JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكول تشريح مطلوب لتصوير الغدد التناسلية الذكرية ذبابة الفاكهة الجنينية المتأخرة . سيسمح هذا البروتوكول بمراقبة العمليات الخلوية الديناميكية في ظل الظروف العادية أو بعد التلاعب المعدل وراثيا أو الدوائي.

Abstract

يعد الغدد التناسلية الجنينية الذكرية ذبابة الفاكهة نموذجا مفيدا لدراسة الجوانب المختلفة لعلم الأحياء التنموي بما في ذلك ، على سبيل المثال لا الحصر ، تطور الخلايا الجرثومية ، وبيولوجيا piRNA ، وتكوين المتخصصة. هنا ، نقدم تقنية تشريح للتصوير الحي للغدد التناسلية خارج الجسم الحي خلال فترة يكون فيها التصوير الحي في الجسم الحي غير فعال للغاية. يحدد هذا البروتوكول كيفية نقل الأجنة إلى طبق تصوير، واختيار الأجنة الذكرية ذات المراحل المناسبة، وتشريح الغدد التناسلية من الأنسجة المحيطة بها مع الحفاظ على سلامتها الهيكلية. بعد التشريح ، يمكن تصوير الغدد التناسلية باستخدام مجهر متحد البؤرة لتصور العمليات الخلوية الديناميكية. يتطلب إجراء التشريح توقيتا دقيقا وبراعة ، لكننا نقدم نظرة ثاقبة حول كيفية منع الأخطاء الشائعة وكيفية التغلب على هذه التحديات. على حد علمنا ، هذا هو أول بروتوكول تشريح للغدد التناسلية الجنينية ذبابة الفاكهة ، وسوف يسمح بالتصوير الحي خلال نافذة زمنية يتعذر الوصول إليها بخلاف ذلك. يمكن دمج هذه التقنية مع التلاعب الدوائي أو الخلوي المحدد المعدل وراثيا لدراسة أي عمليات ديناميكية تحدث داخل أو بين الخلايا في بيئتها التناسلية الطبيعية.

Introduction

وقد خدم الخصية ذبابة الفاكهة melanogaster كنموذج لفهمنا للعديد من العمليات الخلوية الديناميكية. وقد ألقت الدراسات التي أجريت على هذا النموذج الضوء على تنظيم انقسام الخلايا الجذعية1،2،3 ، وتطوير الخلايا الجرثومية4،5 ، وبيولوجيا piRNA6،7،8 ، وأحداث إشارات الخلايا الجذعية المتخصصة9،10،11،12،13. هذا النموذج مفيد لأنه قابل للسحب وراثيا14,15 وهو واحد من القلائل الذين يمكننا من خلالها تصوير الخلايا الجذعية الحية في بيئتهم الطبيعية3,16,17,18. ومع ذلك ، فقد اقتصر التصوير الحي لهذا النموذج على الأنسجة البالغة والمراحل الجنينية المبكرة ، مما ترك فجوة في معرفتنا بديناميكيات الغدد التناسلية في الجنين المتأخر ، وهي المرحلة الدقيقة التي يتشكل فيها المكان لأول مرة ويبدأ في العمل.

الغدد التناسلية الجنينية في المرحلة المتأخرة هي كرة ، تتكون من خلايا متخصصة جسدية في الأمام ، وخلايا جرثومية تنشرها خلايا الغدد التناسلية الجسدية في جميع أنحاء المناطق الخلفية19. يمكن تصوير هذا العضو حيا في الجسم الحي حتى المرحلة الجنينية المبكرة 1717،20،21. يتم منع المزيد من التصوير بسبب بدء تقلصات العضلات على نطاق واسع. هذه الانقباضات شديدة لدرجة أنها تدفع الغدد التناسلية خارج إطار التصوير ، ولا يمكن تصحيح هذه الحركة باستخدام برنامج التصوير. يهتم مختبرنا بالكشف عن آليات التكوين المتخصصة ، والتي تحدث خلال هذه الفترة المراوغة للتصوير الحي. لذلك ، أنشأنا نهجا خارج الجسم الحي للتصوير الحي للغدد التناسلية بدءا من المرحلة الجنينية 16 ، مما يسهل دراسة ديناميكيات الخلية خلال هذه الفترة الحاسمة من تطور الغدد التناسلية. يظهر العمل السابق من مختبرنا أن هذا التصوير خارج الجسم الحي يلخص بأمانة في تطوير الغدد التناسلية في الجسم الحي 17. هذه التقنية هي الأولى والوحيدة من نوعها للغدد التناسلية الجنينية ذبابة الفاكهة .

