使用CRISPR/Cas9的人类B细胞基因组工程

摘要

在这里，我们为CRISPR/Cas9基础基因组工程提供详细的分步协议，用于基因敲除（KO）和敲击（KI），以研究B细胞中基因的生物功能和B细胞治疗的开发。

摘要

B细胞是从造血干细胞中提取的淋巴细胞，是适应性免疫系统幽默手臂的关键组成部分。他们之所以成为细胞疗法的候选者，是因为它们容易与周围血液隔离，体外扩张能力，以及体内寿命。此外，它们的正常生物功能——产生大量的抗体——可以用来表达大量的治疗性蛋白质，如抗感染的重组抗体，或用于治疗酶病变的酶。在这里，我们提供详细的方法，将原人类B细胞从外周血单核细胞（PBMCs）中分离，并在体外激活/扩大分离的B细胞。然后，我们演示了使用CRISPR/Cas9系统在B细胞中针对内源基因的部位特定KO所涉及的步骤。这种方法可以有效地利用各种基因的KO，用于研究感兴趣的基因的生物功能。然后，我们演示了使用CRISPR/Cas9系统以及重组的、与腺相关的病毒（rAAV）载体的步骤，以有效实现B细胞中转基因表达盒的现场特定集成。该协议共同提供了一个分步工程平台，可用于人类B细胞的初级研究基因的生物功能以及B细胞治疗的开发。

引言

B细胞是来自造血干细胞的淋巴细胞系的子群。他们在适应性幽默免疫系统中发挥关键作用，产生大量的抗体来应对免疫挑战^1。B细胞也是记忆B细胞和最终分化的长寿血浆细胞的前体，从而提供持久的幽默免疫力^2。特别是等离子体细胞，在免疫细胞中独一无二，它们能够产生大量的特定抗体，同时存活多年或几^十年。此外，从外周血液隔离的便利性使B细胞血统成为新细胞疗法⁴的极好候选者。

以前，随机整合方法，如那些使用扁桃体载体或睡美人转子，已经被用来工程B细胞的转基因传递和表达5，6，7，8。然而，这些方法的非特异性使得研究B细胞中特定基因的生物功能变得困难，并具有在治疗环境中插入突变和可变转基因表达和/或沉默的固有风险。

CRISPR/Cas9系统是一个强大的基因组工程工具，使研究人员能够精确编辑许多物种中各种细胞的基因组。最近，包括我们自己的两组已经成功地开发出了原始人类B细胞^9、10的外活扩张和靶向基因组工程方法。我们将描述从白血病样本中净化原人类B细胞的过程。之后，我们将描述我们更新的 B 细胞扩展和激活孤立 B 细胞的协议。然后，我们将描述一个通过电波将CRISPR/Cas9 mRNA与CD19 sgRNA一起引入激活的B细胞，从而敲除分化19（CD19）的簇、特定的B细胞受体和B细胞的标志的过程。

Cas9 mRNA 被翻译并绑定到 CD19 sgRNA，以形成 CRISPR/Cas9-sgRNA 核糖核蛋白复合物 （RNP）。随后，复合物中的sgRNA导致Cas9在基因exon2上的目标序列中产生双链断裂（DSB）。细胞将通过引入或删除核苷酸来修复DSB，导致帧移位突变并导致基因被消灭。然后，我们将用流细胞测量测量CD19的损失，并通过分解（TIDE）分析对英德尔的形成进行跟踪分析。

然后，我们将描述使用CRISPR/Cas9与重组AAV6载体（rAAV6，同源定向修复（HDR）的捐赠模板）一起，以调解在腺相关病毒集成站点1（AAVS1）基因中插入增强型绿色荧光蛋白（EGFP） 的现场特定插入过程。AAVS1基因是一种没有已知生物功能的活性球体，也是人类基因组上的AAV病毒整合站点:因此，它被认为是基因组工程的"安全港"。在这里，我们报告说，B细胞的膨胀和激活允许在7天的培养中扩大44倍（图1）。B细胞的电扩散显示，在24小时后，整体细胞健康（图2A）略有下降。对 CD19 标记（图 2B）的分散图分析显示编辑的单元块（图 2C）减少高达83%。

