Engenharia de Genoma de Células B Humanas Primárias Usando CRISPR/Cas9

Resumo

Aqui fornecemos um protocolo detalhado passo a passo para a engenharia do genoma baseada em CRISPR/Cas9 das células B humanas primárias para nocaute genético (KO) e knock-in (KI) para estudar funções biológicas de genes em células B e o desenvolvimento de terapêuticas de células B.

Resumo

As células B são linfócitos derivados de células-tronco hematopoiéticas e são um componente-chave do braço humorístico do sistema imunológico adaptativo. Eles fazem candidatos atraentes para terapias baseadas em células devido à sua facilidade de isolamento do sangue periférico, sua capacidade de expandir in vitro e sua longevidade in vivo. Além disso, sua função biológica normal — para produzir grandes quantidades de anticorpos — pode ser utilizada para expressar quantidades muito grandes de uma proteína terapêutica, como um anticorpo recombinante para combater a infecção, ou uma enzima para o tratamento de enzimas. Aqui, fornecemos métodos detalhados para isolar células B humanas primárias de células mononucleares periféricas do sangue (PBMCs) e ativar/expandir células B isoladas in vitro. Em seguida, demonstramos as etapas envolvidas no uso do sistema CRISPR/Cas9 para ko específico do local de genes endógenos em células B. Este método permite um KO eficiente de vários genes, que podem ser usados para estudar as funções biológicas dos genes de interesse. Em seguida, demonstramos os passos para o uso do sistema CRISPR/Cas9 juntamente com um vetor recombinante, associado a adeno, viral (rAAV) para uma integração eficiente específica do local de um de expressão transgênica em células B. Em conjunto, este protocolo fornece uma plataforma de engenharia passo a passo que pode ser usada em células B humanas primárias para estudar funções biológicas de genes, bem como para o desenvolvimento de terapêuticas de células B.

Introdução

As células B são um subgrupo da linhagem linfócito derivada de células-tronco hematopoiéticas. Eles desempenham um papel crítico no sistema imunológico humorálógico adaptativo, produzindo grandes quantidades de anticorpos em resposta aos desafios imunológicos¹. As células B também são precursoras das células B da memória e das células plasmáticas de longa duração, com uma imunidade humoral duradoura². As células plasmáticas, em particular, são únicas entre as células imunes em sua capacidade de produzir grandes quantidades de um anticorpo específico enquanto sobrevivem por anos ou décadas³. Além disso, a facilidade de isolamento do sangue periférico faz da linhagem de células B um excelente candidato para novas terapias baseadas em células⁴.

Anteriormente, métodos de integração aleatória, como aqueles que utilizam vetores lentivirais ou um transposon da Bela Adormecida, têm sido utilizados para projetar células B para entrega e expressão transgênicas^5,6,7,8. No entanto, a natureza não específica dessas abordagens dificulta o estudo das funções biológicas de um gene específico nas células B e traz um risco inerente de mutagênese insercional e expressão transgênica variável e/ou silenciamento no cenário terapêutico.

O sistema CRISPR/Cas9 é uma poderosa ferramenta de engenharia de genomas que permite aos pesquisadores editar precisamente o genoma de várias células em inúmeras espécies. Recentemente, dois grupos, incluindo o nosso, desenvolveram com sucesso métodos de expansão ex vivo e engenharia de genomas direcionados das células B humanas primárias^9,10. Descreveremos o processo de purificação das células B humanas primárias de uma amostra de leucemia. Depois disso, descreveremos nosso protocolo atualizado para expansão de células B e ativação de células B isoladas. Descreveremos então um processo para eliminar o cluster de diferenciação 19 (CD19), um receptor específico de células B e uma marca registrada das células B, por eletroporação para introduzir o CRISPR/Cas9 mRNA juntamente com o CD19 sgRNA em células B ativadas.