هنا ، نقدم بروتوكول التشريح المطلوب للتصوير الحي خارج الجسم الحي للغدد التناسلية خلال المراحل الجنينية المتأخرة. يمكن دمج هذا البروتوكول مع العلاجات الدوائية ، أو التلاعب المعدل وراثيا لسلالات خلايا محددة داخل الغدد التناسلية. باستخدام هذه التقنية ، نجحنا في تصوير خطوات تكوين الخلايا الجذعية المتخصصة17. وبالتالي ، فإن نهج التصوير هذا مفيد في مجال بيولوجيا الخلايا الجذعية ، لأنه سيمكن من تصور المراحل الأولية من تكوين المتخصصة في الوقت الفعلي داخل بيئتها الطبيعية15,17. في حين أن هذه الطريقة مفيدة لمجال بيولوجيا الخلايا الجذعية ، إلا أنها قابلة للتطبيق أيضا لتصور أي عمليات ديناميكية تحدث في الغدد التناسلية خلال هذه النقطة الزمنية التنموية ، بما في ذلك إعادة الترتيب الخلوي 22 ، والتصاق الخلايا2،12،23 ، وهجرة الخلايا 23. وبالتالي فإن بروتوكول التشريح هذا سيعزز فهمنا للعديد من العمليات البيولوجية الأساسية للخلايا.

Protocol

1. إعداد اليوم السابق للتشريح

  1. شحذ كهربائيا إبرة التنغستن24 بحيث يكون القطر الناتج حوالي 0.03 ملم. اضبط الجهد الكهربائي المزود إلى 14 فولت تقريبا، واستخدم 3.3 مليون نيوتن كهربائي. يجب ألا يستغرق الشحذ أكثر من 1 أو 2 دقيقة.
    تحذير: NaOH شديد التآكل وسيسبب حروقا عند ملامسة الجلد. ارتداء القفازات والنظارات الواقية أثناء التعامل ، والعمل داخل غطاء الدخان.
    ملاحظة: بعد الاستخدام ، قم بتخزين NaOH في أنبوب صقر من البولي بروبيلين.
  2. اصنع وسائط التصوير المعدة. في أنبوب مخروطي 15 مل ، اجمع 4.25 مل من وسائط شنايدر مع 750 ميكرولتر من مصل البقر الجنيني (FBS ، تركيز نهائي 15٪) و 27.5 ميكرولتر من البنسلين - ستربتومايسين (0.05 U / μL من البنسلين ، 0.05 ميكروغرام / ميكرولتر التركيز النهائي). قم بتخزين وسائط التصوير المعدة هذه على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  3. جعل محلول الهيبتان الغراء. أضف حوالي 0.5 مل من السباتان إلى قارورة قابلة للإغلاق سعة 20 مل محشوة بشريط على الوجهين يبلغ طوله حوالي 20 سم. صخر على المغذيات لمدة ساعة تقريبا ، أو حرك بطرف ماصة حتى يتم تحقيق اتساق بين الماء والجلسرين. سيستمر هذا المحلول من الغراء المذاب لعدة أيام قبل أن يتبخر الهيبتان. لإنعاش المحلول ، أضف 0.5 مل هيبتان إضافي ، وصخور.
    ملاحظة: يمكن تحضير محلول فعال من غراء الهيبتان باستخدام نسب مختلفة من الهيبتان إلى الشريط ، بالإضافة إلى فترات مختلفة من الهزاز / التحريك. المواصفات المذكورة أعلاه هي مجرد اقتراحات لإعداد أو تحديث أحد هذه الحلول المناسبة.

