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  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí proporcionamos un protocolo detallado paso a paso para la ingeniería genómica basada en CRISPR/Cas9 de células B humanas primarias para el knockout genético (KO) y el knock-in (KI) para estudiar las funciones biológicas de los genes en las células B y el desarrollo de la terapia de células B.

Resumen

Las células B son linfocitos derivados de células madre hematopoyéticas y son un componente clave del brazo humorístico del sistema inmunitario adaptativo. Hacen candidatos atractivos para terapias basadas en células debido a su facilidad de aislamiento de la sangre periférica, su capacidad para expandirse in vitro, y su longevidad in vivo. Además, su función biológica normal — para producir grandes cantidades de anticuerpos — se puede utilizar para expresar cantidades muy grandes de una proteína terapéutica, como un anticuerpo recombinante para combatir la infección, o una enzima para el tratamiento de las enzimopatías. Aquí, proporcionamos métodos detallados para aislar las células B humanas primarias de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) y activar/expandir células B aisladas in vitro. A continuación, demostramos los pasos implicados en el uso del sistema CRISPR/Cas9 para el KO específico del sitio de genes endógenos en células B. Este método permite el KO eficiente de varios genes, que se pueden utilizar para estudiar las funciones biológicas de los genes de interés. A continuación, demostramos los pasos para utilizar el sistema CRISPR/Cas9 junto con un vector viral (rAAV) recombinante, asociado a adeno, para una integración eficiente específica del sitio de un cassette de expresión de transgénero en celdas B. Juntos, este protocolo proporciona una plataforma de ingeniería paso a paso que se puede utilizar en células B humanas primarias para estudiar las funciones biológicas de los genes, así como para el desarrollo de la terapia de células B.

Introducción

Las células B son un subgrupo del linfanato derivado de células madre hematopoyéticas. Desempeñan un papel crítico en el sistema inmune humorístico adaptativo mediante la producción de grandes cantidades de anticuerpos en respuesta a los desafíos inmunes1. Las células B también son precursoras de las células B de la memoria y las células plasmáticas de larga duración diferenciadas terminalmente, proporcionando así inmunidad humorística duradera2. Las células plasmáticas, en particular, son únicas entre las células inmunes en su capacidad para producir grandes cantidades de un anticuerpo específico mientras sobreviven durante años o décadas3. Además, la facilidad de aislamiento de la sangre periférica hace que el linaje de células B sea un excelente candidato para nuevas terapias basadas en células4.

Anteriormente, los métodos de integración aleatoria, como los que utilizan vectores lentivirales o un transposon de la Bella Durmiente, se han utilizado para diseñar células B para la entrega de transgéneros y la expresión5,6,7,8. Sin embargo, la naturaleza no específica de estos enfoques dificulta el estudio de las funciones biológicas de un gen específico en las células B y conlleva un riesgo inherente de mutagénesis insertal y expresión y/o silenciamiento variable de transgénero en el entorno terapéutico.

El sistema CRISPR/Cas9 es una poderosa herramienta de ingeniería del genoma que permite a los investigadores editar con precisión el genoma de varias células en numerosas especies. Recientemente, dos grupos, incluido el nuestro, han desarrollado con éxito métodos para la expansión ex vivo y la ingeniería genómica dirigida de las células B humanas primarias9,10. Describiremos el proceso de purificación de las células B humanas primarias de una muestra de leucoforesis. Después de eso, describiremos nuestro protocolo actualizado para la expansión de células B y la activación de celdas B aisladas. A continuación, describiremos un proceso para noquear un cúmulo de diferenciación 19 (CD19), un receptor específico de células B y un sello distintivo de las células B, mediante la electroporación para introducir el ARNM CRISPR/Cas9 junto con el ARGN CD19 en las células B activadas.

Cas9 mRNA se traduce y se une al SgRNA CD19 para formar un complejo crispr/cas9-sgRNA ribonucleoprotein (RNP). Posteriormente, el esgRNA en el complejo lleva a Cas9 a crear rotura de doble hebra (DSB) en la secuencia objetivo en el exón 2 del gen. Las células repararán el OSD mediante "unión final no homóloga" mediante la introducción o eliminación de nucleótidos, lo que conduce a la mutación del cambio de trama y hace que el gen sea noqueado. A continuación, mediremos la pérdida de CD19 por citometría de flujo y analizaremos la formación de indel mediante el seguimiento de los indels mediante el análisis de la descomposición (TIDE).