Cas9 mRNA é traduzido e se liga ao sgRNA CD19 para formar um complexo de ribonucleoproteína CRISPR/Cas9-sgRNA (RNP). Posteriormente, o sgRNA no complexo leva Cas9 a criar quebra de dois fios (DSB) na sequência de destino no exon 2 do gene. As células repararão o DSB por "junção final não homólogoa" introduzindo ou excluindo nucleotídeos, levando à mutação de mudança de quadro e fazendo com que o gene seja eliminado. Em seguida, mediremos a perda de CD19 por citometria de fluxo e analisaremos a formação indeléxica através do rastreamento de indelés por análise de decomposição (MARÉ).

Descreveremos então o processo de utilização do CRISPR/Cas9 juntamente com um vetor AAV6 recombinante (rAAV6, um modelo de doador para reparo direcionado à homologia (HDR)) para mediar a inserção específica do local da proteína fluorescente verde aprimorada(EGFP) no gene de integração do local de integração do vírus associado a Adeno 1 (AAVS1). O gene AAVS1 é um lócus ativo sem funções biológicas conhecidas e um local de integração viral AAV no genoma humano; portanto, é considerado um "porto seguro" para a engenharia do genoma. Aqui, relatamos que a expansão e ativação de células B permitiu uma expansão de até 44 vezes em 7 dias de cultura(Figura 1). A eletroporação das células B apresentou ligeira redução da saúde celular global (Figura 2A) em 24 h após a transfecção. A análise da parcela de dispersão do marcador CD19 (Figura 2B) mostrou uma redução de até 83% nas células editadas(Figura 2C).

A análise da MARÉ dos cromatógrafos (Figura 3A) revelou que o % indels foi semelhante à % perda de proteína por citometria de fluxo(Figura 3B). A análise da citometria de fluxo do experimento KI mostrou que as células que receberam vetor AAV (Figura 4),juntamente com RNP, expressaram até 64% células positivas de EGFP(Figura 5A)e posteriormente apresentaram integração bem sucedida por reação de cadeia de polimerase de junção (PCR) (Figura 5B). A contagem de células mostrou que todas as amostras se recuperaram rapidamente em 3 dias após a engenharia (Figura 5C).

Protocolo

Amostras de leucemia de doadores saudáveis foram obtidas de um banco de sangue local. Todos os experimentos descritos aqui foram determinados a serem isentos para pesquisa pelo Institutional Review Board (IRB) e foram aprovados pelo Comitê de Biossegurança Institucional (IBC) da Universidade de Minnesota.

NOTA: Todos os experimentos foram realizados em conformidade com a precaução universal para patógenos transmitidos pelo sangue, com técnicas estéreis/assépticas e equipamentos de biossegurança adequados nível 2.

1. Prepare os suplementos para o meio de expansão de células B

1. Reconstituir oligonucleotídeo cpg a uma concentração de 1 mg/mL.
2. Reconstituir o ligante CD40 (CD40L) a uma concentração de 100 μg/mL.
3. Reconstituir il-10 humanos recombinantes (rhIL-10) a uma concentração de 50 μg/mL.
4. Reconstituir il-15 humanos recombinantes (rhIL-15) a uma concentração de 10 μg/mL.
   NOTA: Mantenha cada suplemento em alíquotas pequenas a -20 °C a -80 °C por até 6 meses.

2. Prepare o meio basal

1. Combine meio basal de células B com suplemento de mídia de 5% (v/v) para expansão in vitro de células imunes (por exemplo, TCS Immune Cell SR) e penicilina de 1% (v/v) e estreptomicina.
2. Esterilize o meio basal usando um adaptador de filtro de 0,22 μm em uma garrafa esterilizada.
3. Mantenha o meio basal a 4 °C por até 1 mês.

3. Prepare o meio de expansão de células B

1. Transfira a quantidade necessária do meio basal em um recipiente estéril para cultivar as células B em 5 × 10⁵ células/mL.
2. Suplemente o meio basal com 1 μg/mL CpG, 100 ng/mL CD40L, 50 ng/mL rhIL-10 e 10 ng/mL rhIL-15.
3. Filtre o meio de expansão da célula B usando um filtro de 0,22 μm.
4. Equilibre o meio de expansão de células B na incubadora de cultura tecidual a 37 °C, 5% de CO₂ com umidade por pelo menos 30 minutos antes do uso.
   NOTA: Prepare o meio de expansão de células B fresco para usar por um dia. Não prepare o meio de expansão de células B para usar por vários dias. Esta receita de mídia incentiva a proliferação de células B de memória e células B humanas ativadas.

