Ingegneria genomica delle cellule B umane primarie utilizzando CRISPR/Cas9

Riepilogo

Qui forniamo un protocollo dettagliato passo-passo per l'ingegneria del genoma basata su CRISPR / Cas9 delle cellule B umane primarie per knockout genico (KO) e knock-in (KI) per studiare le funzioni biologiche dei geni nelle cellule B e lo sviluppo di terapie a cellule B.

Abstract

Le cellule B sono linfociti derivati da cellule staminali ematopoietiche e sono una componente chiave del braccio umoristico del sistema immunitario adattivo. Fanno candidati attraenti per le terapie a base cellulare a causa della loro facilità di isolamento dal sangue periferico, della loro capacità di espandersi in vitro e della loro longevità in vivo. Inoltre, la loro normale funzione biologica - per produrre grandi quantità di anticorpi - può essere utilizzata per esprimere grandi quantità di una proteina terapeutica, come un anticorpo ricombinante per combattere l'infezione, o un enzima per il trattamento delle ezimopatie. Qui, forniamo metodi dettagliati per isolare le cellule B umane primarie dalle cellule mononucleari del sangue periferico (PBBC) e attivare / espandere cellule B isolate in vitro. Dimostriamo quindi i passaggi necessari per l'utilizzo del sistema CRISPR/Cas9 per ko site-specific di geni endogeni nelle cellule B. Questo metodo consente un KO efficiente di vari geni, che può essere utilizzato per studiare le funzioni biologiche dei geni di interesse. Vengono quindi dimostrati i passaggi per l'utilizzo del sistema CRISPR/Cas9 insieme a un vettore ricombinante, adeno-associato, virale (rAAV) per un'efficiente integrazione site-specific di una cassetta di espressione transgena nelle celle B. Insieme, questo protocollo fornisce una piattaforma ingegneristica passo-passo che può essere utilizzata nelle cellule B umane primarie per studiare le funzioni biologiche dei geni e per lo sviluppo di terapie a cellule B.

Introduzione

Le cellule B sono un sottogruppo del linfocita derivato dalle cellule staminali ematopoietiche. Svolgono un ruolo fondamentale nel sistema immunitario umoristico adattivo producendo grandi quantità di anticorpi in risposta alle sfide immunitarie¹. Le cellule B sono anche precursori delle cellule B della memoria e delle cellule plasmatiche di lunga durata differenziate e terminali, fornendo così un'immunità umorale duratura². Le cellule plasmatiche, in particolare, sono uniche tra le cellule immunitarie nella loro capacità di produrre grandi quantità di un anticorpo specifico mentre sopravvivono per anni o^{decenni 3}. Inoltre, la facilità di isolamento dal sangue periferico rende il lignaggio delle cellule B un ottimo candidato per nuove terapie a base cellulare⁴.

In precedenza, metodi di integrazione casuali, come quelli che utilizzano vettori lentivirali o un transposone della Bella Addormentata, sono stati utilizzati per progettare cellule B per la consegna transgena e^{l'espressione 5,6,7,8}. Tuttavia, la natura non specifica di questi approcci rende difficile studiare le funzioni biologiche di un gene specifico nelle cellule B e comporta un rischio intrinseco di mutagenesi inserimento ed espressione transgena variabile e/o silenziamento nell'ambiente terapeutico.

Il sistema CRISPR/Cas9 è un potente strumento di ingegneria genomica che consente ai ricercatori di modificare con precisione il genoma di varie cellule in numerose specie. Recentemente, due gruppi, tra cui il nostro, hanno sviluppato con successo metodi per l'espansione ex vivo e l'ingegneria genomica mirata delle cellule B^{umane primarie 9,10}. Descriveremo il processo di purificazione delle cellule B umane primarie da un campione di leucforesi. Successivamente, descriveremo il nostro protocollo aggiornato per l'espansione delle celle B e l'attivazione di celle B isolate. Descriveremo quindi un processo per eliminare il cluster di differenziazione 19 (CD19), uno specifico recettore delle cellule B e un segno distintivo delle cellule B, per elettroporazione per introdurre l'mRNA CRISPR /Cas9 insieme allo sgRNA CD19 nelle cellule B attivate.