A continuación, describiremos el proceso de uso de CRISPR/Cas9 junto con un vector AAV6 recombinante (rAAV6, una plantilla de donante para la reparación dirigida por homología (HDR)) para mediar la inserción específica del sitio de proteína fluorescente verde mejorada(EGFP) en el gen del sitio de integración del virus asociado al adeno 1 (AAVS1). El gen AAVS1 es un locus activo sin funciones biológicas conocidas y un sitio de integración viral AAV en el genoma humano; por lo tanto, se considera un "puerto seguro" para la ingeniería del genoma. Aquí, informamos que la expansión y activación de las células B permitió hasta 44 veces la expansión en 7 días de cultivo (Figura 1). La electroporación de las células B mostró una ligera reducción de la salud celular general(Figura 2A)a las 24 h después de la transfección. El análisis de la gráfica de dispersión del marcador CD19 (Figura 2B) mostró una reducción de hasta el 83% en las celdas editadas (Figura 2C).

El análisis tide de los cromatógrafos (Figura 3A) reveló que el % de indels era similar al % de pérdida de proteína por citometría de flujo (Figura 3B). El análisis de citometría de flujo del experimento KI mostró que las células que recibieron el vector AAV(Figura 4),junto con RNP, expresaron hasta un 64% de células positivas por EGFP(Figura 5A)y más tarde mostraron una integración exitosa por reacción en cadena de la polimerasa de unión (PCR) (Figura 5B). Los recuentos de células mostraron que todas las muestras se recuperaron rápidamente dentro de los 3 días posteriores a la ingeniería(Figura 5C).

Protocolo

Se obtuvieron muestras de leucoféresis de donantes sanos de un banco de sangre local. Todos los experimentos descritos aquí fueron determinados como exentos para la investigación por la Junta de Revisión Institucional (IRB) y fueron aprobados por el Comité Institucional de Bioseguridad (IBC) de la Universidad de Minnesota.

NOTA: Todos los experimentos se realizaron en cumplimiento de la precaución universal para patógenos transmitidos por la sangre, con técnicas estériles/asépticas y equipos adecuados de nivel 2 de bioseguridad.

1. Preparar suplementos para el medio de expansión de células B

  1. Reconstituir oligonucleótido CpG a una concentración de 1 mg/ml.
  2. Reconstituir ligando CD40 (CD40L) a una concentración de 100 μg/ml.
  3. Reconstituir il-10 humano recombinante (rhIL-10) a una concentración de 50 μg/ml.
  4. Reconstituir el humano recombinante IL-15 (rhIL-15) a una concentración de 10 μg/ml.
    NOTA: Mantenga cada suplemento en alícuotas pequeñas a -20 °C a -80 °C durante un tiempo de hasta 6 meses.

2. Preparar el medio basal

  1. Combine el medio basal de células B con un suplemento de medios de 5% (v/v) para la expansión de células inmunes in vitro (por ejemplo, CTS Immune Cell SR) y 1% (v/v) penicilina y estreptomicina.
  2. Filtre-esterilizar el medio basal utilizando un adaptador de filtro de 0,22 μm en una botella esterilizada.
  3. Mantenga el medio basal a 4 °C durante un mes.

3. Preparar el medio de expansión de células B

  1. Transfiera la cantidad requerida del medio basal a un recipiente estéril para cultivo de las células B a 5 × 105 celdas/ml.
  2. Complementar el medio basal con 1 μg/mL CpG, 100 ng/mL CD40L, 50 ng/mL rhIL-10 y 10 ng/mL rhIL-15.
  3. Filtre el medio de expansión de células B utilizando un filtro de 0,22 μm.
  4. Eequilibrar el medio de expansión de células B en la incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C, 5% CO2 con humedad durante al menos 30 minutos antes de su uso.
    NOTA: Prepare el medio de expansión de células B fresco para usarlo durante un día. No prepare el medio de expansión de células B para usarlo durante varios días. Esta receta de medios fomenta la proliferación de células B de memoria y células B humanas primarias activadas.