TIDE对色谱仪（图3A）的分析显示，英德尔的百分比与流动细胞仪（图3B）所导致的蛋白质损失相似。KI实验的流动细胞学分析表明，接受AAV载体（图4）的细胞与RNP一起表示高达64%的EGFP阳性细胞（图5A），随后通过结点聚合酶链反应（PCR）（图5B）显示成功整合。细胞计数显示，所有样本在工程后3天内迅速恢复（图5C）。

研究方案

从健康献血者那里获得的白血病样本是从当地血库获得的。此处描述的所有实验均被确定为豁免供机构审查委员会 （IRB） 研究，并经明尼苏达大学机构生物安全委员会 （IBC） 批准。

注:所有实验都是按照血液传播病原体的普遍预防措施进行的，采用无菌/无菌技术和适当的生物安全2级设备。

1. 为B细胞扩张介质准备补充剂

1. 将 CpG 寡核苷酸重组为浓度为 1 毫克/mL。
2. 将 CD40 配体 （CD40L） 重组为浓度为 100μg/mL。
3. 重组重组人类IL-10（rhIL-10），浓度为50微克/mL。
4. 重组重组人类IL-15（rhIL-15），浓度为10微克/mL。
   注意:将每种补充剂保持在-20°C至-80°C的小参考中长达6个月。

2. 准备基础介质

1. 结合B细胞基底介质与5%（v/v）介质补充体外免疫细胞扩张（如CTS免疫细胞SR）和1%（v/v）青霉素和链霉素。
2. 使用 0.22μm 滤芯适配器将基底介质过滤消毒到消毒瓶中。
3. 将基底介质保持在 4 °C，最长达 1 个月。

3. 准备B细胞扩展介质

1. 将基底介质所需的量转移到无菌容器中，以 5 × 10⁵ 细胞/mL 培养 B 细胞。
2. 以 1 μg/mL CpG、100 ng/mL CD40L、50 ng/mL rhIL-10 和 10 ng/mL rhIL-15 补充基础介质。
3. 使用 0.22 μm 过滤器过滤 B 细胞扩展介质。
4. 在 37 °C、5% CO_2、 湿度至少 30 分钟之前，在组织培养孵化器中平衡 B 细胞膨胀介质。
   注意:准备新鲜的B细胞扩展介质，使用一天。 不要 准备 B 细胞扩展介质使用多天。这种介质配方鼓励记忆B细胞的增殖，并激活原发性人类B细胞。