Cas9 mRNA viene tradotto e si lega allo sgRNA CD19 per formare un complesso crispr/cas9-sgRNA ribonucleoproteina (RNP). Successivamente, lo sgRNA nel complesso porta Cas9 a creare una rottura a doppio filamento (DSB) alla sequenza bersaglio sull'esone 2 del gene. Le cellule ripareranno il DSB "unendo fine non omologha" introducendo o eliminando i nucleotidi, portando a mutazioni frameshift e causando l'eliminazione del gene. Misureremo quindi la perdita di CD19 per citometria del flusso e analizzeremo la formazione di indelenze tracciando le indeli mediante analisi di decomposizione (TIDE).

Descriveremo quindi il processo di utilizzo di CRISPR/Cas9 insieme a un vettore AAV6 ricombinante (rAAV6, un modello donatore per la riparazione diretta dall'omologia (HDR)) per mediare l'inserimento specifico del sito di proteine fluorescenti verdi avanzate(EGFP) nel gene 1 (AAVS1) adeno-associato al virus. Il gene AAVS1 è un locus attivo senza funzioni biologiche note e un sito di integrazione virale AAV sul genoma umano; pertanto, è considerato un "porto sicuro" per l'ingegneria del genoma. Qui, segnalamo che l'espansione e l'attivazione delle cellule B hanno permesso un'espansione fino a 44 volte in 7 giorni di coltura (Figura 1). L'elettroporazione delle cellule B ha mostrato una leggera riduzione della salute generale delle cellule(figura 2A)a 24 ore dopo la trasfezione. L'analisi del grafico a dispersione del marcatore CD19 (Figura 2B) ha mostrato una riduzione fino all'83% delle celle modificate (Figura 2C).

L'analisi TIDE dei cromatografi(figura 3A)ha rivelato che la % delle indeli era simile alla perdita di proteine % per citometria del flusso(figura 3B). L'analisi della citometria del flusso dell'esperimento KI ha mostrato che le cellule che hanno ricevuto vettore AAV (Figura 4), insieme all'RNP, hanno espresso fino al 64% di cellule positive all'EGFP (Figura 5A) e in seguito hanno mostrato un'integrazione riuscita mediante reazione a catena della polimerasi di giunzione (PCR)(Figura 5B). Il conteggio delle celle ha mostrato che tutti i campioni sono stati rapidamente recuperati entro 3 giorni dopo l'ingegneria (Figura 5C).

Protocollo

Campioni di leucferesi da donatori sani sono stati ottenuti da una banca del sangue locale. Tutti gli esperimenti qui descritti sono stati determinati come esenti per la ricerca dall'Institutional Review Board (IRB) e sono stati approvati dall'Institutional Biosafety Committee (IBC) dell'Università del Minnesota.

NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti nel rispetto della precauzione universale per gli agenti patogeni ematici, con tecniche sterili / asettiche e adeguate apparecchiature di livello-2 di biosicurezza.

1. Preparare integratori per il mezzo di espansione delle cellule B

1. Ricostituire l'oligonucleotide CpG ad una concentrazione di 1 mg/mL.
2. Ricostituire il ligando CD40 (CD40L) ad una concentrazione di 100 μg/mL.
3. Ricostituire l'IL-10 umano ricombinante (rhIL-10) ad una concentrazione di 50 μg/mL.
4. Ricostituire l'IL-15 umano ricombinante (rhIL-15) ad una concentrazione di 10 μg/mL.
   NOTA: Mantenere ogni integratore in piccole aliquote a -20 °C a -80 °C per un massimo di 6 mesi.

2. Preparare il mezzo basale

1. Combinare il mezzo basale a cellule B con il 5% (v/v) integratore multimediale per l'espansione delle cellule immunitarie in vitro (ad esempio, CTS Immune Cell SR) e l'1% (v/v) penicillina e streptomicina.
2. Sterilizzare il mezzo basale utilizzando un adattatore filtrante da 0,22 μm in una bottiglia sterilizzata.
3. Mantenere il mezzo basale a 4 °C per un massimo di 1 mese.