4. Purificación y expansión de células B humanas

NOTA: Agregue alcohol isopropílico 99-100% a un recipiente de congelación controlado por temperatura, siguiendo las instrucciones del fabricante, y enfríe el recipiente congelado a 4 °C antes de iniciar el paso 4.1.

  1. Aísle los PBMCs de una muestra de leucoforesis
    1. Transfiera una muestra de leucoforesis (aproximadamente 8-10 ml) a un tubo cónico estéril de 50 ml.
    2. Sube el volumen a 35 ml con solución salina estéril de 1x tamponado de fosfato (PBS).
    3. Coloque cuidadosamente una muestra de leucoforesis de 35 ml en 15 ml de medio de gradiente de densidad.
    4. Centrífuga a 500 × g durante 25 minutos sin freno, retire la capa de plasma sin perturbar la capa buffy (capa PBMC), recoja los PBMCs de la interfaz y transfiérala a un nuevo tubo cónico estéril de 50 ml.
    5. Suba los PBMCs a 50 mL con 1x PBS.
    6. Centrífuga a 500 × g durante 5 minutos sin freno. Retire el sobrenadante sin perturbar el pellet PBMC, que puede parecer rojo.
    7. Añadir 7 ml de amortiguador de lisis de amonio-cloruro-potasio, pipeta 3 veces para mezclar bien e incubar a temperatura ambiente (RT) durante 3 minutos.
    8. Sube el volumen a 50 mL con 1x PBS.
    9. Centrífuga a 400 × g durante 5 minutos con freno de baja resistencia. Retire el sobrenadante sin molestar al pellet. El pellet debe verse rosado o blanco.
      NOTA: Para continuar cultivando las células B recién aisladas, prepare el medio de expansión de células B antes de iniciar el aislamiento de células B (paso 4.2).
  2. Aislamiento de células B de los PBMCs usando el kit de aislamiento negativo de células B primario humano
    1. Resuspend PBMCs en el búfer de aislamiento a una concentración de 5 × 107 celdas/ml.
      NOTA: Si el número total de PBMCs es inferior a 5 × 107 celdas, reduzca el volumen del búfer de aislamiento para mantener 5 × 107 celdas/ml. Los volúmenes mínimos y máximos de suspensión celular son de 0,25 ml y 8 ml, respectivamente.
    2. Transfiera hasta 8 ml (5 × 107 células/ml) a un tubo estéril, polipropileno, de fondo redondo con tapa.
    3. Añadir 50 μL/ml de Coctelera a los PBMCs.
    4. Añadir 50 μL/ml de cóctel de aislamiento a los PBMCs, tapar el tubo e invertir 2–3 veces para mezclar.
    5. Incubar en RT durante 5 min; en el minuto4 de incubación, las microperlas magnéticas de vórtice durante al menos 30 s.
    6. Transfiera 50 μL de microperlas magnéticas por 1 ml de PBMCs, cap el tubo e invierta 2-3 veces para mezclar.
    7. Cubra hasta 10 ml con búfer de aislamiento y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo 2–3 veces.
    8. Coloque el tubo en una estación magnética e incubar en RT durante 3 minutos.
    9. Sostenga el imán y el tubo juntos, y en un solo movimiento, invierta el imán y el tubo juntos para verter la suspensión celular en el nuevo tubo. Deseche el tubo viejo.
    10. Repita el paso 4.2.8 (reduzca el tiempo de incubación a 2 min) y vierta la suspensión de la célula B en un tubo cónico limpio.
    11. Las células B enriquecidas están listas para usarse. Si las células se utilizarán inmediatamente, continúe con la sección 4.3 (Expansión de células B humanas). Compruebe la pureza de las células B aisladas por citometría de flujo (opcional). Si las células deben congelarse antes de su uso, continúe con el paso 4.2.12.
    12. Para congelar las células B, centrífuga a 400 × g durante 5 minutos, y deseche el sobrenadante sin perturbar el pellet.
    13. Resuspend las células en medio de congelación a 107 células/ml, y aliquot 1 mL/criovial.
    14. Coloque el criovial en el recipiente frío de congelación y guárdelo a -80 °C durante la noche; entonces, transferir el criovial congelado a un tanque de nitrógeno líquido; mantener las células congeladas hasta 1 año.
      NOTA: El rendimiento esperado de las células B aisladas es del 2%-8% del total de PBMCs, con una viabilidad del 95%-99%.
  3. Expansión de células B humanas
    NOTA: Si utiliza células B recién aisladas, omita los pasos 4.3.1–4.3.5. Cuente las células y transfiera el número requerido de células a un tubo cónico estéril y continúe con el paso 4.3.6.
    1. Suero bovino fetal precalentado (FBS) en un baño de agua antes de descongelar las células B. Preparar 20 ml de medio de expansión de células B, transferir a un matraz T25 y preequilibrar el medio en una incubadora de cultivo tisular (a 37 °C, 5% CO2,con humedad) al menos 15 minutos antes de su uso.
    2. Descongelar células B en un baño de agua de 37 °C. Mientras espera, transfiera 2 ml de FBS precalentado a un tubo cónico estéril de 15 ml.
    3. Después de que las células B se descongelan por completo, agregue inmediatamente 1 ml de FBS pre-calentado, en cuanto a gota, en la muestra. Incuba en RT durante 1 min.
    4. Pipetear suavemente para resuspend la muestra y transferir todo el volumen, en sentido dropwise, a un tubo cónico que contiene 2 ml de FBS precalentado.
    5. Sube el volumen a 15 ml con PBS estéril de 1x, tapa e invierte el tubo suavemente 2–3 veces.
    6. Centrífuga a 400 × g durante 5 min.
    7. Deseche el sobrenadante sin perturbar el pellet celular, resuspend el pellet celular con 1 ml de medio de expansión de células B pre-equilibrado, y cuente las células. El número total de celdas debe ser de aproximadamente 107 celdas.
    8. Transfiera las células a un matraz que contenga 20 ml del medio de expansión de células B prealibrado. La concentración final de las células debe ser de aproximadamente 5 x 105 células/ml.
    9. Incubar el matraz verticalmente en una incubadora de cultivo de tejidos.
    10. Actualice el medio de expansión por completo cada 2 días transfiriendo todo el volumen de células B a un tubo cónico estéril y repita los pasos 4.3.6–4.3.9.
      NOTA: El matraz T25 puede contener 10-20 ml de medio; El matraz T75 puede contener hasta 20-60 ml de medio.