4. Purificação e expansão de células B humanas

NOTA: Adicione 99-100% de álcool isopropílico a um recipiente de congelamento controlado pela temperatura, seguindo as instruções do fabricante, e esfrie o recipiente de congelamento a 4 °C antes de iniciar o passo 4.1.

1. Isole pbmcs de uma amostra de leucemia
   1. Transfira uma amostra de leucemia (aproximadamente 8-10 mL) para um tubo cônico estéril de 50 mL.
   2. Eleça o volume para 35 mL com soro fisiológico estéril tamponado de fosfato (PBS).
   3. Coloque cuidadosamente uma amostra de leucemia de 35 mL em 15 mL de média gradiente de densidade.
   4. Centrifugar a 500 × g por 25 minutos sem freio, remover a camada de plasma sem perturbar a camada de buffy (camada PBMC), coletar os PBMCs da interface e transferir para um novo tubo cônico estéril de 50 mL.
   5. Leve os PBMCs a 50 mL com 1x PBS.
   6. Centrífuga a 500 × g por 5 min sem freio. Remova o supernatante sem perturbar a pelota PBMC, que pode parecer vermelha.
   7. Adicione 7 mL de tampão de lise de amônio-cloreto-potássio, pipeta 3 vezes para misturar bem e incubar à temperatura ambiente (RT) por 3 minutos.
   8. Eleça o volume para 50 mL com 1x PBS.
   9. Centrífuga a 400 × g por 5 min com freio de baixa resistência. Remova o supernatante sem perturbar a pelota. A pelota deve parecer rosada ou branca.
      NOTA: Para continuar a cultivar as células B recém-isoladas, prepare o meio de expansão de células B antes de iniciar o isolamento das células B (etapa 4.2).
2. Isolamento de células B de PBMCs usando kit de isolamento negativo de células B primários humanos
   1. Resuspend PBMCs no tampão de isolamento para uma concentração de 5 × 10⁷ células/mL.
      NOTA: Se o número total de PBMCs for inferior a 5 × 10⁷ células, reduza o volume de tampão de isolamento para manter 5 × 10⁷ células/mL. Os volumes mínimos e máximos de suspensão celular são de 0,25 mL e 8 mL, respectivamente.
   2. Transfira até 8 mL (5 × 10⁷ células/mL) para um tubo estéril, polipropileno, fundo redondo com tampa.
   3. Adicione 50 μL/mL de Melhorador de Coquetéis aos PBMCs.
   4. Adicione 50 μL/mL de Coquetel de Isolamento aos PBMCs, tampa o tubo e inverta 2-3 vezes para misturar.
   5. Incubar na RT por 5 min; no^4º minuto de incubação, microesferas magnéticas de vórtice por pelo menos 30 s.
   6. Transfira 50 μL de microesferas magnéticas por 1 mL de PBMCs, tampa o tubo e inverta 2-3 vezes para misturar.
   7. Cubra até 10 mL com tampão de isolamento e pipeta suavemente para cima e para baixo 2-3 vezes.
   8. Coloque o tubo em uma estação magnética e incubar em RT por 3 minutos.
   9. Segure o ímã e o tubo juntos, e em um movimento, inverta o ímã e o tubo juntos para despejar a suspensão celular no novo tubo. Descarte o tubo velho.
   10. Repita o passo 4.2.8 (reduza o tempo de incubação para 2 min) e despeje a suspensão da célula B em um tubo cônico limpo.
   11. As células B enriquecidas estão prontas para uso. Se as células forem usadas imediatamente, continue a seção 4.3 (expansão de células B humanas). Verifique a pureza das células B isoladas por citometria de fluxo (opcional). Se as células forem congeladas antes do uso, continue a etapa 4.2.12.
   12. Para congelar as células B, centrífuga a 400 × g por 5 min, e descartar o supernatante sem perturbar a pelota.
   13. Resuspenque as células em meio de congelamento a 10⁷ células/mL, e aliquot 1 mL/criovial.
   14. Coloque o criovial no recipiente de congelamento refrigerado e armazene a -80 °C durante a noite; em seguida, transfira o criovial congelado para um tanque de nitrogênio líquido; manter células congeladas até 1 ano.
       NOTA: O rendimento esperado das células B isoladas é de 2%a 8% do total de PBMCs, com viabilidade de 95%-99%.
3. Expansão de células B humanas
   NOTA: Se usar células B recém-isoladas, pule as etapas 4.3.1-4.3.5. Conte as células e transfira o número necessário de células para um tubo cônico estéril e continue com a etapa 4.3.6.
   1. Soro bovino fetal pré-quente (FBS) em um banho de água antes de descongelar as células B. Prepare 20 mL de meio de expansão de células B, transfira para um frasco T25 e pré-equilibre o meio em uma incubadora de cultura tecidual (a 37 °C, 5% CO₂, com umidade) pelo menos 15 minutos antes do uso.
   2. Descongele as células B em um banho de água de 37 °C. Enquanto estiver esperando, transfira 2 mL de FBS pré-aquecidos em um tubo cônico estéril de 15 mL.
   3. Depois que as células B forem completamente descongeladas, adicione imediatamente 1 mL de FBS pré-aquecido, em termos de gota, na amostra. Incubar na RT por 1 min.
   4. Pipeta suavemente para resuspengar a amostra e transferir todo o volume, dropwise, em um tubo cônico contendo 2 mL de FBS pré-aquecidos.
   5. Elete o volume até 15 mL com 1x PBS estéril, tampa e inverta o tubo suavemente 2-3 vezes.
   6. Centrífuga a 400 × g por 5 min.
   7. Descarte o supernasce sem perturbar a pelota celular, resuspenque a pelota celular com 1 mL de meio de expansão pré-equilibrada de células B e conte as células. O número total de células deve ser de aproximadamente 107 células.
   8. Transfira as células para um frasco contendo 20 mL do meio de expansão pré-equilibrado da célula B. A concentração final das células deve ser de aproximadamente 5 x 10⁵ células/mL.
   9. Incubar o frasco verticalmente em uma incubadora de cultura tecidual.
   10. Atualize completamente o meio de expansão a cada 2 dias, transferindo todo o volume de células B para um tubo cônico estéril e repetindo etapas 4.3.6-4.3.9.
       NOTA: O frasco T25 pode conter de 10 a 20 mL de médio; O frasco T75 pode conter até 20-60 mL de médio.