3. Preparare il mezzo di espansione delle celle B

1. Trasferire la quantità richiesta del mezzo basale in un contenitore sterile per coltura delle cellule B a 5 × 10⁵ cellule/mL.
2. Integrare il mezzo basale con 1 μg/mL CpG, 100 ng/mL CD40L, 50 ng/mL rhIL-10 e 10 ng/mL rhIL-15.
3. Filtrare il mezzo di espansione della cella B utilizzando un filtro da 0,22 μm.
4. Equilibrare il mezzo di espansione delle cellule B nell'incubatore di coltura tissutale a 37 °C, 5% CO₂ con umidità per almeno 30 minuti prima dell'uso.
   NOTA: Preparare un nuovo mezzo di espansione b-cell da utilizzare per un giorno. Non preparare il mezzo di espansione della cella B da utilizzare per più giorni. Questa ricetta multimediale incoraggia la proliferazione delle cellule B della memoria e delle cellule B umane primarie attivate.

4. Purificazione ed espansione delle cellule B umane

NOTA: Aggiungere il 99-100% di alcol isopropile a un contenitore di congelamento a temperatura controllata, seguendo le istruzioni del produttore, e raffreddare il contenitore di congelamento a 4 °C prima di iniziare il passaggio 4.1.

1. Isolare i PBBC da un campione di leucforesi
   1. Trasferire un campione di leucforesi (circa 8-10 ml) in un tubo conico sterile da 50 ml.
   2. Portare il volume a 35 mL con 1x soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS).
   3. Sovrapporre con cura un campione di leucforesi da 35 mL su 15 mL di mezzo gradiente di densità.
   4. Centrifugare a 500 × g per 25 minuti senza freno, rimuovere lo strato plasmatico senza disturbare il cappotto buffy (strato PBMC), raccogliere i PBMC dall'interfaccia e trasferirli in un nuovo tubo conico sterile da 50 ml.
   5. Portare i PBBC a 50 mL con 1 PBS.
   6. Centrifuga a 500 × g per 5 minuti senza freno. Rimuovere il supernatante senza disturbare il pellet PBMC, che può apparire rosso.
   7. Aggiungere 7 mL di tampone di lisi ammonio-cloruro-potassio, pipettare 3 volte per mescolare bene e incubare a temperatura ambiente (RT) per 3 minuti.
   8. Portare il volume a 50 mL con 1x PBS.
   9. Centrifuga a 400 × g per 5 min con freno a bassa resistenza. Rimuovere il supernatante senza disturbare il pellet. Il pellet dovrebbe apparire rosato o bianco.
      NOTA: Per continuare a colturare le cellule B appena isolate, preparare il mezzo di espansione della cella B prima di iniziare l'isolamento delle cellule B (passaggio 4.2).
2. Isolamento delle cellule B dai PBBC utilizzando il kit di isolamento negativo delle cellule B primarie umane
   1. Resuspend PBBC nel tampone di isolamento a una concentrazione di 5 × 10⁷ celle/mL.
      NOTA: se il numero totale di PBBC è inferiore a 5 × 10^{7 celle,} ridimensionare il volume del buffer di isolamento per mantenere 5 × 10⁷ celle/mL. I volumi minimi e massimi di sospensione cellulare sono rispettivamente di 0,25 mL e 8 mL.
   2. Trasferire fino a 8 mL (5 × 10⁷ celle/ml) in un tubo sterile, polipropilene, fondo rotondo con tappo.
   3. Aggiungere 50 μL/mL di Cocktail Enhancer ai PBPC.
   4. Aggiungere 50 μL/mL di Isolation Cocktail ai PBPC, limitare il tubo e invertire 2-3 volte per mescolare.
   5. Incubare a RT per 5 min; al^{4° minuto} di incubazione, microperline magnetiche a vortice per almeno 30 s.
   6. Trasferire 50 μL di microperline magnetiche per 1 ml di PBBC, limitare il tubo e invertire 2-3 volte per mescolare.