5. Ingeniería primaria de células B humanas

  1. Ingeniero células B a 48 ± 2 h después de la expansión / activación para obtener resultados óptimos. Prepare el medio de expansión de células B, la alícuota 1 ml del medio en una placa de cultivo de tejidos de 48 pozos y el preequilibrado en una incubadora de cultivo de tejidos al menos 15 minutos antes de su uso.
    NOTA: Al diseñar un gBRN CRISPR/Cas9 para un gen de interés, siga los pasos descritos a continuación.
    - Diseñar sgRNAs utilizando una herramienta en línea11.
    - Diseñar sgRNAs en un exon que sea común a todas las isoformas de la proteína.
    - Ordenar esgRNA modificado químicamente de empresas de renombre.
    - el esgRNA generalmente viene en forma liofilizada; reconstituir el sgRNA en el búfer estéril DNase/RNase-free Tris-EDTA (TE) a una concentración de 1 μg/μL.
  2. Preparar sustrato transfectante CRISPR/Cas9 mezclando 1 μL (1 μg/μL) de esgRNA modificada químicamente con 1,5 μL (1 μg/μL) de Streptococcus pyogenes Cas 9 (S.p. Cas9) de nucleasa por reacción de transfección modificada químicamente. Para el control, utilice 1 μL de tampón TE en lugar de sgRNA.
    NOTA: Cuando se utiliza ARN CD19 para un experimento de KO genético, consulte la Figura 2 para obtener resultados. Cuando se utiliza el esgRNA AAVS1 para un experimento de KI genético, consulte la Figura 5 para obtener resultados.
    • Mantenga todos los componentes en hielo.
  3. Mezcle suavemente y transfiera 2,5 μL de sustrato transfectante CRISPR/Cas9 por reacción en un tubo de una tira de 0,2 ml y 8 tubos; reservado en RT.
  4. Encienda un nucleofector (electroporador) y prepare reactivos de transfección como se muestra en la Tabla 1.
    NOTA: Este es un buen paso para una pausa, si es necesario, poniendo todos los reactivos en el hielo. Retire todos los reactivos del hielo cuando estén listos para reanudar el experimento. Cuando se utiliza la proteína S.p. Cas9, el investigador DEBE pre-complejo CRISPR/Cas9-sgRNA ribonucleoprotein mediante la mezcla de 1 μg de sgRNA con 5 μg de proteína S.p. Cas9, evitando cualquier burbuja, e incubando la mezcla en RT durante al menos 20 minutos antes de su uso para obtener resultados óptimos.
  5. Cuente y transfiera 106 células B por reacción de transfección en un tubo cónico estéril.
  6. Sube el volumen a 15 ml con PBS estéril de 1x y centrífuga a 400 × g durante 5 minutos. Mientras espera, prepare el reactivo de transfección de celda primaria(Tabla 2)y reserve en RT.
  7. Deseche el sobrenadante sin perturbar el pellet celular.
  8. Resuspend el pellet celular con 10 ml de PBS estéril 1x y centrífuga a 400 × g durante 5 min.
  9. Deseche el sobrenadante por completo sin perturbar el pellet celular.
  10. Transferir 0,5 μg de MRNA GFP modificado químicamente (como reportero de transfección) por 10 células6 B al pellet de celda (opcional).
  11. Resuspend el pellet celular con reactivo de transfección de células primarias de 20 μL por 10células 6 B; mezclar suavemente pipeteando 5-6 veces. Transfiera 20,5 μL por reacción de transfección al tubo de 0,2 ml de la tira de 8 tubos que contiene 2,5 μL del sustrato de transfección CRISPR/Cas9.