5. Engenharia primária de células B humanas

1. Células B do engenheiro a 48 ± 2 h após a expansão/ativação para obter resultados ideais. Prepare o meio de expansão de células B, alíquota de 1 mL do meio em uma placa de cultura tecidual de 48 poços e pré-equilíbrio em uma incubadora de cultura tecidual pelo menos 15 minutos antes do uso.
   NOTA: Ao projetar um sgRNA CRISPR/Cas9 para um gene de interesse, siga os passos descritos abaixo.
   - Projetar sgRNAs usando uma ferramenta online¹¹.
   - Projetar sgRNAs em um exon que é comum a todos os isoforms da proteína.
   - Encomendar sgRNA quimicamente modificado de empresas respeitáveis.
   - sgRNA geralmente vem em forma liofilizada; sgRNA reconstituído no tampão Tris-EDTA (TE) livre de estéril DNase/RNase a uma concentração de 1 μg/μL.
2. Prepare o substrato transfetante CRISPR/Cas9 misturando 1 μL (1 μg/μL) de sgRNA quimicamente modificado com 1,5 μL (1 μg/μL) de nuclease streptococcus pyogenes cas 9 (S.p. Cas9) quimicamente modificada por reação de transfecção. Para controle, use 1 μL de tampão TE em vez de sgRNA.
   NOTA: Quando o sgRNA CD19 for usado para um experimento ko genético, consulte a Figura 2 para obter resultados. Quando o SgRNA AAVS1 é usado para um experimento de GENE KI, consulte a Figura 5 para obter resultados.
   • Mantenha todos os componentes no gelo.
3. Misture suavemente e transfira 2,5 μL de substrato transfectante CRISPR/Cas9 por reação em um tubo de uma tira de 0,2 mL de 8 tubos; reservado em RT.
4. Ligue um nucleofector (eletroporador) e prepare reagentes de transfecção, conforme mostrado na Tabela 1.
   NOTA: Este é um bom passo para uma pausa, se necessário, colocando todos os reagentes no gelo. Remova todos os reagentes do gelo quando estiver pronto para retomar o experimento. Ao usar a proteína S.p. Cas9, o pesquisador deve pré-complexo CRISPR/Cas9-sgRNA ribonucleoprotein misturando 1 μg sgRNA com 5 μg de proteína S.p. Cas9, evitando quaisquer bolhas, e incubando a mistura no RT por pelo menos 20 minutos antes de usar para resultados ideais.
5. Conte e transfira 10⁶ células B por reação de transfecção em um tubo cônico estéril.
6. Eleça o volume até 15 mL com 1x PBS estéril e centrífuga a 400 × g por 5 min. Enquanto estiver esperando, prepare o reagente de transfecção celular primária(Tabela 2) e reserve no RT.
7. Descarte o supernatante sem perturbar a pelota celular.
8. Resuspenque a pelota celular com 10 mL de PBS estéril 1x e centrífuga a 400 × g por 5 min.
9. Descarte o supernatante completamente sem perturbar a pelota celular.
10. Transfira 0,5 μg de MRNA GFP quimicamente modificado (como repórter de transfecção) por 10⁶ células B para a pelota celular (opcional).
11. Resuspend a pelota celular com reagente de transfecção celular primária de 20 μL por 10⁶ células B; misture suavemente por pipetar 5-6 vezes. Transfira 20,5 μL por reação de transfecção para o tubo de 0,2 mL da tira de 8 tubos contendo 2,5 μL do substrato de transfecção CRISPR/Cas9.