   7. Ricaricare fino a 10 mL con tampone di isolamento e pipettare delicatamente su e giù 2-3 volte.
   8. Posizionare il tubo in una stazione magnetica e incubare a RT per 3 minuti.
   9. Tenere insieme il magnete e il tubo e, in un unico movimento, invertire il magnete e il tubo insieme per versare la sospensione cellulare nel nuovo tubo. Scartare il vecchio tubo.
   10. Ripetere il passaggio 4.2.8 (ridurre il tempo di incubazione a 2 minuti) e versare la sospensione b-cell in un tubo conico pulito.
   11. Le cellule B arricchite sono pronte all'uso. Se le cellule verranno utilizzate immediatamente, continuare alla sezione 4.3 (Espansione delle cellule B umane). Controllare la purezza delle cellule B isolate per citometria a flusso (opzionale). Se le cellule devono essere congelate prima dell'uso, continuare al passaggio 4.2.12.
   12. Per congelare le cellule B, centrifugare a 400 × g per 5 minuti e scartare il supernatante senza disturbare il pellet.
   13. Rimospend le cellule in mezzo congelante a 10⁷ cellule/mL e aliquota 1 mL/crioviale.
   14. Posizionare il crioviale nel contenitore di congelamento refrigerato e conservare a -80 °C durante la notte; quindi, trasferire il criooviale congelato in un serbatoio di azoto liquido; mantenere le cellule congelate fino a 1 anno.
       NOTA: la resa prevista delle cellule B isolate è del 2%-8% dei PBBC totali, con una vitalità del 95%-99%.
3. Espansione delle cellule B umane
   NOTA: se si utilizzano celle B appena isolate, ignorare i passaggi da 4.3.1 a 4.3.5. Contare le cellule e trasferire il numero richiesto di cellule in un tubo conico sterile e continuare con il passaggio 4.3.6.
   1. Siero bovino fetale pre-caldo (FBS) in un bagno d'acqua prima di scongelare le cellule B. Preparare 20 ml di mezzo di espansione delle cellule B, trasferire in un pallone T25 e pre-equilibrare il mezzo in un incubatore di coltura tissutale (a 37 °C, 5% DI CO₂, con umidità) almeno 15 minuti prima dell'uso.
   2. Scongelare le cellule B in un bagno d'acqua a 37 °C. Durante l'attesa, trasferire 2 ml di FBS pre-riscaldato in un tubo conico sterile da 15 ml.
   3. Dopo che le cellule B sono state completamente scongelate, aggiungere immediatamente 1 mL di FBS pre-riscaldato, per quanto riguarda la goccia, nel campione. Incubare a RT per 1 min.
   4. Pipettare delicatamente per rimospendare il campione e trasferire l'intero volume, a goccia, in un tubo conico contenente 2 ml di FBS prerifatti.
   5. Portare il volume a 15 ml con PBS sterile 1x, cappuccio e invertire delicatamente il tubo 2-3 volte.
   6. Centrifuga a 400 × g per 5 min.
   7. Scartare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare, rimescolare il pellet cellulare con 1 mL di mezzo di espansione della cella B pre-equilibrato e contare le cellule. Il numero totale di cellule deve essere di circa 10⁷ celle.
   8. Trasferire le cellule in un pallone contenente 20 ml del mezzo di espansione delle cellule B pre-equilibrate. La concentrazione finale delle cellule dovrebbe essere di circa 5 x 10⁵ cellule/mL.
   9. Incubare il pallone verticalmente in un'incubatrice di coltura tissutale.
   10. Aggiornare completamente il mezzo di espansione ogni 2 giorni trasferendo l'intero volume di cellule B in un tubo conico sterile e ripetere i passaggi 4.3.6-4.3.9.
       NOTA: Il pallone T25 può contenere 10-20 ml di mezzo; Il pallone T75 può contenere fino a 20-60 ml di mezzo.