  12. Pipeta arriba y abajo una vez para mezclar y transferir todo el volumen (23 μL) a una cubeta de transfección. Tapa y toque suavemente la cubeta en el banco para asegurarse de que el líquido cubra la parte inferior de la cubeta.
  13. Utilice el protocolo de células B primaria humanas en el nucleofector para la transfección.
    NOTA: El nucleofector (electroporador) se puede colocar y utilizar fuera de la campana de cultivo de tejido. Tapar la cubeta para asegurar la esterilidad.
  14. Reposar las células electroporadas en la cubeta a RT durante 15 min.
  15. Transfiera 80 μL del medio de expansión de células B prealibrado de la placa de cultivo tisular a la reacción de transfección en la cubeta. Coloque la cubeta en la incubadora de cultivo de tejidos durante 30 minutos.
  16. Pipetear suavemente un par de veces para mezclar y transferir todo el volumen de la muestra desde la cubeta a un pozo apropiado de una placa de cultivo de tejido de 48 pozos que contiene 1 ml del medio de expansión de células B. La concentración final de las células debe ser de 106 células/ml.
  17. Si realiza un experimento de KI genético, transfiera el vector rAAV6 a 500.000 multiplicidad de infección al pozo adecuado que contenga células electroporadas (aproximadamente 45 min después de la electroporación). Véase el ejemplo de construcción vectorial rAAV6 en la figura 4A.
    NOTA: Por ejemplo: Una muestra de control se electroporará sin CRISPR/Cas9 o el vector rAAV6. Una muestra solo vectorial se electroporará sin CRISPR/Cas9 y luego se transducirá con el vector rAAV6. Una muestra KI se electroporará con CRISPR/Cas9 y luego se transducirá con el vector rAAV6. rAAV6 debe contener brazos de homología aguas arriba y abajo del sitio DSB objetivo para HDR.
  18. Coloque la placa en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C y 5% CO2 con humedad.
  19. Cuente las celdas y registre la viabilidad en el día 1 después de la ingeniería.
  20. Actualice el medio de expansión de la célula B cada 2 días contando las células y luego transfiriendo todo el volumen de las células a un tubo limpio de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrífuga a 400 × g durante 5 min, y deseche el sobrenadante sin molestar el pellet. Resuspend las células con 100 μL de medio de expansión de células B frescos, y transferir a un pozo de una placa de cultivo de tejido de 24 pozos. Sube el volumen medio para lograr una concentración celular final a 5 × 105 células/ml.
    NOTA: Una placa de 48 pozos puede contener hasta 1 mL medio/pozo; una placa de 24 pozos puede contener hasta 2 ml de medio/pozo; una placa de 12 pozos puede contener hasta 4 ml de medio/pozo, y una placa de 6 pozos puede contener hasta 8 ml de medio/pozo.
  21. Permita que las células diseñadas se expandan durante al menos 5 días antes de realizar análisis posteriores, como análisis de citometría de flujo, análisis TIDE y PCR de unión.