4. 人类B细胞净化和扩张

注:按照制造商的指示，在温度控制的冷冻容器中加入 99–100% 异丙醇，并在开始第 4.1 步之前将冷冻容器冷却在 4 °C。

1. 从白血病样本中分离 PBMC
   1. 将白血病样本（约 8–10 mL）转移到无菌的 50 mL 锥形管中。
   2. 将体积调高至 35 mL，无菌 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。
   3. 在 15 mL 密度梯度介质上仔细分层 35 mL leuka 磷化样本。
   4. 离心机在500× 克 25分钟没有刹车，去除等离子层，而不会干扰抛光外套（PBMC层），从接口收集PCBCs，并转移到一个新的无菌50mL圆锥管。
   5. 将 PBMC 与 1 倍 PBS 一起提起 50 mL。
   6. 离心机在500× 克 5分钟没有刹车。在不干扰 PBMC 颗粒的情况下取出超自然，PBMC 颗粒可能呈红色。
   7. 加入7mL的铵-氯化钾-溶解缓冲器，移液器3次混合良好，并在室温下（RT）孵育3分钟。
   8. 将音量调高至 50 mL，并配备 1 倍 PBS。
   9. 离心机在400× 克 5分钟低阻力制动器。在不干扰颗粒的情况下取出超自然。弹丸应该看起来粉红色或白色。
      注意:要继续培养刚分离的 B 细胞，请在开始 B 细胞分离之前准备 B 细胞扩展介质（步骤 4.2）。
2. 使用人类初级 B 细胞负隔离套件从 PBMC 中分离 B 细胞
   1. 在隔离缓冲区中将 PBMC 恢复为浓度为 5 × 10⁷ 个单元/mL。
      注意:如果 PBMC 总数小于 5 × 10⁷ 个单元，请缩小隔离缓冲器的体积，以保持 5 × 10⁷ 个单元格/mL。细胞悬架的最小和最大体积分别为 0.25 mL 和 8 mL。
   2. 将高达 8 mL（5 × 10⁷ 个电池/mL）转移到带盖子的无菌聚丙烯圆底管中。
   3. 在 PBMC 中添加 50μL/mL 的鸡尾酒增强剂。
   4. 在 PBMC 中加入 50μL/mL 的隔离鸡尾酒，盖上管子，然后倒置 2~3 次混合。
   5. 在 RT 孵化 5 分钟;在孵化^的第4 分钟，涡流磁性微珠至少30秒。
   6. 每 1 mL PBMC 传输 50μL 的磁性微珠，封盖管子，并倒置 2–3 次混合。
   7. 使用隔离缓冲区充值至 10 mL，并轻轻上下 2–3 次移液器。
   8. 将管子放在磁站中，在 RT 孵化 3 分钟。
   9. 将磁铁和管子保持在一起，在一个动作中，将磁铁和管子倒在一起，将细胞悬架倒入新管中。丢弃旧管子。
   10. 重复步骤 4.2.8（将孵化时间缩短到 2 分钟），并将 B 细胞悬架倒入干净的圆锥形管中。
   11. 富集的 B 细胞已准备好使用。如果立即使用细胞，请继续使用第 4.3 节（人类 B 细胞扩展）。通过流动细胞学（可选）检查分离 B 细胞的纯度。如果细胞在使用前要冻结，请继续踩踏 4.2.12。
   12. 要冻结B细胞，离心机在400× 克 5分钟，并丢弃超自然分子，而不会干扰颗粒。
   13. 将细胞在冷冻介质中以10⁷ 个细胞/mL进行恢复，并引用1mL/低温。
   14. 将冷冻容器放在冰冷的冷冻容器中，并在 -80 °C 过夜;然后，将冷冻低温转移到液氮罐中:保持冷冻细胞长达1年。
       注:分离B细胞的预期产量占全氟辛起伏碳化合物总量的2%-8%，生存能力为95%-99%。
3. 人类B细胞扩张
   注意:如果使用刚分离的 B 细胞，请跳过步骤 4.3.1– 4.3.5。数数细胞并将所需细胞数转移到无菌圆锥管中，并继续执行步骤 4.3.6。
   1. 在解冻B细胞之前，在水浴中预热胎儿牛血清（FBS）。准备20mL的B细胞膨胀介质，转移到T25烧瓶，并在组织培养孵化器中预平衡介质（在37°C，5%CO_2，湿度），至少15分钟使用前。
   2. 在37°C的水浴中解冻B细胞。在等待时，将 2 毫升预热 FBS 转移到无菌的 15 mL 圆锥管中。
   3. B细胞完全解冻后，立即在样品中加入1毫升预热的FBS。在 RT 孵化 1 分钟。
   4. 轻轻移液器，以补充样品，并转移整个体积，下降，到一个圆锥管含有2毫升预热的FBS。
   5. 将体积调高至 15 mL，带无菌 1 倍 PBS、盖，并轻轻地将管子倒置 2–3 倍。
   6. 离心机在 400 × g 5 分钟。
   7. 在不干扰细胞颗粒的情况下丢弃超细剂，用1mL的预平衡B细胞膨胀介质补充细胞颗粒，并计算细胞数。总细胞数应约为10⁷ 个单元格。
   8. 将细胞转移到含有 20 mL 预平衡 B 细胞膨胀介质的烧瓶中。细胞的最终浓度应约为5×10⁵ 细胞/mL。
   9. 将烧瓶垂直孵化在组织培养孵化器中。
   10. 通过将 B 细胞的整个体积转移到无菌圆锥管中，并重复步骤 4.3.6–4.3.9，每 2 天完全刷新一次扩展介质。
       注:T25烧瓶可容纳10-20 mL的介质:T75 烧瓶可容纳高达 20–60 mL 的介质。

