продолжить культуру свежеиспеченные В-клетки, подготовьте среду расширения B-клеток перед началом изоляции B-клеток (шаг 4.2).
2. B-клеточная изоляция от PBMCs с использованием человека первичного B-клеток отрицательной изоляции комплект
   1. Повторное количество ПБМК в буфере изоляции до концентрации 5 × 10⁷ ячеек/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если общее количество ПБМТ составляет менее 5 × 10^{7 ячеек,} смоем объем буфера изоляции для поддержания 5 × 10⁷ ячеек/мл. Минимальные и максимальные объемы подвески ячейки - 0,25 мл и 8 мл соответственно.
   2. Перенесите до 8 мл (5 × 10^{7 клеток/мл)} в стерильную, полипропиленовую, круглую нижнюю трубку с крышкой.
   3. Добавьте в ПКМЦ 50 йл/мл усилителя коктейлей.
   4. Добавьте 50 йл/мл изоляционные коктейли в ПКМС, крышка трубки, и инвертировать 2-3 раза, чтобы смешать.
   5. Инкубация на RT в течение 5 мин; на^4-й минуте инкубации вихревые магнитные микробусы не менее 30 с.
   6. Передача 50 МКЛ магнитных микробусов на 1 мл ПБМТ, крышка трубки, и инвертировать 2-3 раза, чтобы смешать.
   7. Пополнить до 10 мл с буфером изоляции и аккуратно пипеткой вверх и вниз 2-3 раза.
   8. Поместите трубку в магнитной станции и инкубировать на RT в течение 3 минут.
   9. Держите магнит и трубку вместе, и одним движением, инвертировать магнит и трубку вместе, чтобы залить подвеску клетки в новую трубку. Отбросьте старую трубку.
   10. Повторите шаг 4.2.8 (уменьшите время инкубации до 2 мин) и вылейте В-клеточную подвеску в чистую коническую трубку.
   11. Обогащенные В-клетки готовы к использованию. Если ячейки будут использованы немедленно, продолжайте раздел 4.3 (Расширение В-клеток человека). Проверьте чистоту изолированных В-клеток по цитометрии потока (по желанию). Если ячейки должны быть заморожены перед использованием, продолжайте шаг 4.2.12.
   12. Чтобы заморозить В-клетки, центрифуга при 400 × в течение 5 минут, и отбросить супернатант, не нарушая гранулы.
   13. Повторное замораживание клеток в среде замораживания при 10⁷ клетках/мл и aliquot 1 мл/криовиальный.
   14. Поместите криовиал в охлажденный замораживающий контейнер и храните при -80 градусов по Цельсию на ночь; затем перенесите замороженный криовиальный в резервуар с жидким азотом; держать замороженные клетки до 1 года.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемая доходность изолированных В-клеток составляет 2%-8% от общего объема ПХМТ, при этом 95%-99% жизнеспособности.
3. Расширение B-клеток человека
   ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании недавно изолированных В-клеток пропустите шаги 4.3.1-4.3.5. Подсчитайте клетки и перенесите необходимое количество клеток в стерильную коническую трубку и продолжайте шаг 4.3.6.
   1. Предварительно теплая сыворотка крупного рогатого скота плода (FBS) в водяной бане до оттаивания В-клеток. Подготовьте 20 мл среды расширения B-клеток, перенесите в колбу T25 и предварительно эквилибруйте среду в инкубаторе ткани-культуры (при 37 градусов по Цельсию, 5% CO₂, с влажностью) не менее чем за 15 минут до использования.
   2. Клетки оттепели B в водяной бане 37 градусов по Цельсию. Во время ожидания перенесите 2 мл предварительно разогретой FBS в стерильную коническую трубку 15 мл.
   3. После того, как В-клетки полностью разморожены, немедленно добавьте в образец 1 мл предварительно разогретого FBS, дроп-мудрый. Инкубация на RT в течение 1 мин.
   4. Аккуратно пипетку для повторного перерасхода образца и передачи всего объема, dropwise, в коническую трубку, содержащую 2 мл предварительно разогретой FBS.
   5. Довнесите громкость до 15 мл со стерильным 1x PBS, крышкой и инвертировать трубку осторожно 2-3 раза.
   6. Центрифуга при 400 × в течение 5 мин.
   7. Отбросьте супернатант, не нарушая клеточные гранулы, перерасходуйте клеточные гранулы с помощью 1 мл предварительно равнорассмысленой среды расширения В-клеток и посчитайте клетки. Общее количество клеток должно быть около 10^{7 ячеек.}
   8. Перенесите клетки в колбу, содержащую 20 мл предварительно равнорассмысленой среды расширения B-клеток. Окончательная концентрация клеток должна быть примерно 5 х 10⁵ клеток/мл.
   9. Инкубировать колбу вертикально в инкубаторе ткани-культуры.
   10. Освежите среду расширения полностью каждые 2 дня, передав весь объем В-клеток в стерильную коническую трубку и повторите шаги 4.3.6-4.3.9.
       ПРИМЕЧАНИЕ: T25 колба может в течение 10-20 мл среды; Колба T75 может вьться до 20-60 мл среды.