Resultados

El protocolo actualizado de expansión y activación permitió la rápida expansión de las células B hasta 44 veces en 7 días(Figura 1; n =3 donantes). En el experimento KO, el recuento de células B utilizando tinción azul trypan mostró más del 80% de células viables con una ligera reducción en la recuperación celular tanto en el control como en las muestras de KO CD19 a 24 h después de la electroporación(Figura 2A;p ≥ 0.05, n = 3 donantes). Este r...

Discusión

La ingeniería precisa del genoma en células B humanas primarias ha sido un reto hasta hace poco9,10. Anteriormente habíamos publicado protocolos utilizando CRISPR/Cas9 para diseñar células B humanas primarias9. Aquí, delineamos protocolos mejorados para el aislamiento, expansión e ingeniería de células B para permitir un KO eficiente de CD19 o para la EGFP.

Aquí demostramos que nuestro protoco...

Divulgaciones

Se ha presentado una patente sobre los métodos de fabricación y uso de células B editadas por el genoma con M.J.J, K.L., y B.S.M. como inventores. B.S.M es consultor y posee acciones en Immusoft Inc. Immusoft Inc. ha patrocinado la investigación en el laboratorio de B.S.M.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por el Children's Cancer Research Fund (CCRF) y nih R01 AI146009 a B.S.M.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ugIDT1081059smaller size is also available
Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT)LonzaV4XP-3032
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing bufferQuality Biological118-156-101
CleanCap chemically modified Cas9 mRNATrilink BiotechnologyL-7206-1000
CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mgInvivogenTLRL-2006-5different sizes available
Cryostor CS10, 100 mLSTEMCELL Technology7930
CTS Immune Cell SRThermo Fisher ScientificA2596101
EasySep human B cells isolation kitSTEMCELL Technology17954
eBioscience fixable viability dye eFlour 780eBiosciences65-0865-14
Excellerate B cell media, Xeno-freeR&D SystemsCCM031B-cell basal medium
Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom TubeCorning352059
Fetal Bovine Serum (FBS)R&D SystemsS11550For thawing B cells only
Ficoll-Paque PlusGE Healthcare17-1440-03
GeneMate SnapStrip® 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome CapsBioExpressT-3035-1 / 490003-692
Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBSGE lifesciencesSH30256.01
Lonza 4D Nucleofector core unitLonzaAAF-1002B
Lonza 4D Nucleofector X unitLonzaAAF-1002X
Mega CD40 LigandEnzo Life SciencesALX-522-110-C010
Mr. FrostySigma-AldrichC1562-1EAFor freezing cells
Pen/Strep 100XSigma-AldrichTMS-AB2-C
PerCP anti-human CD19 clone HIB19biolegend302228smaller size is also available
rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.)Vigene BiosciencesN/Alarge scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL
Recombinant human IL-10 protein 250 ugR&D Systems217-IL-250different sizes available
Recombinant human IL-15 protein 25 ugR&D Systems247-ILB-025different sizes available
The Big Easy EasySep MagnetSTEMCELL Technology18001different sizes available
Tris-EDTA (TE) bufferFisher ScientificBP2476100

Referencias

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