2. جمع الأجنة - 15-17 ساعة قبل التشريح

  1. أضف معجون الخميرة الطازج إلى طبق أجار عصير التفاح25. قم بإعداد قفص لجمع الأجنة عن طريق إضافة ذباب بالغ (أقل من 10 أيام) إلى زجاجة طعام فارغة ، مثقوبة بثقوب صغيرة26. قم بتغطية قفص التجميع باستخدام لوحة الآجار المخمرة ، والمسجلة على الزجاجة ، وضع القفص مع جانب اللوحة لأسفل في حاضنة داكنة 25 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    ملاحظة: يجب أن يعبر الذباب عن جين متحول من شأنه أن يميز الغدد التناسلية بشكل فلوري ، على سبيل المثال ، six4-eGFP::Moesin20 ، لأن تشريح الأجنة سيحدث تحت مجهر ستيريو فلورسنت. انظر جدول المواد للحصول على قائمة بالأنماط الجينية المستخدمة لوضع علامة على الغدد التناسلية.
  2. قم بإزالة القفص من الحاضنة وتخلص من هذه المجموعة الأولى. استبدله بطبق أجار مخمر طازج وضع القفص مرة أخرى في الحاضنة لمدة 2 ساعة.
    ملاحظة: يتم استخدام أول مجموعة أجنة لتطهير الإناث من الأجنة المخصبة النامية ، لتحقيق مجموعة ثانية من الأجنة في الوقت المناسب بإحكام.
  3. قم بإزالة صفيحة الأجار من القفص وضعها (مع توجيه الجانب المخمر لأعلى) على منشفة ورقية رطبة داخل حاوية بلاستيكية قابلة للإغلاق. ضع هذه الغرفة الرطبة في حاضنة 25 درجة مئوية لعمر الأجنة لمدة 14.5 ساعة (الأعمار النهائية ، 14.5-16.5 ساعة بعد وضع البيض).
    ملاحظة: مباشرة قبل بدء الخطوة 2.4، أكمل الخطوتين 3.1 و3.2.
  4. قم بإزالة صفيحة الأجار من الحاضنة ، وباستخدام زجاجة بخاخ ، أضف ما يكفي من الماء إلى صفيحة الأجار لإذابة معجون الخميرة عن طريق تنظيف الأسنان بفرشاة الطلاء برفق. شطف الأجنة والخميرة المذابة في سلة شاشة شبكية صغيرة تجلس داخل قارب الوزن. اشطف السلة بزجاجة رش الماء حتى يتم ترشيح معظم عجينة الخميرة من خلال الشبكة.
  5. قم بإزالة الماء من قارب الوزن ووضع السلة مرة أخرى في الداخل. قم بإزالة الأجنة عن طريق غمرها في محلول تبييض بنسبة 50٪ ، باستخدام زجاجة بخاخ. يجب أن يكون عمق محلول التبييض 3-5 مم. حافظ على الأجنة مغمورة في المبيض لمدة 2 دقيقة تقريبا ، مع دوامة عرضية.
    تحذير: المبيض قابل للتآكل ويمكن أن يهيج أو يتلف العينين والجهاز التنفسي. ارتداء القفازات والنظارات الواقية أثناء التعامل مع التبييض.
    ملاحظة: خلال هذا الوقت، أكمل قدر الإمكان من الخطوة 3.3. يمكن التحقق من تقدم الانحراف عن طريق وضع السلة تحت مجهر ستيريو والتحقق من عدم وجود الزوائد الظهرية. غمر الأجنة في محلول التبييض لفترة إضافية ، إذا لزم الأمر.
  6. تخلص من المبيض ، واشطف الأجنة جيدا داخل السلة بالماء من زجاجة بخاخ (لمدة ~ 3 ثوان ، ونشف السلة الشبكية بمناشف ورقية ؛ كرر 2-3 مرات).