5. Ingegneria primaria delle cellule B umane

1. Progettare celle B a 48 ± 2 ore dopo l'espansione/attivazione per risultati ottimali. Preparare il mezzo di espansione delle cellule B, aliquota 1 mL del mezzo in una piastra di coltura tissutale a 48 pozze e pre-equilibrare in un incubatore di coltura tissutale almeno 15 minuti prima dell'uso.
   NOTA: Quando si progetta uno sgRNA CRISPR/Cas9 per un gene di interesse, seguire i passaggi descritti di seguito.
   - Progettare sgRNA utilizzando uno strumento online¹¹.
   - Progettare sgRNA su un esone comune a tutte le isoforme della proteina.
   - Ordina sgRNA modificato chimicamente da aziende rispettabili.
   - lo sgRNA di solito si presenta in forma lëfilizzata; ricostituire lo sgRNA in tampone Tris-EDTA (TE) sterile privo di DNasi/RNasi ad una concentrazione di 1 μg/μL.
2. Preparare il substrato transfetto CRISPR/Cas9 mescolando 1 μL (1 μg/μL) di sgRNA modificato chimicamente con 1,5 μL (1 μg/μL) di Streptococcus pyogenes Cas 9 (S.p. Cas9) di reazione di nucleasi per transfezione modificata chimicamente. Per il controllo, utilizzare 1 μL di TE buffer anziché sgRNA.
   NOTA: Quando lo sgRNA CD19 viene utilizzato per un esperimento gene KO, vedere la figura 2 per i risultati. Quando lo sgRNA AAVS1 viene utilizzato per un esperimento KI genico, vedere la figura 5 per i risultati.
   • Tieni tutti i componenti sul ghiaccio.
3. Mescolare delicatamente e trasferire 2,5 μL di substrato transfetto CRISPR/Cas9 per reazione in un tubo di un nastro a 8 tubi da 0,2 ml; accantonato a RT.
4. Accendere un nucleofector (elettroporatore) e preparare i reagenti di trasfezione, come mostrato nella tabella 1.
   NOTA: Questo è un buon passo per una pausa, se necessario, mettendo tutti i reagenti sul ghiaccio. Rimuovere tutti i reagenti dal ghiaccio quando sono pronti a riprendere l'esperimento. Quando si utilizza la proteina S.p. Cas9, lo sperimentatore DEVE pre-complesso CRISPR/Cas9-sgRNA ribonucleoproteina mescolando 1 μg di sgRNA con 5 μg di proteina S.p. Cas9, evitando eventuali bolle e incubando la miscela a RT per almeno 20 minuti prima dell'uso per risultati ottimali.
5. Contare e trasferire 10^{6 cellule} B per reazione di trasfezione in un tubo conico sterile.
6. Portare il volume a 15 mL con PBS sterile 1x e centrifugare a 400 × g per 5 min. Durante l'attesa, preparare il reagente di trasfezione della cella primaria (tabella 2) e accantonare a RT.
7. Scartare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare.
8. Rimossare il pellet cellulare con 10 mL di PBS sterile 1x e centrifuga a 400 × g per 5 min.
9. Scartare completamente il supernatante senza disturbare il pellet cellulare.
10. Trasferire 0,5 μg di mRNA GFP modificato chimicamente (come reporter di trasfezione) per 10⁶ cellule B al pellet cellulare (opzionale).
11. Resopend il pellet cellulare con reagente di trasfezione a cellule primarie da 20 μL per 10⁶ cellule B; mescolare delicatamente pipettando 5-6 volte. Trasferire 20,5 μL per reazione di trasfezione nel tubo da 0,2 ml della striscia a 8 tubi contenente 2,5 μL del substrato di trasfezione CRISPR/Cas9.
12. Pipetta su e giù una volta per mescolare e trasferire l'intero volume (23 μL) in una cuvetta di trasfezione. Cappuccio e toccare delicatamente la cuvetta sulla panca per assicurarsi che il liquido copra il fondo della cuvetta.
13. Utilizzare il protocollo b-cell primario umano sul nucleofector per la trasfezione.
    NOTA: Il nucleofector (elettroporatore) può essere posizionato ed essere utilizzato al di fuori della cappa di coltura tissutale. Limitare la cuvetta per garantire la sterilità.
14. Riposare le celle elettroporate nella cuvetta a RT per 15 minuti.
15. Trasferire 80 μL del mezzo di espansione pre-equilibrato della cellula B dalla piastra di coltura tissutale nella reazione di trasfezione nella cuvetta. Posizionare la cuvetta nell'incubatore di coltura tissutale per 30 minuti.
16. Pipettare delicatamente un paio di volte per mescolare e trasferire l'intero volume del campione dalla cuvetta ad un pozzo appropriato di una piastra di coltura tissutale a 48 pozzi contenente 1 mL del mezzo di espansione della cellula B. La concentrazione finale delle cellule dovrebbe essere di 10⁶ cellule/mL.
17. Se si esegue un esperimento KI genico, trasferire il vettore rAAV6 a 500.000 molteplicità di infezione nelle cellule elettroporate appropriate contenenti bene (circa 45 minuti dopo l'elettroporazione). Vedere esempio di costrutto vettoriale rAAV6 nella figura 4A.
    NOTA: Ad esempio: un campione di controllo verrà elettroporato senza CRISPR/Cas9 o il vettore rAAV6. Un campione solo vettoriale sarà elettroporato senza CRISPR/Cas9 e quindi trasdotto con il vettore rAAV6. Un campione KI verrà elettroporato con CRISPR/Cas9 e quindi trasdotto con il vettore rAAV6. rAAV6 deve contenere bracci di omologia verso l'alto e a valle del sito DSB mirato per HDR.
18. Posizionare la piastra in un incubatore di coltura tissutale a 37 °C e al 5% di CO₂ con umidità.
19. Conta le celle e registra la vitalità al primo giorno dopo l'ingegneria.
20. Aggiornare il mezzo di espansione della cella B ogni 2 giorni contando le celle e quindi trasferendo l'intero volume delle celle in un tubo di microcentrifugo pulito da 1,5 ml. Centrifugare a 400 × g per 5 minuti e scartare il supernatante senza disturbare il pellet. Rimostrare le cellule con 100 μL di mezzo di espansione fresco delle cellule B e trasferirli in un pozzo di una piastra di coltura tissutale di 24 po '. Portare il volume medio per ottenere una concentrazione cellulare finale a 5 × 10⁵ cellule/mL.
    NOTA: Una piastra da 48 porsi può contenere fino a 1 mL medio/bene; una piastra da 24 po' può contenere fino a 2 mL medio/bene; una piastra da 12 po' può contenere fino a 4 mL medio/bene e una piastra da 6 po po' può contenere fino a 8 mL medio/bene.
21. Consentire alle celle ingegnerizzate di espandersi per almeno 5 giorni prima di eseguire analisi a valle, ad esempio per l'analisi della citometria del flusso, l'analisi TIDE e la PCR di giunzione.

Risultati

Il protocollo aggiornato di espansione e attivazione ha permesso la rapida espansione delle cellule B fino a 44 volte in 7 giorni(figura 1;n =3 donatori). Nell'esperimento KO, il conteggio delle cellule B utilizzando la colorazione blu di Trypan ha mostrato più dell'80% di cellule vitali con una leggera riduzione del recupero cellulare sia nel controllo che nei campioni CD19 KO a 24 ore dopo l'elettroporazione(figura 2A; p ≥ 0,05, n = 3 donatori). Questo risu...

Discussione

L'ingegneria del genoma precisa nelle cellule B umane primarie è stata impegnativa fino a^{poco tempo fa 9,10}. In precedenza avevamo pubblicato protocolli che utilizzavano CRISPR/Cas9 per progettare cellule B umane primarie⁹. Qui, delineamo protocolli migliorati per l'isolamento, l'espansione e l'ingegneria delle celle B per consentire un KO efficiente del CD19 o per l'eGFPknocking-in .

Qui dimostriamo c...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug	IDT	1081059	smaller size is also available
Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT)	Lonza	V4XP-3032
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer	Quality Biological	118-156-101
CleanCap chemically modified Cas9 mRNA	Trilink Biotechnology	L-7206-1000
CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg	Invivogen	TLRL-2006-5	different sizes available
Cryostor CS10, 100 mL	STEMCELL Technology	7930
CTS Immune Cell SR	Thermo Fisher Scientific	A2596101
EasySep human B cells isolation kit	STEMCELL Technology	17954
eBioscience fixable viability dye eFlour 780	eBiosciences	65-0865-14
Excellerate B cell media, Xeno-free	R&D Systems	CCM031	B-cell basal medium
Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube	Corning	352059
Fetal Bovine Serum (FBS)	R&D Systems	S11550	For thawing B cells only
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03
GeneMate SnapStrip® 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps	BioExpress	T-3035-1 / 490003-692
Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS	GE lifesciences	SH30256.01
Lonza 4D Nucleofector core unit	Lonza	AAF-1002B
Lonza 4D Nucleofector X unit	Lonza	AAF-1002X
Mega CD40 Ligand	Enzo Life Sciences	ALX-522-110-C010
Mr. Frosty	Sigma-Aldrich	C1562-1EA	For freezing cells
Pen/Strep 100X	Sigma-Aldrich	TMS-AB2-C
PerCP anti-human CD19 clone HIB19	biolegend	302228	smaller size is also available
rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.)	Vigene Biosciences	N/A	large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL
Recombinant human IL-10 protein 250 ug	R&D Systems	217-IL-250	different sizes available
Recombinant human IL-15 protein 25 ug	R&D Systems	247-ILB-025	different sizes available
The Big Easy EasySep Magnet	STEMCELL Technology	18001	different sizes available
Tris-EDTA (TE) buffer	Fisher Scientific	BP2476100