5. 初级人类B细胞工程

1. 工程师 B 细胞在扩展/激活后以 48 ± 2 h 的速度工作，以获得最佳效果。准备B细胞膨胀介质，将介质的1mL放入48井组织培养板中，并在使用前至少15分钟在组织培养孵化器中预平衡。
   注意:在为感兴趣的基因设计CRISPR/Cas9 sgRNA时，请按照下面概述的步骤操作。
   - 使用在线工具¹¹设计 sgRNA 。
   - 在蛋白质的所有同位素中常见的外体上设计sgRNA。
   - 从信誉良好的公司订购化学改装的 sgRNA。
   -sgRNA通常以嗜血的形式出现:在无菌 DNase/无鼻塞三叶草 EDTA （TE） 缓冲区中重组 sgRNA，浓度为 1 μg/μL。
2. 通过将化学改性 sgRNA 的 1 μL （1μg/μL） 与化学改性链 球菌 Cas 9 （S.p. Cas9） 核糖核酸混合，准备 CRISPR/Cas9 变种基板。要进行控制，请使用 1 μL 的 TE 缓冲区，而不是 sgRNA。
   注:当 CD19 sgRNA 用于基因 KO 实验时，请参阅 图 2 了解结果。当 AAVS1 sgRNA 用于基因 KI 实验时，请参阅 图 5 了解结果。
   • 将所有组件保留在冰上。
3. 轻轻混合，将每个反应的 2.5μL CRISPR/Cas9 变速基板传输到 0.2 mL 8 管条的管中;放在RT。
4. 打开核燃机（电极器），并准备 如表1所示的转染试剂。
   注意:如果必要的话，把所有试剂都放在冰上，这是暂停的好步骤。准备恢复实验时，从冰中取出所有试剂。当使用 S.p. Cas9 蛋白质时，研究者 必须 通过将 1μg sgRNA 与 5 μg S.p. Cas9 蛋白质混合，避免任何气泡，并在 RT 中孵育混合物至少 20 分钟，然后再使用以获得最佳效果。
5. 计数并转移10^个6 B细胞，每个转染反应到无菌圆锥管。
6. 将体积调高至 15 mL，无菌 1 倍 PBS，离心机在 400 × g 下 5 分钟。在等待时，准备主细胞转染试剂（表2），并放在RT。
7. 丢弃超自然的，而不会干扰细胞颗粒。
8. 用 10 mL 的无菌 1 倍 PBS 和离心机在 400 × g 下重新注入细胞颗粒 5 分钟。
9. 完全丢弃超纳特，而不会干扰细胞颗粒。
10. 每10⁶ B细胞将0.5微克化学改性GFP mRNA（作为传染报告器）转移到细胞颗粒（可选）。
11. 每10个^6B 细胞用20μL原细胞传染试剂补充细胞颗粒;通过管道轻轻混合5-6次。将 20.5 μL 的每次转染反应转移到包含 CRISPR/Cas9 转染基板 2.5 μL 的 8 管条的 0.2 mL 管中。
12. 向上和向下一 次 将整个音量 （23 μL） 混合并传输到传输库维特。轻轻盖住并轻敲长凳上的绒布，以确保液体覆盖库维特的底部。
13. 在核细胞核上使用人类原生B细胞协议进行转染。
    注:核效应器（电容器）可放置在组织培养罩外使用。盖上小面包，确保不育。
14. 将电波化细胞在 RT 的库维特中休息 15 分钟。
15. 将预平衡 B 细胞膨胀介质的 80 μL 从组织培养板转移到库维特的转染反应中。将小面包放在组织培养孵化器中30分钟。
16. 轻轻移液几次，将样品的整个体积从库维特混合并转移到含有 1 mL B 细胞膨胀介质的 48 井组织培养板的适当井中。细胞的最终浓度应该是10⁶ 个细胞/mL。
17. 如果进行基因 KI 实验， 将 rAAV6 向量为 500，000 多种感染的载体转移到含有电波酸细胞的适当井中（大约 45 分钟后电波）。请参阅 图 4A中的示例 rAAV6 矢量构造。
    注:例如:在没有CRISPR/Cas9或rAAV6矢量的情况下，对照样品将被电波解。仅矢量样品将电波化，无需 CRISPR/Cas9，然后与 rAAV6 矢量一起转导。KI 样品将用 CRISPR/Cas9 进行电波化，然后用 rAAV6 矢量进行转导。rAAV6 必须包含 HDR 目标 DSB 站点的上下同源臂。
18. 将盘子放在湿度为 37 °C 和 5% CO₂ 的组织培养孵化器中。
19. 计算细胞并记录工程后第 1 天的可行性。
20. 通过计算细胞，然后将整个细胞体积转移到一个干净的 1.5 mL 微中微富格管中，每 2 天刷新一次 B 细胞扩展介质。离心机在 400 × g 5 分钟， 并丢弃超母体， 而不会干扰颗粒。用100μL的新鲜B细胞膨胀介质补充细胞，并转移到24井组织培养板的井中。提起中等体积，在 5 × 10⁵ 细胞/mL 时实现最终细胞浓度。
    注:48井板可容纳1mL中/井:一个24井板可以容纳高达2 mL中/井:12井板可容纳4mL中/井，6井板可容纳8mL中/井。
21. 允许工程细胞在进行下游分析（如流细胞学分析、TIDE 分析和交界 PCR）之前至少膨胀 5 天。

结果

更新的扩展和激活协议使B细胞在7天内迅速膨胀到44倍（图1;n=3捐赠者）。在KO实验中，使用Trypan蓝色染色进行的B细胞计数显示，在24小时后的控制和CD19 KO样本中，超过80%的可行细胞的细胞恢复略有减少（图2A:p≥0.05，n = 3捐赠者）。这一结果表明，电波轻微影响整体B细胞健康。B细胞在输血后的第5天收集，用于流动细胞学和潮汐分析。控制和KO样本的代?...

讨论

直到最近^9月10日，人类B细胞的精确基因组工程一直具有挑战性。我们以前曾发布过使用CRISPR/Cas9来设计原始人类B细胞⁹的协议。在这里，我们概述了改进的B细胞隔离，扩展和工程协议，以允许高效的KO CD19或敲击EGFP。

在这里，我们证明，我们的扩展协议允许在培养中快速扩展B细胞，在7天内扩展高达44倍（

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug	IDT	1081059	smaller size is also available
Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT)	Lonza	V4XP-3032
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer	Quality Biological	118-156-101
CleanCap chemically modified Cas9 mRNA	Trilink Biotechnology	L-7206-1000
CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg	Invivogen	TLRL-2006-5	different sizes available
Cryostor CS10, 100 mL	STEMCELL Technology	7930
CTS Immune Cell SR	Thermo Fisher Scientific	A2596101
EasySep human B cells isolation kit	STEMCELL Technology	17954
eBioscience fixable viability dye eFlour 780	eBiosciences	65-0865-14
Excellerate B cell media, Xeno-free	R&D Systems	CCM031	B-cell basal medium
Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube	Corning	352059
Fetal Bovine Serum (FBS)	R&D Systems	S11550	For thawing B cells only
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03
GeneMate SnapStrip® 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps	BioExpress	T-3035-1 / 490003-692
Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS	GE lifesciences	SH30256.01
Lonza 4D Nucleofector core unit	Lonza	AAF-1002B
Lonza 4D Nucleofector X unit	Lonza	AAF-1002X
Mega CD40 Ligand	Enzo Life Sciences	ALX-522-110-C010
Mr. Frosty	Sigma-Aldrich	C1562-1EA	For freezing cells
Pen/Strep 100X	Sigma-Aldrich	TMS-AB2-C
PerCP anti-human CD19 clone HIB19	biolegend	302228	smaller size is also available
rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.)	Vigene Biosciences	N/A	large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL
Recombinant human IL-10 protein 250 ug	R&D Systems	217-IL-250	different sizes available
Recombinant human IL-15 protein 25 ug	R&D Systems	247-ILB-025	different sizes available
The Big Easy EasySep Magnet	STEMCELL Technology	18001	different sizes available
Tris-EDTA (TE) buffer	Fisher Scientific	BP2476100