3. إعداد يوم التشريح

  1. أضف 30 ميكرولتر من الأنسولين (10 ملغم/مل) إلى 1500 ميكرولتر من وسائط التصوير المحضرة (انظر الخطوة 1.2) في أنبوب إبندورف سعة 1.5 مل (التركيز النهائي 0.2 ملغم/مل). اخلطي جيدا واتركي الأنبوب على سطح الطاولة لتحقيق التوازن مع درجة حرارة الغرفة.
  2. إعداد شرائط coverslip المغلفة بالغراء.
    1. استخدم سكينا برأس ماسي لقطع غطاء مقاس 22 مم × 22 مم إلى أربعة شرائط متساوية الحجم (الشكل 1A).
    2. استخدم الملقط لالتقاط شريط واحد ونشر ما مجموعه حوالي 30 ميكرولتر من محلول غراء الهيبتان على جانبي الشريط (الشكل 1B). لتحقيق طبقة متساوية من بقايا الغراء ، قم بإمالة الشريط بزوايا مختلفة بينما يتبخر الهيبتان.
    3. تخزين الشريط المغطى بالغراء في فتحة فارغة من صندوق coverslip ؛ للحفاظ على لزوجته، ضع الشريط في وضع مائل، ولكن في وضع مستقيم، متكئا على حواف الصندوق لتقليل التلامس مع أسطح الصندوق (الشكل 1C). أغلق الصندوق حتى لا تغطي الجسيمات الموجودة في الهواء الغراء وتقلل من لزوجته.
  3. ضع العناصر التالية على سطح الطاولة: ماصة باستور زجاجية مقاس 6 بوصات ، وشريحة مجهرية ، وماصة P200 و P1000 مع أطراف الماصة المناسبة ، ومحلول Ringer27 (درجة الحموضة المعدلة إلى 7.3 مع NaOH) ، وطبق تصوير 35 مم مغلف ب Poly-D-Lysine.
  4. انقل الأجنة من سلة الشاشة الشبكية إلى زجاج ساعة صغير مملوء بالهيبتان 500-750 ميكرولتر.
    1. تجفف جوانب السلة وأسفلها بمسح المنديل. بلل فرشاة الطلاء في الهيبتان ، ولمس فرشاة الطلاء للأجنة (يجب أن يلتصق غشاء الفيتيلين الكارهة للماء بالشعيرات) ، واغمس فرشاة الطلاء مرة أخرى في الهيبتان في زجاج الساعة (يجب أن تغرق الأجنة إلى القاع).
      ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات التالية في أسرع وقت ممكن لمنع الأجنة من الجفاف. يجب ألا تتعرض الأجنة للهواء لأكثر من 20 ثانية.
  5. انقل الأجنة إلى شريحة المجهر باستخدام ماصة باستور (الشكل 1D). اسحب الأجنة إلى الماصة ببطء وقصرها على الجزء الضيق من الماصة. أجنة الماصة على الشريحة ببطء، بحيث تتجمع داخل طرف الماصة مباشرة قبل أن تتدفق على الشريحة. قم بلف زاوية الأنسجة وامسحها إلى طرف ناعم ، وابتعد الهيبتان عن الأجنة الموجودة على الشريحة. سوف تتجمع وتغطي مساحة أصغر ، مما يجعل من السهل التقاطها على شريط مغطى بالغراء في الخطوة التالية.
  6. باستخدام الملقط ، التقط شريطا مغطى بالغراء ، ولمسه بلطف على الأجنة (الشكل 1E). ضع الشريط في طبق التصوير ، جانب الجنين ، وخارج المركز المطلي بالبولي دي ليسين مباشرة. اضغط على الشريط على الطبق باستخدام الملقط ، لضمان تثبيته في مكانه. إغراق الطبق على الفور بمحلول 2-3.5 مل من Ringer ؛ غمر الأجنة أولا لمنعها من الجفاف (الشكل 1F).

4. تشريح

ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوات تحت مجهر ستيريو فلورسنت.