5. Первичная инженерия B-клеток человека

1. Инженерные B-клетки на 48 ± 2 ч после расширения/активации для достижения оптимальных результатов. Подготовьте среду расширения B-клеток, aliquot 1 мл среды в 48-хорошо ткани культуры пластины, и до эквилибрата в ткани культуры инкубатора по крайней мере 15 минут до использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При проектировании CRISPR/Cas9 sgRNA для гена, представляющих интерес, следуйте шагам, изложенным ниже.
   - Дизайн sgRNAs с помощью онлайн-инструмента¹¹.
   - Дизайн sgRNAs на экзон, который является общим для всех изоформ белка.
   - Заказать химически модифицированные sgRNA от авторитетных компаний.
   - sgRNA обычно приходит в лиофилизированной форме; восстановленная сгРНК в стерильном буфере DNase/RNase Без Трис-ЭДТА (TE) с концентрацией 1 мкг/ОЛ.
2. Подготовка CRISPR/Cas9 трансфицирует субстрат путем смешивания 1 мкл (1 мкг/ЛЬ) химически модифицированной сгРНК с 1,5 МЛ (1 мкг/ЛЬ) химически модифицированных стрептококковых пиогенов Cas 9 (S.p. Cas9) ядра в трансфекции реакции. Для контроля используйте 1 МКЛ буфера TE вместо sgRNA.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Когда CD19 sgRNA используется для эксперимента KO гена, см. Рисунок 2 для результатов. Когда AAVS1 sgRNA используется для эксперимента гена KI, см. Рисунок 5 для результатов.
   • Храните все компоненты на льду.
3. Смешайте осторожно и перенесите 2,5 мл трансфектного субстрата CRISPR/Cas9 на реакцию в трубку 8-трубчатой полосы 0,2 мл; отложить на RT.
4. Включите нуклеофектор (электропоратор) и подготовь реагенты трансфекции, как показано в таблице 1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это хороший шаг для паузы, если это необходимо, поставив все реагенты на лед. Удалите все реагенты со льда, когда готовы возобновить эксперимент. При использовании белка S.p. Cas9, исследователь должен предварительно комплекс CRISPR/Cas9-sgRNA рибонуклеопротеин путем смешивания 1 мкг сгРН с 5 мкг белка S.p. Cas9, избегая каких-либо пузырьков, и инкубации смеси на RT, по крайней мере 20 минут до использования для достижения оптимальных результатов.
5. Подсчитайте и перенесите 10⁶ В-клеток на реакцию трансфекции в стерильную коническую трубку.
6. Довяжте объем до 15 мл со стерильным 1x PBS и центрифугой при 400 × в течение 5 минут. Ожидая, подготовь основной реагент трансфекции клеток(таблица 2)и отложите на RT.
7. Откажитесь от супернатанта, не нарушая клеточные гранулы.
8. Повторное распределение клеточной гранулы с 10 мл стерильных 1x PBS и центрифуги при 400 × в течение 5 мин.
9. Отбросьте супернатант полностью, не нарушая гранулы клетки.
10. Передача 0,5 мкг химически модифицированной GFP мРНК (в качестве трансфекции репортер) на 10^{6 В-клеток} в ячейку гранулы (по желанию).
11. Повторное поглощение клеточной гранулы с 20 йл первичной клеточной трансфекции реагент на 10^{6 В клеток;} аккуратно перемешать, промокая 5-6 раз. Перенесите 20,5 МКЛ на трансфекцию в 0,2 мл трубки 8-трубчатой полосы, содержащей 2,5 МКЛ трансфектного субстрата CRISPR/Cas9.
12. Pipette вверх и вниз один раз, чтобы смешать и передать весь объем (23 МКЛ) в трансфекции cuvette. Крышка и нажмите cuvette на скамейке осторожно, чтобы убедиться, что жидкость охватывает дно кювета.
13. Используйте первичный В-клеточный протокол человека на нуклеофекторе для трансфекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нуклеофектор (электропоратор) может быть помещен и использоваться вне ткани культуры капота. Cap cuvette для обеспечения стерильности.
14. Отдых электропоротерных клеток в кювете на RT в течение 15 мин.
15. Передача 80 МКЛ предварительно equilibrated B-клеток расширения среды из ткани культуры пластины в трансфекции реакции в cuvette. Поместите кюветт в инкубатор культуры тканей на 30 мин.
16. Аккуратно пипетку пару раз смешать и перенести весь объем образца из кюветта в соответствующий колодец 48-хорошо ткани культуры пластины, содержащей 1 мл B-клеток расширения среды. Окончательная концентрация клеток должна быть 10⁶ клеток/мл.
17. При проведении эксперимента по гену KI переносит вектор rAAV6 на 500 000 кратности инфекции в соответствующий хорошо содержащий электропотерные клетки (примерно 45 мин после электропорации). Смотрите пример векторной конструкции rAAV6 на рисунке 4A.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Например: контрольный образец будет электропотезирован без CRISPR/Cas9 или вектора rAAV6. Образец только для переносчиков будет электропотезирован без CRISPR/Cas9, а затем трансурсирован с вектором rAAV6. Образец KI будет электропотезирован с помощью CRISPR/Cas9, а затем транспонирован с вектором rAAV6. rAAV6 должен содержать гомологические руки вверх и вниз по течению от целевого сайта DSB для HDR.
18. Поместите пластину в инкубатор культуры тканей при 37 градусах Цельсия и 5% CO_{2 с} влажностью.
19. Подсчитайте ячейки и засчитайте жизнеспособность в первый день после инженерии.
20. Освежите среду расширения B-клеток каждые 2 дня, подсчитывая клетки, а затем перенося весь объем клеток в чистую микроцентрифугную трубку объемом 1,5 мл. Центрифуга при 400 × в течение 5 минут, и отбросить супернатант, не нарушая гранулы. Повторное распространение клеток с 100 йл свежей среды расширения B-клеток, и передача в колодец 24-хорошо пластины культуры тканей. Принесите средний объем для достижения окончательной концентрации клеток на 5 × 10⁵ клеток/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 48-хорошо пластина может в течение 1 мл среднего / хорошо; 24-хорошо пластина может в течение 2 мл среднего / хорошо; 12-хорошо пластина может ввести до 4 мл среднего / хорошо, и 6-хорошо пластины может в течение 8 мл среднего / хорошо.
21. Разрешить инженерии клеток расширить, по крайней мере 5 дней, прежде чем выполнять вниз по течению анализы, такие как для анализа цитометрии потока, TIDE анализа и соединения ПЦР.