12. Pipeta para cima e para baixo uma vez para misturar e transferir todo o volume (23 μL) em uma cuvette de transfecção. Cape e toque o cuvette no banco suavemente para garantir que o líquido cubra a parte inferior da cuvette.
13. Use o protocolo de células B primárias humanas no nucleofector para transfecção.
    NOTA: O nucleofector (eletroporador) pode ser colocado e ser usado fora da capa da cultura tecidual. Tampe a cuvette para garantir a esterilidade.
14. Descanse as células eletroporadas na cuvette em RT por 15 minutos.
15. Transfira 80 μL do meio de expansão pré-equilibrada da célula B da placa de cultura tecidual para a reação de transfecção no cuvette. Coloque a cuvette na incubadora de cultura tecidual por 30 minutos.
16. Pipeta suavemente algumas vezes para misturar e transferir todo o volume da amostra da cuvette para um poço apropriado de uma placa de cultura tecidual de 48 poços contendo 1 mL do meio de expansão de células B. A concentração final das células deve ser de 10⁶ células/mL.
17. Se realizar um experimento de GENE KI, transfira o vetor rAAV6 a 500.000 multiplicidade de infecção para o poço adequado contendo células eletroporadas (aproximadamente 45 min pós-eletroporação). Veja o exemplo rAAV6 vetor construto na Figura 4A.
    NOTA: Por exemplo: Uma amostra de controle será eletroporada sem o vetor CRISPR/Cas9 ou o vetor rAAV6. Uma amostra somente vetorial será eletroporada sem CRISPR/Cas9 e, em seguida, será transduzida com o vetor rAAV6. Uma amostra KI será eletroporada com CRISPR/Cas9 e, em seguida, será transduzida com o vetor rAAV6. rAAV6 deve conter braços de emologia para cima e para baixo do site DSB direcionado para HDR.
18. Coloque a placa em uma incubadora de cultura tecidual a 37 °C e 5% de CO₂ com umidade.
19. Conte as células e regise viabilidade no primeiro dia pós-engenharia.
20. Atualize o meio de expansão de células B a cada 2 dias contando as células e, em seguida, transferindo todo o volume das células para um tubo de microcentrifuge limpo de 1,5 mL. Centrifugar a 400 × g por 5 min, e descartar o supernasce sem perturbar a pelota. Resuspenque as células com 100 μL de meio de expansão de células B frescos, e transfira para um poço de uma placa de cultura tecidual de 24 poços. Levante o volume médio para alcançar uma concentração celular final em 5 × 10⁵ células/mL.
    NOTA: Uma placa de 48 poços pode conter até 1 mL médio/bem; uma placa de 24 poços pode conter até 2 mL médio/bem; uma placa de 12 poços pode conter até 4 mL médio/bem, e uma placa de 6 poços pode conter até 8 mL médio/bem.
21. Permita que as células projetadas se expandam por pelo menos 5 dias antes de realizar análises a jusante, como para análise de citometria de fluxo, análise de MARÉ e PCR de junção.

Resultados

O protocolo atualizado de expansão e ativação possibilitou a rápida expansão das células B em até 44 vezes em 7 dias(Figura 1; n =3 doadores). No experimento ko, a contagem de células B usando coloração azul Trypan mostrou mais de 80% de células viáveis com uma ligeira redução na recuperação celular tanto no controle quanto nas amostras de KO CD19 a 24 h pós-eletroporação(Figura 2A; p ≥ 0,05, n = 3 doadores). Este resultado indica que a elet...

Discussão

A engenharia precisa do genoma em células B humanas primárias tem sido desafiadora até recentemente^9,10. Já havia publicado protocolos usando o CRISPR/Cas9 para projetar células B humanas primárias⁹. Aqui, delineamos protocolos aprimorados para isolamento, expansão e engenharia de células B para permitir ko eficiente de CD19 ou para bater-in EGFP.

Aqui demonstramos que nosso protocolo de expans?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug	IDT	1081059	smaller size is also available
Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT)	Lonza	V4XP-3032
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer	Quality Biological	118-156-101
CleanCap chemically modified Cas9 mRNA	Trilink Biotechnology	L-7206-1000
CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg	Invivogen	TLRL-2006-5	different sizes available
Cryostor CS10, 100 mL	STEMCELL Technology	7930
CTS Immune Cell SR	Thermo Fisher Scientific	A2596101
EasySep human B cells isolation kit	STEMCELL Technology	17954
eBioscience fixable viability dye eFlour 780	eBiosciences	65-0865-14
Excellerate B cell media, Xeno-free	R&D Systems	CCM031	B-cell basal medium
Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube	Corning	352059
Fetal Bovine Serum (FBS)	R&D Systems	S11550	For thawing B cells only
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03
GeneMate SnapStrip® 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps	BioExpress	T-3035-1 / 490003-692
Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS	GE lifesciences	SH30256.01
Lonza 4D Nucleofector core unit	Lonza	AAF-1002B
Lonza 4D Nucleofector X unit	Lonza	AAF-1002X
Mega CD40 Ligand	Enzo Life Sciences	ALX-522-110-C010
Mr. Frosty	Sigma-Aldrich	C1562-1EA	For freezing cells
Pen/Strep 100X	Sigma-Aldrich	TMS-AB2-C
PerCP anti-human CD19 clone HIB19	biolegend	302228	smaller size is also available
rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.)	Vigene Biosciences	N/A	large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL
Recombinant human IL-10 protein 250 ug	R&D Systems	217-IL-250	different sizes available
Recombinant human IL-15 protein 25 ug	R&D Systems	247-ILB-025	different sizes available
The Big Easy EasySep Magnet	STEMCELL Technology	18001	different sizes available
Tris-EDTA (TE) buffer	Fisher Scientific	BP2476100