  1. Devitellinize 10-15 الأجنة.
    ملاحظة: قد يتراوح هذا من جنينين ، للمبتدئين ، إلى خمسة عشر جنينا ، للخبراء.
    1. حدد أجنة المرحلة 16 بناء على مورفولوجيا الأمعاء (الشكل 2). في هذه المرحلة ، يكون للأجنة ثلاثة انقباضات في الأمعاء تخلق أربعة أجزاء من الأمعاء مكدسة (الشكل 2 B ، B'). لبدء إزالة التلفظ ، اخترق الجنين المختار في نهاية واحدة ، ويفضل أن يكون الأمامي ، بإبرة التنغستن. قد يخرج الجنين من غشاء الفيتيلين ، ولكن إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بتقشير الغشاء من الجنين.
      ملاحظة: الأجنة التي هي أصغر من أن تشريح لديها أمعاء غير إقليمية (الشكل 2C). تشريح أجنة المرحلة 17 ممكن ، ولكنه أكثر تحديا من تشريح أجنة المرحلة 16 لأن البشرة بدأت تتطور في هذه المرحلة. توجد أجنة المرحلة المبكرة 17 مع أربعة أجزاء من الأمعاء يتم نقلها بالنسبة لبعضها البعض (الشكل 2 D ، D').
    2. ربط الإبرة من خلال الجنين في منطقة بعيدة عن الغدد التناسلية. انقل الجنين المدمن على المخدرات إلى المنطقة المطلية بالبولي ليسين في الطبق (من هنا فصاعدا يشار إليها ببساطة باسم "زلة الغطاء") واسحبه إلى الأسفل حتى يلتصق. كرر هذه الخطوات، ورتب الأجنة المنزوعة الانحراف على التوالي على طول الجزء العلوي من زلة الغطاء المطلية بالبولي ليسين (الشكل 3A)، مع ترك مساحة كبيرة أدناه لمزيد من التشريح.
      ملاحظة: تظهر الغدد التناسلية على شكل مجاميع كروية صغيرة من الخلايا التي يجب أن تتألق بشكل ساطع ، اعتمادا على العلامة المحددة المستخدمة وعدد نسخ الجينات المحورة. في هذه المرحلة ، توجد الغدد التناسلية أفقيا في الجزء A5 ، عند حوالي 70٪ -80٪ من طول الجنين من الأمام. خلال بروتوكول التشريح ، قد تلتصق الأنسجة بالإبرة. لتخليص الإبرة من الحطام ، ارفعها فوق سطح محلول Ringer مباشرة. يمكن أن يكون Devitellinization غير مرتب طالما أن الغدد التناسلية المناسبة منزعجة بأقل قدر ممكن.
  2. قم بإخراج الغدد التناسلية من الجنين إلى الطبق (الشكل 3C ، D).
    1. أولا ، قم بفيليه الجنين لفضح داخله (الشكل 3C). شريحة من خلال الجنين من مركزه ، وتحريك الإبرة في الخلف ، بين الغدد التناسلية. قم بإخراج بعض الأنسجة الداخلية ، لأن هذا سوف يلتصق بالطبق بشكل أفضل بكثير من البشرة الخارجية. سيمكن التصاق الأنسجة من التلاعب التالي من الكشف عن الغدد التناسلية والسماح لها بالالتصاق بزلة الغطاء.
      ملاحظة: إذا لم تلتصق الأنسجة بالطبق، فحاول إقناعها بمنطقة غير ملوثة من الغطاء المطلي. ستكون المناطق الخارجية من زلة الغطاء لزجة بشكل خاص. كما هو مذكور في الخطوة 4.1.2 ، لا يهم ما إذا كانت عمليات التلاعب بالتشريح تؤدي إلى جثة جنينية مشوهة ، طالما بقيت الغدد التناسلية سالمة.
    2. استخدم الإبرة لتقطيع حول الغدد التناسلية حتى يتم فصل قطعة من الأنسجة ، بما في ذلك الغدد التناسلية ، عن الذبيحة المتبقية. باستخدام الإبرة ، اسحب هذا النسيج إلى منطقة جديدة من الغطاء المطلي ، وأقنعه بالقاع حتى يلتصق بالطبق.
      ملاحظة: سيتم تحقيق أفضل تصوير لتلك الحالات التي تعلق فيها الغدد التناسلية نفسها مباشرة على زلة الغطاء ، بدلا من التعلق غير المباشر عبر الأنسجة الفوقية. لذلك ، عندما يتم توجيه الأنسجة بعيدا عن الذبيحة ، حاول أن تجعل الغدد التناسلية تلمس الغطاء تنزلق أولا ، بدلا من الأنسجة الدخيلة.
    3. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الأنسجة المحيطة من الغدد التناسلية (الشكل 3D) عن طريق سحب الأنسجة الملتصقة بلطف بعيدا عن الغدد التناسلية باستخدام الإبرة. تجنب لمس الغدد التناسلية مباشرة ، مما قد يؤدي إلى إتلافها (الشكل 4E). لضمان التصاق الغدد التناسلية بما فيه الكفاية بالطبق، حرك الإبرة في حركة دائرية لطيفة حول الغدد التناسلية - إذا تحركت، المس الإبرة إلى الأنسجة الملتصقة المتبقية، ووجه الغدد التناسلية نحو منطقة جديدة من الغطاء اللزج. كرر هذه العملية حتى لا تكون هناك حركة يمكن اكتشافها للغدد التناسلية.
    4. العودة إلى جثة الجنين وتشريح الغدد التناسلية الثانية. كرر هذه العملية على أكبر عدد ممكن من الأجنة ولكن لا تتجاوز 25 دقيقة. سيتم اختراق صلاحية الأنسجة في محلول Ringer بعد أكثر من 40-45 دقيقة.
  3. بعد اكتمال التشريح ، استخدم علامة لا تمحى لإضافة علامات تسجيل إلى الحافة الخارجية لطبق التصوير لتسجيل اتجاهه أثناء التشريح.
  4. قم بإزالة الشريط المطلي بالغراء من الطبق.
    1. أدخل بلطف الشق السفلي لزوج من الملقط أسفل الشريط ، وقم بتثبيته وإمالة الشريط ببطء لأعلى لتحريره من الطبق بأقل قدر ممكن من الانزلاق لمحلول الرنين لتقليل اضطراب الغدد التناسلية الملتصقة.
      ملاحظة: يجب إمالة الشريط بعيدا عن الغدد التناسلية التي تم تشريحها.
  5. احمل الطبق برفق إلى المجهر التصويري بطريقة تتجنب انزلاق محلول رينجر.