Результаты

Обновленный протокол расширения и активации позволил быстро расширить В-клетки до 44 раз за 7 дней(рисунок 1; n No 3 доноров). В эксперименте KO, B-клеток кол с использованием Trypan синий окрашивания показали более 80% жизнеспособных клеток с небольшим снижением восстановления кл...

Обсуждение

Точная инженерия генома в первичных клетках человека B была сложной задачей до^{недавнего времени 9,10}. Ранее мы публиковали протоколы с использованием CRISPR/Cas9 для инженера первичных клеток B человека⁹. Здесь мы наметим улучшенные протоколы для и...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug	IDT	1081059	smaller size is also available
Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT)	Lonza	V4XP-3032
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer	Quality Biological	118-156-101
CleanCap chemically modified Cas9 mRNA	Trilink Biotechnology	L-7206-1000
CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg	Invivogen	TLRL-2006-5	different sizes available
Cryostor CS10, 100 mL	STEMCELL Technology	7930
CTS Immune Cell SR	Thermo Fisher Scientific	A2596101
EasySep human B cells isolation kit	STEMCELL Technology	17954
eBioscience fixable viability dye eFlour 780	eBiosciences	65-0865-14
Excellerate B cell media, Xeno-free	R&D Systems	CCM031	B-cell basal medium
Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube	Corning	352059
Fetal Bovine Serum (FBS)	R&D Systems	S11550	For thawing B cells only
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03
GeneMate SnapStrip® 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps	BioExpress	T-3035-1 / 490003-692
Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS	GE lifesciences	SH30256.01
Lonza 4D Nucleofector core unit	Lonza	AAF-1002B
Lonza 4D Nucleofector X unit	Lonza	AAF-1002X
Mega CD40 Ligand	Enzo Life Sciences	ALX-522-110-C010
Mr. Frosty	Sigma-Aldrich	C1562-1EA	For freezing cells
Pen/Strep 100X	Sigma-Aldrich	TMS-AB2-C
PerCP anti-human CD19 clone HIB19	biolegend	302228	smaller size is also available
rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.)	Vigene Biosciences	N/A	large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL
Recombinant human IL-10 protein 250 ug	R&D Systems	217-IL-250	different sizes available
Recombinant human IL-15 protein 25 ug	R&D Systems	247-ILB-025	different sizes available
The Big Easy EasySep Magnet	STEMCELL Technology	18001	different sizes available
Tris-EDTA (TE) buffer	Fisher Scientific	BP2476100