5. التصوير

  1. ضع طبق التصوير في حامل المسرح ، باستخدام علامات التسجيل لوضع الطبق في الاتجاه التقريبي أثناء التشريح. باستخدام المجهر الساطع وهدف منخفض الطاقة (~ 10x) ، حدد وركز على أي قطعة من الأنسجة التي يتم الالتزام بها في زلة الغطاء. قم بتبديل إعدادات العدسة للكشف عن التألق ، وباستخدام النظارات ثنائية المنظار ، قم بمسح الطبق ضوئيا بشكل منهجي ، مع تحديد موضع كل غدد تناسلية داخل برنامج التصوير (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: تأكد من تمركز الغدد التناسلية في مجال الرؤية قبل وضع علامات على المراكز.
  2. قم بإزالة مجموعة حامل المسرح بالكامل برفق ، مع وضع طبق التصوير في حاملها ، وضع التجميع على طاولة العمل.
  3. استبدل محلول Ringer بوسائط التصوير المعدة التي تحتوي على الأنسولين (انظر الخطوتين 1.2 و3.1).
    1. استخدم P1000 لإزالة جميع حلول Ringer من الحافة العلوية الداخلية لطبق التصوير (لا تقم بماصة Ringer من منطقة انزلاق الغطاء المركزي). بعد ذلك ، قم بالتبديل إلى P200 ، ووضع طرفه تحت سطح Ringer المتبقي في المنطقة الوسطى. إزالة بعناية 50-100 ميكرولتر من رينجر. لا تقم بإزالة الحل بأكمله.
    2. ارسم ~ 200 ميكرولتر من وسائط التصوير ، ومرة أخرى ضع طرف P200 تحت سطح Ringer المتبقي ، وأضف وسائط التصوير هذه ببطء. بعد ذلك ، أضف وسائط التصوير المتبقية (~ 1300 ميكرولتر) إلى الطبق ، بدءا من الحافة الخارجية للحافة العليا. أثناء السحب ، تحرك نحو القبة المركزية للسائل ، وفي النهاية ادمج الاثنين عن طريق تنظيف طرف الماصة عبرهما. ضع الغطاء على الطبق.
      ملاحظة: يجب أن تغطي وسائط التصوير كامل القطر الداخلي للطبق، بعمق حوالي 2 مم، لمنع التبخر (الشكل 4D).
  4. قم بتبديل المجهر إلى هدف طاقة أعلى (63x ، 1.2 NA) ، وقم بتطبيق سائل الغمر المناسب بناء على الهدف المستخدم (نوع سائل الغمر ومعامل الانكسار الذي يتطلبه الهدف) ، ثم استبدل مجموعة حامل المرحلة. استخدم الفحص المجهري الساطع للتركيز على الأنسجة الملتصقة بالجزء السفلي من طبق التصوير.
    ملاحظة: إذا لم يتم نقل المرحلة ، فيجب أن تظهر الغدد التناسلية الأخيرة بمجرد تركيز الهدف.
  5. خطوة من خلال كل موضع الغدد التناسلية ملحوظ وضبط هذا الموقف ، حسب الضرورة. حدد الغدد التناسلية التي سيتم تصويرها بناء على وضوح الصورة وجنس الغدد التناسلية وما إلى ذلك. قم بتخصيص إعدادات التصوير (متعددة القنوات ، وأوقات التعرض ، وكثافة الليزر ، وزيادات السلسلة Z ، والفاصل الزمني مع الفواصل الزمنية المناسبة ، وما إلى ذلك). ابدأ التصوير.
    ملاحظة: يمكن التعرف على الغدد التناسلية الذكرية من خلال وجود كل من مكان ، وفي الطرف الآخر من الغدد التناسلية ، مجموعة من الخلايا الجسدية الصغيرة الدائرية للغاية تسمى السلائف التناسلية الجسدية الخاصة بالذكور (msSGPs). إذا تم استخدام علامة الفلورسنت six4-eGFP::moesin ، فإن الخلايا المتخصصة هي ثاني ألمع الخلايا في الغدد التناسلية ، وألمع الخلايا هي msSGPs. في هذه المرحلة ، لا تحتوي الغدد التناسلية الأنثوية على مكانة ولا msSGPs.

النتائج

نوضح إعداد طبق التصوير في الشكل 1 ، كما هو موضح في "إعداد يوم التشريح". يجب أن تؤدي هذه الطرق في النهاية إلى التصاق أجنة رطبة جيدا بشريط انزلاق الغطاء ، والذي يتم تثبيته مؤقتا في قاع الطبق وغمره في محلول رينجر (الشكل 1F). تسمح السكين ذات الرؤوس الماسية للمرء بتق?...

Discussion

أثناء تكوين الغدد التناسلية ، يخضع الغدد التناسلية الجنينية ، وخاصة مكانة الخلايا الجذعية داخل الغدد التناسلية الذكرية15 ، لتغيرات مورفولوجية سريعة. يتم فهم الآليات التنموية التي تكمن وراء هذه التغييرات الديناميكية بشكل أفضل من خلال تقنيات التصوير الحي. ومع ذلك ، في المرحلة ...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

ونود أن نشكر ليندسي دبليو بلاسخارت وجاستن سوي على إسهاماتهما الكبيرة في التطوير المبكر لهذا البروتوكول. المؤلفون ممتنون لمجتمع الذباب على كرمهم مع الكواشف ، وخاصة لروث ليمان وبنيامين لين على هديتهم لخط nos 5'-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' قبل نشره. تم استخدام المخزونات التي تم الحصول عليها من مركز بلومنغتون لذبابة الفاكهة (NIH P40OD018537) في هذه الدراسة. تم دعم هذا العمل من قبل NIH RO1 GM060804 و R33AG04791503 و R35GM136270 (S.D) بالإضافة إلى منح التدريب T32GM007229 (B.W.) و F32GM125123 (L.A).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Alfa Aesar Tungsten wireFisher ScientificAA10408G60.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis)
D. melanogaster: His2Av::mRFP1Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)FBtp0056035Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007
D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomatoGift from Ruth Lehmann LabLin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3'
D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::MoesinFBtp0083398Sano et al., PLoS One, 2012
Diamond-tipped knife
Double-sided tapeScotch665
Fetal Bovine SerumGIBCO10082
Imaging dishMatTekP35GC-1.5-14-C
Imaging softwareMolecular DevicesMetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0
Insulin, bovineSigmal0516Store aliquots at 4 °C
Needle holderFisher Scientific08-955
Nytex basket
Penicillin/streptomycinCorning30-002-Cl
Ringer's solution2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved
Schneider's Insect MediaGIBCO21720-024

References

  1. Yamashita, Y. M., Jones, D. L., Fuller, M. T. Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome. Science. 301, 1547-1550 (2003).
  2. Inaba, M., Yuan, H., Salzmann, V., Fuller, M. T., Yamashita, Y. M. E-Cadherin is required for centrosome and spindle orientation in Drosophila male germline stem cells. PLoS One. 5, 1-7 (2010).
  3. Lenhart, K. F., DiNardo, S. Somatic cell encystment promotes abscission in germline stem cells following a regulated block in cytokinesis. Developmental Cell. 34, 192-205 (2015).
  4. Hardy, R. W., Tokuyasu, K. T., Lindsley, D. L., Garavito, M. The Germinal Proliferation Center in the Testis of Drosophila melanogaster. Journal of Ultrastructure Research. 69, 180-190 (1979).
  5. Fuller, M. T., Bate, M., Arias, A. M. Spermatogenesis. The Development of Drosophila Melanogaster. , 71-147 (1993).
  6. Lin, H., Spradling, A. C. A novel group of pumilio mutations affects the asymmetric division of germline stem cells in the Drosophila ovary. Development. 124, 2463-2476 (1997).
  7. Emilie, Q., Amit, A., Kai, T. The piRNA pathway is developmentally regulated during spermatogenesis in Drosophila. RNA. 22, 1044-1054 (2016).
  8. Marie, P. P., Ronsseray, S., Boivin, A. From embryo to adult: PiRNA-mediated silencing throughout germline development in Drosophila. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7, 505-516 (2017).
  9. Michel, M., Raabe, I., Kupinski, A. P., Pérez-Palencia, R., Bökel, C. Local BMP receptor activation at adherens junctions in the Drosophila germline stem cell niche. Nature Communications. 2, (2011).
  10. Inaba, M., Buszczak, M., Yamashita, Y. M. Nanotubes mediate niche-stem-cell signalling in the Drosophila testis. Nature. 523, 329-332 (2015).
  11. Leatherman, J. L., Dinardo, S. Zfh-1 controls somatic stem cell self-renewal in the Drosophila testis and nonautonomously influences germline stem cell self-renewal. Cell Stem Cell. 3, 44-54 (2008).
  12. Leatherman, J. L., DiNardo, S. Germline self-renewal requires cyst stem cells, while stat regulates niche adhesion in Drosophila testes. Nature Cell Biology. 12, (2010).
  13. Tulina, N., Matunis, E. Control of stem cell self-renewal in Drosophila Spermatogenesis by JAK-STAT signaling. Science. 294, 2546-2549 (2001).
  14. Gonczy, P., Viswanathan, S., Dinardo, S. Probing spermatogenesis in Drosophila with P-element enhancer detectors. Development. 114, 89-98 (1992).
  15. Le Bras, S., Van Doren, M. Development of the male germline stem cell niche in Drosophila. Developmental Biology. 294, 92-103 (2006).
  16. Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse live imaging of stem cells in drosophila testis. Current Protocols in Stem Cell Biology. 0331, 1-9 (2009).
  17. Anllo, L., Plasschaert, L. W., Sui, J., DiNardo, S. Live imaging reveals hub cell assembly and compaction dynamics during morphogenesis of the Drosophila testis niche. Developmental Biology. 446, 102-118 (2019).
  18. Rebecca Sheng, X., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138, 3367-3376 (2011).
  19. Aboim, A. N. Developpement embryonnaire et post-embryonnaire des gonades normales et agametiques de Drosophila melanogaster. Revue Suisse De Zoologie. 52, 53 (1945).
  20. Sano, H., et al. The Drosophila actin regulator ENABLED regulates cell shape and orientation during gonad morphogenesis. PLoS One. 7, (2012).
  21. Clark, I. B. N., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration. BMC Devlopmental Biology. 7, 1-9 (2007).
  22. Sheng, X. R., Brawley, C. M., Matunis, E. L. Dedifferentiating spermatogonia outcompete somatic stem cells for niche occupancy in the Drosophila testis. Cell Stem Cell. 5, 191-203 (2009).
  23. Tanentzapf, G., Devenport, D., Godt, D., Brown, N. H. Europe PMC Funders Group integrin-dependent anchoring of a stem cell niche. Nature Cell Biology. 9, 1413-1418 (2007).
  24. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically a motorized molluscicide dispenser. Bulletin of the World Health Organization. , 105-106 (1960).
  25. Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).
  26. JoVE. Embryo and Larva Harvesting and Preparation. JoVE Science Education Database. , (2020).
  27. Cold Spring Harbor Protocols. Ringer's solution for Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. , (2011).
  28. Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into Centromeres during Early Embryonic Anaphase. Current Biology. 17, 237-243 (2007).
  29. Lin, B., Luo, J., Lehmann, R. Collectively stabilizing and orienting posterior migratory forces disperses cell clusters in vivo. Nature Communications. 11, 1-16 (2020).
  30. Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).
  31. Gabay, L., Lowell, S., Rubin, L. L., Anderson, D. J. Deregulation of dorsoventral patterning by FGF confers trilineage differentiation capacity on CNS stem cells in vitro. Neuron. 40, 485-499 (2003).
  32. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

164

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved